供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50次 |
货号: | BES202607P |
CAS号: |
甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
【产品名称】
英文名称:Influenza Virus A
中文名称:甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
【包装规格】
50T/盒
【预期用途】
甲型 H3N2 流感是一种由粘病毒引起的呼吸系统疾病,可以通过多种动物的呼吸道传播(狗,鸡,鸭等),患者多表现出普通流行性感冒的症状,有时会出现
腹 泻和呕吐,重者会继发肺炎和呼吸衰竭,甚至死亡。因此快速灵敏诊断具有重要 意义。本产品是基于染料法荧光定量 PCR 原理开发,专门检测甲型流感病毒H3N2 亚型的试剂盒。它具有下列特点:
1. 一站式,用户不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2. 根据甲型流感(禽流感)病毒 H3N2 亚型基因组的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。
【检验原理】
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光 PCR 技术,针对甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型的基因高度保守区域设计特异性引物,用荧光 PCR 技术对甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型的核酸进行体外扩增检测,在反应体系中含甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型核酸模板的情况下,PCR 反应得以进行并释放荧光信号,利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性、定量分析。
【试剂组成】
名称 | 规格 |
甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型扩增液 | 100μL×1管 |
甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型反应液 | 900μL×1管 |
甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型阳性质控品 | 50μL×1管 |
甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型阴性质控品 | 50μL×1管 |
说明书 | 1份 |
说明:
1)不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
2)试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
3)自备:无 DNA/RNA 酶的 1.5mL 离心管,0.2mL PCR 反应管,滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL),离心机,振荡混合器,各种规格的移液器。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融少于 7 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【样品要求】
1. 根据实际情况可采取采取全血、血清、血浆,口腔样本,唾液、咽喉部鼻孔眼部和病毒培养物作为检测样本,具体参考《临床微生物样本采集规范》。
2. 应避免样本间交叉污染,样本采集后应及时检测,也可保存于-20±5℃待检,长期保存应置于-70℃以下。
【样品保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过6个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
取待检测样本 200ul,加入 1.5ml 离心管中,用 DNA 核酸提取试剂盒进行提取即可。
1.2 RNA 提取
根据您实验室的具体情况和样品类型,选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠,我们建议使用商品化的试剂盒进行提取,严格按照对应试剂盒说明书进行操作,样本核酸提取过程中应避免污染,提取好的模板样品如不能立即检测,建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的RNA提取试剂盒:RaPure病毒RNA提取试剂盒
2. 试剂配制(试剂准备区)
2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温(20~25℃),注意避免强光照射,待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s,使用低吸附吸头分液取样,避免试剂损失和浪费。
2.2 根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | 甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型反应液 | 甲型流感(禽流感)病毒H3N2亚型扩增液 |
用量(样本数为N) | 19μL | 1μL |
2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂,充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s,按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。
2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识(请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位,切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间,以免影响信号采集)。将 PCR 反应管转移至样本准备区,剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心,核酸加样过程中应避免污染。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:检测通道 SG,荧光染料法(SYBR Green I),请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 预变性 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 变性 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
3 | 退火-延伸 | 40cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
60℃ | 30sec | 是 | |||
4 | 溶解曲线阶段 | 1 cycle | 95℃ | 使用仪器默认程序 | 是 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑:检测通道 Ct 值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现 Ct 值≤38.0 和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
阴性:样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。
6. 质控标准
阴性质控品:无明显扩增曲线或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤30;
以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7. 产品性能指标
阴阳性参考品符合率:5 份阳性参考品符合率为 100%;10 份阴性参考品符合率为 100%。
最低检测限:1.0×103copies/mL。
精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
8. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
Ø 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
9. 注意事项
Ø 所有操作严格按照说明书进行;
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
Ø 反应液应避光保存;
Ø 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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