婴儿利什曼虫探针法荧光定量PCR试剂盒

上海雅吉生物科技有限公司

2024/10/10 08:44
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CAT#:15-18620

低温运输，-20℃保存

























婴儿利什曼虫探针法荧光定量PCR试剂盒

Leishmania infantum Probe qPCR Kit

使用手册V1.1































产品及特点

本试剂盒可用于检测婴儿利什曼虫。婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）可引起动物源性内脏利什曼病(黑热病)。由大量观察表明婴儿利什曼原虫感染人或犬后可无症状，而无症状感染的犬已被证实在疾病传播中起作用。本产品是根据探针法荧光定量PCR 原理开发的婴儿利什曼虫检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供DNA 模板。

2. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

3. 反应快速，灵敏度高。

4. 本试剂盒足够做20μL体系的探针法荧光定量PCR 50次，只能用于科研。


规格及成分

成分编号规格2 × Probe qPCR Mix190504a600 μLDEPC-H2O1807011 mL婴儿利什曼虫qPCR引物-探针混合液15-18620yp90 μl婴儿利什曼虫qPCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)18620pc50 μl使用手册15-18620sc1份



运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。


自备试剂

样品DNA，超纯水。


使用方法

一、DNA 提取(样本制备区)

用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

二、稀释标准曲线样品(样本制备区)

（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入45 μL DEPC-H2O，（最好用带芯枪头，下同）。

3. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1×10E5拷贝/μL即可。

三、试剂配制(试剂准备区)

若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管(N个待检样品+1个阴性对照+6个阳性对照)，向各PCR管中分别加入下列成分：

成分/每管N个待检样品管qPCR阴性对照qPCR阳性对照2 × Probe qPCR Mix各10 μL10 μL10 μL婴儿利什曼虫qPCR引物-探针混合液各1.5 μL1.5 μL1.5 μLDEPC-H2O6.5μL6.5μL6.5μL

转移至样本准备区。

四、添加模板(模板添加区)

向qPCR管中分别加入2ul模板，加样顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。

五、扩增反应(扩增及产物分析区)

将PCR管放置在PCR扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：

过程温度时间预变性95℃3 minqPCR反应（40个循环）95℃15 sec58℃20 sec72℃20 sec（采集FAM通道的荧光信号）

探针的荧光基团和猝灭基团如下表：

荧光基团 猝灭基团 FAM MGB

六、结果分析

1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的log 值，推算出其浓度。

2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：

阳性对照结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的S 型曲线。

阴性对照结果：Ct 值>38 或无Ct 值，无明显指数增长期和平台期。

样本检测结果：Ct 值<35，有明显指数增长，表明样本中检测出婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct 值>38 或无Ct 值，表明样本中未检测出婴儿利什曼虫，结果为阴性；Ct值在35-38 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct 值仍在35-38 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。


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