博格隆亲和层析填料的种类与选择

随着对生物药的纯度和质量要求日益增加，而生物分子种类越来越多，结构越来越多样，样品自身的不稳定性以及成分的复杂性从而使得生物制药分离纯化的挑战增大。由于亲和层析介质具有高选择性、可放大性和易于工艺开发的优势，现已成为生物制药工业化生产的关键技术，这是一种根据生物分子之间的特异相互作用来分离物质的层析方法，如酶和底物的结合、受体和配体的结合、抗体和抗原的结合等。这类结合即是特异的，又是可逆的，通过这种可逆的结合和分离来达到蛋白纯化的目的。

亲和层析特点

· 高效、快速

· 高选择性

· 高分辨率

· 通常一步纯化就能达到90%以上的纯度

· 高回收率

亲和填料可大致分为抗体纯化亲和填料、标签蛋白纯化填料、族特异性亲和填料以及预活化填料，广泛应用于抗体、多肽、重组蛋白、核酸以及疫苗等分离纯化领域。

抗体纯化

抗体纯化亲和填料是利用抗原与抗体之间高度特异性的亲和作用进行分离的方法。

源于金黄色葡萄球菌的Protein A可特异性结合抗体Fc片段，经耐碱突变后的Protein A具有良好的稳定性，适合从大批量培养液捕获单克隆抗体或者Fc融合蛋白，也适合于从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。

Protein G与Protein A相比有着更为宽广的结合谱，不仅与抗体的Fc片段有着强有力的结合，也和抗体的Fab片段（CH1）有着弱的相互作用，常用于分离纯化来自细胞培养物中的抗体或者抗体片段，以及从各种属的血清中纯化抗体。

Protein L可特异性结合抗体Kappa 轻链可变区，与 抗体结合后不影响抗原结合位点 ，与Protein A或Protein G相比，能更广泛地结合各种来源及亚类的抗体，如可结合IgG、IgM、IgA、IgE和IgD以及单链可变片段(scFv)和Fab片段，可从发酵液、动物腹水或血清中纯化抗体。

IgM/IgY亦可依靠嗜硫亲和纯化，利用电子供体和电子受体之间的相互作用来分离纯化生物分子，配基为2-巯基吡啶，这种作用力在高盐环境下得以加强，在低盐环境下减弱，多用于重组表达的抗体纯化。

标签蛋白纯化

标签蛋白是指将蛋白质的N端或C端与某种可与其他物质（如金属离子、葡聚糖等）具有特异性的吸附作用的蛋白质或多肽标签进行融合表达后得到的融合蛋白，可根据标签的特性进行捕获纯化。

His标签由多个组氨酸组成（通常为6个组氨酸），组氨酸残基中咪唑环的给电子体基团可与过渡金属形成配位键，一个Ni2+有六个配位位点，部分与络合剂鳌合，部分与蛋白结合，金属鳌合亲和填料常见的络合剂有：IDA 、NTA以及TED，分别拥有3、4、5个金属配位位点，因此TED抓捏能力最强，能耐受一定浓度的碱与EDTA，而IDA结合蛋白能力相对最强。除镍之外，金属螯合亲和层析介质还可鳌合Cu2+，Zn2+，Co2+等离子纯化含组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链的蛋白质和多肽。

GST标签有利于蛋白质的可溶表达和活性维持，利用填料上还原型谷胱甘肽配基与含有谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白特异性结合的特性可对GST标签蛋白进行分离纯化。26KDa的 GST标签后续需内切酶切除 ，切除标签后的样品可再经苯甲脒亲和介质去除内切酶。

族特异性亲和层析

族特异性亲和层析一般是指针对某一类结构或功能相似的物质有特异性，虽特异性不强，但通过选择合适的结合和洗脱条件也可以得到很高的分辨率的层析方法。

肝素亲和的配基为来源于猪小肠的肝素多糖，基于肝素抗凝作用可用于抗凝血酶Ⅲ与生长因子等生物大分子的纯化，又因其本身阴离子硫酸根含量高而具有类似核酸的性质，从而结合与核酸结合的蛋白。

蓝胶是以琼脂糖为基架，Cibacron Blue 3GA 为配基的亲和介质，Cibacron Blue 3GA属于蒽醌衍生物，结构中有氨基、磺酸基和苯基，除具有核苷酸特异性吸附作用外，也可以通过电荷以及疏水等作用与蛋白质进行非特异性结合。蓝胶已被广泛应用于各种蛋白质的分离纯化领域，如脱氢酶、激酶、转移酶、血清白蛋白、干扰素及血浆蛋白等。

苯甲脒亲和介质的配基为对氨基苯甲脒，苯甲脒类物质是丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽释放酶等）的广谱抑制剂，故常用于丝氨酸蛋白酶的分离纯化及去除，例如GST标签内切酶Thrombin、Factor Xa等丝氨酸蛋白酶的去除。

质粒纯化

经典的质粒三步法中，由于开环质粒与闭环的超螺旋质粒DNA表面电荷和碱基暴露程度不同，质粒纯化填料利用2-疏基吡啶的嗜硫吸附即亲水-疏水混合模式作用分离纯化闭环的超螺旋质粒DNA。

预活化填料

预活化填料应用广范，物理化学性能稳定，可灵活选择基架偶联特定配基，偶联配基时，可根据配基特性决定偶联方法。

CNBr-填料为溴化氰预活化的琼脂糖介质，不需偶联间隔臂配基直接偶联生物大分子，与蛋白等生物大分子的反应条件温和，配基与基架可形成多位点偶联，介质性质更加稳定。

NHS-填料为N-羟基琥珀酰亚胺预活化的琼脂糖凝胶，带有10个碳原子的延伸臂，降低了配基与琼脂糖表面的空间位阻，易与蛋白形成酰胺键，操作简便，化学稳定性强。

亲和层析是下游工艺的关键步骤，应在温和的洗脱条件下有着优异的纯化表现，同时经得起严格的清洗和消毒过程。在筛选填料的过程中，为高效获得高产量高质量样品，应从基质与配基方面综合考虑，不同材质、粒径、孔径的基质适用于不同阶段的纯化过程，可从分辨率、流速、载量等角度出发；而正确的配基种类与密度则对目标物具有良好的结合能力，同时具有相对温和的洗脱条件。

合适的亲和层析填料，除优异的工艺性能外还需考虑巨大的成本优势，博格隆已推出全品类亲和层析填料产品，为生物药下游分离纯化提供更经济高效的分离纯化解决方案。