细胞培养是生物治疗药物生产的关键环节,细胞培养基为细胞提供了生长所需的环境和条件,为细胞提供必需的营养物质,如氨基酸、维生素、矿物质和糖类,支持细胞的生长和增殖,是细胞培养的基础。
在培养基中,水溶性维生素起着至关重要的作用,它们是细胞生长、代谢和功能维持所必需的营养物质。水溶性维生素主要包括:泛酸、维生素B12、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、硫胺素、核黄素、维生素C、叶酸、D-泛酸和生物素等。HPLC是测定水溶性维生素的主要方法。准确测定水溶性维生素的含量,是细胞培养过程监测的重要参数之一。由于水溶性维生素属于极性亲水性化合物,在常规的反相色谱柱上保留欠佳,通常需要加离子对试剂,以增强保留,改善分离,但离子对色谱法也给实际应用带来了诸多不便。ChromCore T3色谱柱具有良好的100%水相耐受性,能够有效实现极性和亲水化合物保留。本文采用ChromCore T3色谱柱,结合非离子对的流动相体系,建立了同时测定细胞培养基中10种常见水溶性维生素的分析方法。
将细胞培养基样品加水稀释1倍,直接上机分析。
1
色谱条件
Column: ChromCore T3, 5 μm
Dimension: 4.6×150 mm
Mobile Phase: A) 50 mM KH2PO4 (pH=3.0 by H3PO4)
B) MeCN
Gradient: t(min) %A %B
0 100 0
2 100 0
20 80 20
22 40 60
25 40 60
25.2 100 0
30 100 0
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ℃
Injection: 10 μL
Detection: UV 214 nm, UV 262 nm, UV 274 nm, UV 290 nm, UV 362 nm
Instrument: Agilent InfinityⅡ 1260四元
Sample: 10种水溶性维生素混合标准品溶液
2
线性关系和最低定量限、检出限考察
取已知浓度的10种水溶性维生素混合标准品溶液,加水逐级稀释,制成系列浓度的水溶性维生素混合标准溶液,进样分析,以浓度为横坐标,峰面积响应为纵坐标,考察各目标物的线性相关关系,结果所有目标物的线性相关系数r>0.999,表明各目标峰线性相关性较好。分别按照S/N=3:1和10:1计算各水溶性维生素的最低检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) ,结果见表1。
表1 10种水溶性维生素线性关系和最低定量限、检出限考察
3
精密度测试
取水溶性维生素混合标准品溶液,连续进样5次,结果各目标峰保留时间的RSD<0.2%;峰面积RSD<1.5%,表明方法精密度良好。
所有目标峰保留时间的RSD<0.2%;峰面积RSD<1.5%。
4
加标回收率测试
取培养基样品3份,其中2份按照高低两水平加入水溶性维生素的混合标准品溶液,另一份作为样品本底,测定所有目标组分的含量并计算加标回收率。结果所有目标物(除D-泛酸外)的加标回收率在99.76-103.87%;D-泛酸由于为末端UV检测,低浓度加标下易受基质成分干扰,测得低浓度加标回收率为118%,高浓度加标水平下回收率为102%。
5
样品分析
取两种培养基样品,按照前述确定的分析条件上机分析。由图4样品的分析谱图可见,各目标成分在该柱上保留较好,在特定的检测波长下与基质干扰成分的分离良好,可对目标物进行准确测定。
6
实验结论
本文采用ChromCore T3色谱柱,对细胞培养基中10种常见的水溶性维生素进行了分析。以两种培养基样品为例,各目标物与基质干扰成分分离良好;表明本法准确可靠、精密度较好,可被应用于培养基中水溶性维生素的含量测定。
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