供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 100T/96S |
货号: | BES-2481BTK |
CAS号: |
乙酸激酶(ACK)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:临用前将试剂九加入到提取液中,并于 4℃保存;
2、 试剂二:临用前每瓶加入 1 mL 双蒸水,充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存;
3、 试剂三:临用前每瓶加入 1 mL 双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;
4、 试剂四:临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;
5、 试剂五:临用前每支加入 0.5 mL 双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;
6、 试剂六:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 43:457(V:V)的比例配制备用,现用现配;
7、 试剂七:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂七、蒸馏水按 1:9(V:V)的比例配制备用,现用现配;
8、 试剂八:临用前加入 5 mL 双蒸水,充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存;
9、 工作液:吸取 0.06 mL 试剂二、0.2 mL 试剂三、0.13 mL 试剂四、0.04 mL 试剂五、0.04 mL 试剂六、0.04mL 试剂七、0.2 mL 试剂八混匀,也可根据比例现用现配,于冰上备用。
产品说明:
ACK广泛存在于生物体内,催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP,是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶,尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
测定原理如下:(1)ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP,(2)丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸,(3)乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,(4)在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率,即可反映ACK活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或细胞处理:
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
2、组织处理:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆):直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温15min。
3、 操作表:
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英 96 孔板中,加样本的同时开始计时,在 340nm 波长下记录 20 秒 时的初始吸光度 A1,准确反应 3 分钟立刻 340 nm 下比色,记录 3 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA 测定=A 测定 1-A 测定 2,ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2,计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。
三、ACK活力计算
注意事项:
1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
2、 反应液的温度必须保持37℃或25℃,比色皿测定时可取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、 ΔA大于1时,建议稀释后测量,注意计算公式乘以稀释倍数;ΔA小于0.01时,建议延长反应时间测量,注意计算公式变化。
实验实例:
1、 取 0.1g 肾脏组织样本,加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A 测定 1-A 测定 2=1.7666-1.0488=0.7178,ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2=1.3902-1.3553=0.0349,ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.7178-0.0349=0.6829,按样本质量计算酶活得:
ACK(U/g 质量)=536×ΔA÷W=536×0.6829÷0.1=3660.344 U/g 质量。
2、 取 500 万大肠杆菌加入 1mL 提取液超声破碎,离心,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A测定1-A测定2=1.3965-1.3503=0.0462,ΔA空白=A空白1-A空白2=1.3902-1.3553=0.0349,ΔA=ΔA测定-ΔA 空白=0.0462-0.0349=0.0113,按细菌数量计算酶活得:
ACK(U/104 cell)=1.072×ΔA=1.072×0.0113=0.0121136 U/104 cell。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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