供货周期: | 现货 |
品牌: | 东岭生物 |
货号: | GE-20006-100 |
本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定,计算出初始病毒的有效滴度。
产品特点
►本产品采用感染病毒后靶细胞基因组作为模板,测得数据更真实
►基于Taqman探针法开发本产品,结果更准确
►适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定
产品成分
试剂名称 | 内容 | 数量 |
Solution 1 | 标准品DNA模板(5x10^9 c/μl) | 100μl |
Solution 2 | Lenti-primer (10μM) | 40μl |
Solution 3 | Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM) | 80μl |
Solution 4 | Taq (probe qPCR) (2X) | 1ml |
Solution 5 | ROXI(50X) | 40μl |
Solution 6 | ROX II(50X) | 80μl |
其他所需材料
细胞基因组DNA抽提试剂(离心柱法)
超纯水
Q-PCR用96孔板或8连管
定量PCR仪
1.5ml无酶离心管用于样品制备
无酶枪尖
操作步骤
1.取感染72h后的293T细胞,胰酶消化制备单细胞悬液,细胞计数,得细胞数为N;
2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA,测定基因组DNA总量为G (μg),稀释至50ng/μl备用;
注:此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒
3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品:
标准品管 | 样品管 | ||||||
# | 稀释倍数 | Water | 标准品 | 拷贝数/μl | 稀释倍数 | Water | 样品(50ng/μl) |
1 | 10^1 | 45μl | 5μl | 5.45x10^8 | 10 | 45μl | 5μl |
2 | 10^2 | 45μl | 5μl of 1# | 5.45x10^7 | 50 | 40μl | 10μl of #1 |
3 | 10^3 | 45μl | 5μl of 2# | 5.45x10^6 | 100 | 45 | 5μl of #1 |
4 | 10^4 | 45μl | 5μl of 3# | 5.45x10^5 | |||
5 | 10^5 | 45μl | 5μl of 4# | 5.45x10^4 | |||
6 | 10^6 | 45μl | 5μl of 5# | 5.45x10^3 |
梯度稀释取样前,需充分混匀;
4.根据下表配制反应液,每组配制3个复孔:
试剂 | 用量 | 终浓度 |
标准品或样本 | 2μl | *1 |
Lenti-primer (10μM) | 0.4μl | 0.2μM |
Lenti-probe (2.5μM) | 0.8μl | 0.1μM |
Taq (probe qPCR) (2X) | 10μl | 1X |
ROX | *2 | |
Water | 补至20μl |
*1:样本除步骤3中稀释的3种浓度外,另需一组未稀释样本,即总量为100ng/孔;另需设置阴性对照孔,即不添加任何DNA模板;
*2:根据所使用仪器添加:
适用仪器 | |
ROX I (终浓度1X) | 7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System |
ROX II (终浓度0.5X) | 7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System |
无需ROX | Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System |
5.上机,按照以下程序进行Q-PCR反应:
变性 (1 Cycle):95℃ 30s
扩增 (40 cycles):95℃ 5s + 60℃ 30s
注:可根据具体使用仪器自行调整程序。
6.计算标准曲线:计算每组标准品的平均Ct值,以平均Ct值为X,Loge(copy number)为Y,生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99;
7.计算样本平均Ct值,带入标准曲线计算出copy number=n。
注:以Ct值在标准曲线范围内的数据为准,若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值,需对样本稀释倍数进行相应调整。
8.计算病毒滴度:举例
Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
其中:n=步骤7中计算所得拷贝数;d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100);G=基因组提取所得DNA总量(μg);N=基因组提取所用细胞数;Nori=病毒感染时细胞数;V=病毒感染时病毒用量(ml)。
计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度,取平均值为最终结果。
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