供货周期: | 现货 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 20T |
货号: | BES200206BA |
CAS号: |
Annexin V-eGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒
产品介绍:
磷脂酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂,正常细胞中,PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而 在细胞凋亡早期,细胞膜 PS 由脂膜内侧翻向细胞膜外侧,使 PS 暴露在细胞膜外表面。Annexin V 是一 种分子量为 35~36kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴 露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之 一。
将 Annexin V 带 eGFP 标签,以此作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜, 但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用 Annexin V 与 PI 双染 的方法,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
试剂盒组份:
所需实验器材和试剂:
1. 微量移液器
2. PBS
3. 不含 EDTA 的胰酶消化液
4. 低速离心机
5. 流式细胞仪
注意事项:
1. 此试剂盒仅供研究使用。
2. 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。
3. Propidium Iodide(PI)有毒,操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。
4. Annexin V-eGFP中含有毒性成分叠氮化钠(NaN3), 操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。
5. 本试剂盒用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不应低于1×106。
6. 染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
7. Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞,如:淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞,由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较高的假阳性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,而影响检测,可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中,防止进一步的损伤。尽管目前,包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我们不推荐用该方法检测。因为其重复性较差,且需要操作时非常小心。
8. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V- EGFP,最终导致染色失败。
9. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品。
操作说明:
1. 细胞样品的准备:
a) 悬浮细胞:
i. 收集细胞至离心管中 1000-2000rpm 离心 5min,小心去除上清。
ii. 用 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数,1000-2000rpm 离心 5min,小心吸除上清。
iii. 再加入 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞,1000-2000rpm 离心 5min,小心吸除上清。
b) 贴壁细胞:
i. 吸出细胞培养液至离心管中,PBS 洗涤贴壁细胞一次,加入适量不含 EDTA 的胰酶细胞消化液消化细胞。
ii. 室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
iii. 加入步骤 i 中收集的细胞培养液,稍混匀,转移到离心管内,1000-2000rpm 离心 5min,小心吸除上清。
注:加入步骤 i 中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶;残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V- EGFP 导致染色失败。
iv. 用 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数,1000-2000rpm 离心 5min,小心吸除上清。
v. 再加入 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞,1000-2000rpm 离心 5min,小心吸除上清。
2. 用去离子水按 1:4 稀释 Binding Buffer(4ml Binding Buffer (4×)+12ml 去离子水);
3. 用 250ul 结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为 1×106/ml;
4. 取 100ul 的细胞悬液于 5 ml 流式管中,加入 5ul Annexin V- eGFP,轻轻混匀;
5. 室温(20-25℃)避光孵育 5min;
6. 上机前 5 min 加入 10ul 碘化丙啶溶液,轻轻混匀;
7. 上机前在反应管中补加 400ul PBS 重悬细胞, 避光保存, 随即进行流式细胞仪(FC)检测,Annexin V- eGFP 为绿色荧光,PI 为红色荧光。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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