随着分析仪器灵敏度不断提高,超痕量的物质也很容易被检测出来,所以实验人员也越来越重视试剂的纯度。如果用含有痕量杂质的水做LC-MS流动相,或制备标样和空白样 品,会导致错误的结果或者数据分析的困难。在很多国家,从环境中(也包括水路)检测出医药产品的存在。饮用水中存在痕量荷尔蒙的报道也越来越多,而这一类化合物很难被传统的水处理方法去除。
这也影响到了LC-MS级别纯水,因为无论瓶装或直接纯化的LC-MS级别水都是由自来水制得。
本文的目的是研究无论自来水有没有被痕量激素污染,制备 LC-MS 级别超纯水的实验室纯水系统的适用性。
样品制备和检测方法样品收集:
自来水:世界上多个国家自来水,包括西班牙、法国、芬兰、中国和印度
超纯水:来自世界多个国家实验室纯水系统制备的LC-MS级别超纯水,包括西班牙、法国、芬兰、中国和印度。
水样在运输及测试过程中必须使用硅酸盐玻璃器皿。
水纯化系统:
1.波兰和印度: Milli-Q Integral with Millipak® final filter (EMD Millipore)
2.法国: Milli-Q® Integral with LC-Pak® final filter
3.中国和西班牙:Elix® and Milli-Q® Advantage with Millipak® final filter
水纯化系统生产的超纯水质量参数:
印度:TOC: 48 ppb, Resistivity: 18.2 MΩ·cm,25C 其他国家:TOC<5ppb, 电阻率18.2 MΩ·cm ,25C 样品前处理:
使用SPE(LiChrolut® EN, EMD Millipore)或Phenomenex Strata® -X(用于西班牙样品)
1.SPE活化:5mL 甲醇(LiChrosolv® LC-MS, EMD Millipore)
2.上样:15 mL/min,10 min 真空干燥
3.洗脱:3mL甲醇,蒸发至1mL
仪器:
nLC-MS系统:HPLC:Agilent 1290
nMS:Agilent 6420 QQQ
nHPLC仪器参数:
Ø色谱柱:Purospher® STAR RP-18 endcapped (2 μm) Hibar® HR 50-2.1 mm (EMD Millipore)
Ø流速:0.5 mL/min
Ø进样量:样品40 μL, 标样10 μL
Ø溶剂A:含有1%乙酸的Milli-Q®超纯水
Ø溶剂B:高纯度乙腈(LC-MS LiChrosolv®, EMD Millipore)
Ø梯度(min, %B):
Time | A% | B% |
0 | 100% | 0 |
2 | 100% | 0 |
5 | 0 | 100% |
6 | 0 | 100% |
9 | 100% | 0 |
13 | 100% | 0 |
n MS参数: Capillary 4000 V, Nebulizer 37 psi, Drying gas N2, 7.5 /min, 300o C; ESI+, MRM
荷尔蒙检测:
水样品中检测出如下荷尔蒙:
从污水处理厂流出的水中检测出低浓度(ng/L)荷尔蒙,这些水被直接排放至水路中,甚至被作为饮用水。如果自来水中存在痕量荷尔蒙,就要在超纯水应用于激素类物质的检测用于制备样品和标样,以及作为LC-MS流动相和空白之前,确保能够被纯水系统除去。
使用标准加入法可以检测时9种不同的荷尔蒙。荷尔蒙分析的方法检出限(MDL)为12-36 pg/L。
使用LC-MS/MS检测出(IDL)的荷尔蒙浓度(图1、2和3):
1.Estradiol: 法国样品 265.40 ng/L 西班牙样品 297.92 ng/L
2.Androsterone: 法国样品 515 ng/L, 西班牙样品1635 ng/L*西班牙样品*( 可能样品中存在荷尔蒙类似物使得检测含量过高)
3.Corticosterone: 中国样品 14.91 ng/L
相对应的,在这些水样对应的超纯水样品中并没有检测出荷尔蒙(MDL: 12-36 fg/L, IDL: 0.4-1.1 pg)
结果和讨论:
图1. 法国和西班牙自来水样品中Estradiol 的LC-MS/MS结果(左图)和Milli-Q®纯水结果对比(右图,标样为1ppm的Estradiol)
图2. 法国和西班牙自来水样品中Androsterone 的LC-MS/MS结果(左图)和Milli-Q®纯水结果对比(右图,标样为1ppm的Androsterone)
图3. 法国和西班牙自来水样品中Corticosterone 的LC-MS/MS结果(左图)和Milli-Q®纯水结果对比(右图,标样为1ppm的Corticosterone)
1.自来水中可能含有痕量荷尔蒙。为了满足实验室应用要求,自来水要通过各种纯化手段制备成超纯水。
2.作为水纯化系统的进水中如果可以检测出荷尔蒙(或类似物),在超纯水系统制备的纯水中已检测不出该类物质。
3.为LC-MS/MS实验选择合适的超纯水资源可以确保得到高质量的数据。
4.可以依靠正确的安装和良好的维护纯水系统来满足实验室LC-MS/MS分析对超纯水高质量的要求。
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