供货周期: | 现货 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 10T |
货号: | BES26202C |
CAS号: |
去内毒素质粒大量提取试剂盒
Plasmid Extraction Mini Kit (Endotoxin Free)
规格:10T
保存条件:
室温干燥可保存一年,4℃保存可更长时间。
产品简介:
本试剂盒适用于无内毒素高纯度质粒 DNA 的大量制备与纯化,柱上去除内毒素,操作简单。菌体经改良的碱裂解处理,质粒可从菌体中释放出来,并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。通过去蛋白液和漂洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质,最后得到高纯度的无内毒素质粒 DNA,所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、细胞转染等分子生物学实验。
产品优势
1. 操作简易、快捷、高效(颜色易判断、得率高)、省时。
2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净。
3. 内毒素去除简单:柱上去除内毒素,方便快速,清除干净。
注意事项
1. 细菌培养时间一般为14小时左右,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒 DNA 突变。
2. 使用前应将全部RNase A溶液加到Solution I中混合均匀,2-8℃可稳定保存6个月;每次使用时都要注意 Solution II 和 III 是否形成沉淀,如有沉淀 37℃溶解后再用;
3. 加入 Solution II 裂解细菌,直至溶液成紫红色粘稠透明状,时间过长会导致质粒 DNA 变性;
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。
操作步骤
1. 柱平衡:向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入 2.5 ml 的平衡液 BL,10,000 rpm 离心 2 min,弃收集管中滤液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
2. 取 100-200 ml(如果是低拷贝质粒可以收集更多菌液)过夜培养的菌液,室温 10,000 rpm 离心 2 min,弃上清。
3. 加入 10 ml Solution I,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀,呈现出均匀混浊的棕红色。注意:菌体沉淀一定要悬浮均匀,如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低。
4. 加入 10 ml Solution II,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直到溶液变成清亮、粘稠的紫红色。注意:不可剧烈震荡,以免造成基因组 DNA 片段的污染,所用时间不要超过 5 min,以免质粒受到破坏,如未完全变得清亮,可能是菌体太多,可增加 Solution II 的用量,在后续的操作中 Solution III 的用量也要相应增加。
5. 加入 10 ml Solution III,立即温和颠倒混匀,可见红黄相间的絮状物产生,继续混匀直到完全变为黄色,室温静置 2 min,然后 10,000 rpm 离心 10 min,将上清转移至干净离心管(自备)中,注意不要带入沉淀。注意:Solution III 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果上清中还有紫色漂浮物,说明复性不充分,继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。
6. 加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇,上下颠倒混匀。注意:加入异丙醇过多容易导致 RNA 污染。
7. 将步骤 5 中液体与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中(使用当天用平衡液处理的吸附柱,放入 50 ml 收集管中),静置 2min,让质粒 DNA 与吸附柱中的硅胶膜充分结合。10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中的滤液。注意:吸附柱的最大容积为 15 ml,所以上步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时,建议加入吸附柱的溶液体积不超过 10 ml,以防发生漏液现象。
8. 向吸附柱中加入 5 ml ToxinOut Buffer,室温静置 10 min,10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中滤液。
9. 加入 10 ml Buffer WB2,室温 10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中滤液。注意:Buffer WB2 为浓缩液,按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防酒精挥发。
10. 加入 5 ml Buffer WB2,室温 10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中滤液。
11. 室温 10,000 rpm 离心 5 min,甩干残留液体。
12. 将离心吸附柱置于一个新的 50 ml 塑料离心管中,打开管盖,放置 5 min,使乙醇彻底挥发干净。
13. 加入 1-2 ml 洗脱液 Buffer EB,室温放置 2 min,10,000 rpm 离心 2 min,离心管底溶液即质粒 DNA。注意:为增加洗脱效率,可将得到的质粒溶液重新加入到吸附柱中重复步骤 11 一次,如需使用去离子水洗脱,可用 NaOH 调整其 pH值在 7.0 - 8.5 之间。
低拷贝或大质粒(>10 kb)提取
如果所提质粒为低拷贝质粒,或大于 10 kb 的大质粒,或提取农杆菌质粒,或提取革兰氏阳性菌质粒,应加大菌体使用量,使用 300-500 ml 过夜培养物,最后洗脱液 Buffer EB 60℃水浴预热,吸附和洗脱时可以适当延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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