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俗话说:“八月十五月正圆,中秋月饼香又甜”。中秋佳节来临,月饼是必吃之佳品。大家也许关心月饼里面到底有什么成分,实际测定会怎么样呢?也许要问月饼里面的香气和香味哪里来的? 是那些化合物呢?上次和大家分享玫瑰月饼的香气测定,这次和大家分享一下一款凤梨味月饼里面的香精等成分的GCMS测定的结果。这次的香精含量要高,明显。月饼含较多的面粉、糖、油脂等,一般香气都很淡,个别月饼添加的香精,但添加量极少,又是固体,无法直接进行GCMS分析,必须选择合适的方法来提取里面的香精或香气成分,然后用GCMS分析。本文采用吸附搅拌子(SBSE)提取月饼的香气香味成,大体积冷却进样口PTV热脱附TDU气相色谱质谱法分析鉴定凤梨味月饼的香精成分和部分看氧化剂防腐剂成分;利用Amdis质谱解卷积软件识别拆分共流出色谱峰,得到更纯净的质谱图,更利于下一步质谱检索的工作;并结合保留指数校正使质谱检索结果更为准确。1试验部分1.1 仪器与装置美国安捷伦7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪,带有德国Gerstel的MPS TX多功能自动进样系统,德国Gerstel的CIS4大体积分流/不分流进样口和TDU热脱附单元,整合FID检测器,同时带德国Gerstel毛细管柱分流装置。吸附搅拌子(PDMS, 0.10mmX10mm,Gerstel)。1.2样品和标样样品:凤梨月饼,购于上海某超市。实物图片:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509171629_566473_1615838_3.jpg香气香味化合物标准品均来自Sigma-Aldrich等主要试剂公司,少数为实验室内部精制标样。C6-C30正构烷混合标准物来自安谱公司。1.3GC/MS条件1.3.1 色谱条件:色谱柱:安捷伦VF-Waxms (30m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱;升温程序:40℃保持2 min,以3 ℃/min升至230℃,保持30 min;载气(He, 纯度99.999%以上)流速1.8 mL/min;进样口:PTV大体积冷进样口,温度10℃-250℃,15℃/S;TDU:25-200℃, 100℃/min, 不分流,传输线温度:260℃检测器:FID,氢气:30ml/min, 空气:350ml/min, 尾吹:30ml/min N2, 温度:270℃。1.3.2质谱条件: 电子轰击(EI)离子源;电子能量70eV;传输线温度280℃;离子源温度230℃;四级杆温度150℃。SCAN扫描范围:29-400。1.4样品的提取处理及分析方法样品的提取处理:月饼配料表有面粉、植物油、水、糖、鸡蛋、凤梨原浆、食用香精、食品添加剂(碳酸钾、碳酸钠、脱氢乙酸钠、柠檬酸)等。凤梨月饼的香气香味主要来源于馅料,皮只是一些烘烤的香气,所以主要分析馅料的香精成分。取出里面的馅捣碎,精确称取1g左右月饼样品,加适当内标物(本实验加入187ppb的内标物。内标物暂不公布),加3g超纯水,放入磁力搅拌子,提取1小时。用超纯水冲洗干净,用干净的餐巾纸吸干,放入热脱附的小管,运行序列。在分析样品前,和样品分析完全相同的条件下,用0.05%的C6-C30的正构烷标样注射到GCMS,获得正构烷的保留时间,用于计算保留指数。分析样品后,用软件计算样品各个组分的保留指数,并和标样的保留指数对比来,结合质谱来定性。事先也用同样方法测定标样的保留指数备用。
[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=138082]药用丙二醇的质谱结构表征与裂解途径分析[/url]
质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理,主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物,所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展,是当前生物药物领域增长最快的一类药物.1.抗体药物发展新趋势在生物药物领域,抗体药物占据着越来越重要的地位,全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物,抗体药物按来源分类可以分为:鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。目前,批准的单克隆抗体药物中,人源化单抗和全人源单抗数量已占据大多数。1.1 抗体药物偶联物(ADC)抗体药物偶联物(ADC)由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成。通过抗体的靶向作用,ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合,通过细胞内吞作用,将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部,释放出小分子化合物。这样既可以降低小分子药物的毒性,同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris。1.2 双特异性抗体(BsAb)双特异性抗体(BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体,能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁,由于基因工程的发展,目前双特异性抗体已经研发出多种类型,主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体(串联scFv)、DVD-Ig 等多种形式。2.质谱技术近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术:一种是介质辅助的激光解吸/离子化技术。另一种是电喷雾离子化技术。由于这两种电离技术的出现,使原本只能检测小分子的质谱技术,可以运用于检测生物大分子。在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征,而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析,而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用3.1 完整抗体药物精确分子量测定当得到抗体药物时,可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测,可以对于抗体药物进行初步定性分析,并将可以作为药物常规放行的分析方法。对于脱糖前的抗体药物进行分析,可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布,对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。3.2 药物抗体偶联比(DAR)对于赖氨酸链接的抗体偶联药物,采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析,根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目。对于质谱测定的结果,不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值,更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况,及反应过程副产物空链接头的分布情况。3.3 肽图谱分析蛋白被特异酶切后的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列,蛋白质被酶水解后,产生的肽片段也各不相同,肽混合物的质量数具有唯一特征。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质量数的鉴定,也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证,提高肽图谱的准确性。3.4 翻译后修饰研究蛋白质的翻译后修饰(PTM)对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的翻译后修饰有:磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N端焦谷氨酸环化,C端赖氨酸切除等。质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差,可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。3.5 N端氨基酸序列检测常规N端氨基酸检测用Edman降解法进行检测,但是抗体药物有时候会出现N 端环化的现象,在这种情况下用Edman降解法需要先对抗体进行去封闭处理,而直接使用质谱可以直接测出N端的氨基酸序列,同时可以检测出N端环化的相对比例。4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用4.1 氢/氘交换质谱(HDX-MS)常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息。氢/氘交换质谱(HDX-MS)可以进行蛋白质构象,溶液动力学和表位映射进行分析。在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中,HDX-MS已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体-抗原复合物的构象分析。4.2 离子淌度质谱法(IM-MS)离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法,可以区分相同分子量的蛋白和肽段,可用于检测蛋白的简单高级结构。4.3 高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)能够检测最高质量数的质谱仪器,并且有着很高的分辨率。FTICR-MS 是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具,特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰(PTM)蛋白质的鉴定。