Real-titer慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒_价格

产品详情

本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定，计算出初始病毒的有效滴度。

产品特点
►本产品采用感染病毒后靶细胞基因组作为模板，测得数据更真实
►基于Taqman探针法开发本产品，结果更准确
►适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定

产品成分

试剂名称	内容	数量
Solution 1	标准品DNA模板（5x10^9 c/μl）	100μl
Solution 2	Lenti-primer (10μM)	40μl
Solution 3	Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM)	80μl
Solution 4	Taq (probe qPCR) (2X)	1ml
Solution 5	ROXI(50X)	40μl
Solution 6	ROX II(50X)	80μl

其他所需材料
细胞基因组DNA抽提试剂（离心柱法）
超纯水
Q-PCR用96孔板或8连管
定量PCR仪
1.5ml无酶离心管用于样品制备
无酶枪尖

操作步骤
1.取感染72h后的293T细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，细胞计数，得细胞数为N;
2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，测定基因组DNA总量为G (μg)，稀释至50ng/μl备用；
注：此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒
3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品：

	标准品管				样品管
#	稀释倍数	Water	标准品	拷贝数/μl	稀释倍数	Water	样品(50ng/μl)
1	10^1	45μl	5μl	5.45x10^8	10	45μl	5μl
2	10^2	45μl	5μl of 1#	5.45x10^7	50	40μl	10μl of #1
3	10^3	45μl	5μl of 2#	5.45x10^6	100	45	5μl of #1
4	10^4	45μl	5μl of 3#	5.45x10^5
5	10^5	45μl	5μl of 4#	5.45x10^4
6	10^6	45μl	5μl of 5#	5.45x10^3

梯度稀释取样前，需充分混匀；
4.根据下表配制反应液，每组配制3个复孔：

试剂	用量	终浓度
标准品或样本	2μl	*1
Lenti-primer (10μM)	0.4μl	0.2μM
Lenti-probe (2.5μM)	0.8μl	0.1μM
Taq (probe qPCR) (2X)	10μl	1X
ROX	*2
Water	补至20μl

*1：样本除步骤3中稀释的3种浓度外，另需一组未稀释样本，即总量为100ng/孔；另需设置阴性对照孔，即不添加任何DNA模板；
*2：根据所使用仪器添加：

	适用仪器
ROX I (终浓度1X)	7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System
ROX II (终浓度0.5X)	7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System
无需ROX	Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System

5.上机，按照以下程序进行Q-PCR反应：
变性 (1 Cycle)：95℃ 30s
扩增 (40 cycles)：95℃ 5s + 60℃ 30s
注：可根据具体使用仪器自行调整程序。
6.计算标准曲线：计算每组标准品的平均Ct值，以平均Ct值为X，Loge(copy number)为Y，生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99；
7.计算样本平均Ct值，带入标准曲线计算出copy number=n。
注：以Ct值在标准曲线范围内的数据为准，若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值，需对样本稀释倍数进行相应调整。
8.计算病毒滴度：举例
Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
其中：n=步骤7中计算所得拷贝数；d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100)；G=基因组提取所得DNA总量(μg)；N=基因组提取所用细胞数；Nori=病毒感染时细胞数；V=病毒感染时病毒用量(ml)。
计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度，取平均值为最终结果。

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供货周期：	现货
品牌：	东岭生物
货号：	GE-20006-100