供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 30次 |
货号: | BES232215ME |
CAS号: |
免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒
产品及特点 福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织是疾病机制的回顾性临床研究中使用最为广泛的标本。但是由于它们的保存时间一般都比较长,很不容易从中提取到可以进行 PCR 的 RNA,存在的主要问题是 RNA 的降解和脱蜡过程中样品的丢失。本产品专门用来免提取释放切片核酸的试剂盒,它具有如下特点:
1. 免核酸提取,可以直接作为核酸扩增的模板。
2. cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或专一引物,适合各种情况。
3. PCR mix 含有上样染料,所以 PCR 产物可直接上样电泳。
4. 两管式操作,RT 和 PCR 分步进行,便于单独优化 RT 反应和 PCR 反应的条件。
5. 扩增效率高,最高可扩增 1kb 以上的 RNA。
6. 本试剂盒足够处理 30 次样品处理和 50 次的 RT-PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 阳性对照和阴性对照,RNase-free 的 1.5 mL 离心管(耗材)
一、样品 RNA 的释放
1. 如果有 N 个样品,可设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用水作为制备的阴性对照,提取结束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
2. 将 5 片厚度为 6-8 um 的石蜡包埋组织切片转移到 1.5 mL 塑料离心管(最好使用螺旋盖离心管)中并加入 1 mL 溶液 A,在振荡器上以最大速度振荡 10 秒,然后离心。
3. 取出上一步的上清液 0.6mL,加入 0.6mL 的溶液 B,震荡 5-10 秒。
4. 室温放置 10 分钟。
5. 混合液可以直接用做 PCR、RT-PCR、LAMP 和 RT-LAMP 扩增的模板。未用完的部分模板可以放-80℃长期保存。
二、RT(逆转录)反应合成 cDNA
注意:RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定 cDNA 合成的平均长度(成反比)。一般情况下随机引物效率好于OligodT 引物,但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA(只占 5%左右),则可优先选用 OligodT 引物,这样就可以排除非 mRNA 的干扰。
7. 70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。
8. 按顺序加入 6 uL RT Buffer(含 dNTP)和 2 uL MMLV 逆转录酶(含RI),反应终体积为 20 uL。
9. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
10. 70℃保温 10 分钟以终止反应,然后放置在冰上待用。
11.合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用,不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。
三、PCR(30 uL 体系)
12.将全部专用染料加入到 PCR MagicMix 3.0 中,轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料,但在 PCR 结束后,电泳上样前,则需要加入电泳上样液,否则电泳时没法判断电泳速度。
13.在 PCR 管中加入下列成分:
注意:cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍完全 取决于靶基因的丰度。
14. PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定,下面的只做参考):
四、电泳检测
15.取 5-10 uL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳,跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注:本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上样,不需要额外再加电泳上样液。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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