供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/24S |
货号: | BES-2554BTK |
CAS号: |
亚铁氧化酶(HP)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂三:临用前加入 7 mL 蒸馏水溶解备用,用不完的试剂 4℃保存;2-8℃保存 4 周。
2、标准品:9 μmol/mL 的亚铁离子标准液。
产品说明:
亚铁氧化酶(Hsphasetin,HP)是铜蓝蛋白的同系物,催化亚铁离子(Fe2+)氧化为三价铁离子(Fe3+),从 而三价铁与转铁蛋白结合,参与细胞铁释放。
以一定浓度的 Fe2+ 为底物,在亚铁氧化酶的催化作用下 Fe2+被氧化为 Fe3+,Fe2+与菲咯嗪形成有色复合物, 在 562 nm 处有特征吸收峰,先计算出未被氧化的 Fe2+ 的含量,进而得出被氧化的 Fe2+ 的含量,可通过 Fe2+ 被氧 化的速率来反映亚铁氧化酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照质量(g)︰蒸馏水体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g,加入 1 mL 蒸馏水)加入蒸馏水,冰浴匀浆后于 10000 rpm,4℃离心 10 min,取上清置于冰上待测。
2、血清或血浆:建议用蒸馏水将血清或血浆稀释 2~4 倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 562 nm,蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释:将 9 μmol/mL 的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为 360、180、90、45、22.5、11.25、5.625nmol/mL 的标准溶液备用。
3、 标准液稀释可参考下表:
备注:实验中每个标准管需 100μL 标准溶液。
4、 操作表:在 1.5 mL 离心管中依次加入下列试剂:
三、亚铁氧化酶活性计算
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度(nmol/mL)为 x 轴,其对应的ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y= kx+b, 将ΔA 测定带入方程得到样本浓度(x,nmol/mL)。
2、 亚铁氧化酶活性的计算:
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 蛋白每分钟氧化 1 nmol 的Fe2+定义为 1 个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活(U/mg prot)= x×V 试剂二÷(V 样×Cpr)÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
(2)按照样本质量计算
酶活定义:每 g 样品每分钟氧化 1 nmol 的Fe2+定义为 1 个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活(U/g 质量)= x×V 试剂二÷(V 样×W÷V 提取)÷T×N = 1.667x÷W×N
(3)按液体体积计算
酶活定义:每 mL 样本每分钟氧化 1 nmol 的Fe2+定义为 1 个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活(U/mL)= x×V 试剂二÷V 样÷T ×N= 1.667x×N
V 试剂二:加入的试剂二体积,0.1 mL;V 样:加入的样本体积,0.02 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:3 min;N:稀释倍数。
注意事项:
1、当 A 测定低于 0.1 时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。
实验实例:
1、 取 0.1g 脾脏,进行样本处理,按照测定操作步骤,测得计算ΔA 测定=(A 无基质管-A 空白管)-(A 测定管-A 对照管)=(0.976-0.005)-(0.996-0.047)=0.022,带入标准曲线 y = 0.0027x + 0.0036,计算 x=6.815,按照样本质量计算酶活得:
亚铁氧化酶酶活(U/g 质量)= 1.667×x÷W×N= 1.667×6.815÷0.1=113.603 U/g 质量。
2、 取兔血清,按照测定操作步骤,测得计算ΔA 测定=(A 无基质管-A 空白管)(- A 测定管-A 对照管)=(0.976-0.005)-(0.469-0.009)=0.511,带入标准曲线 y = 0.0027x + 0.0036,计算 x=187.926,按照液体体积计算酶活得:
亚铁氧化酶酶活(U/mL)= 1.667×x=1.667×187.926=313.273 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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