单核细胞计

近日，华大智造研发团队在Nature子刊Nature Machine Intelligence（IF=25.898）上在线发表了题为Contrastive learning enables rapid mapping to multimodal single-cell atlas of multimillion scale的研究成果。研究人员开发了一种基于对比学习的多模态单细胞算法工具——Concerto (协奏曲)。“协奏曲”的命名， 既包含了“对比学习建模细胞表征”的英文首字母，又暗含了组织器官中不同类型、不同状态的细胞协同发挥作用之意。该算法通过自监督训练的方式，可快速对千万级无标注的单细胞多组学数据进行建模，得到的细胞表征（cell embedding）可以用于自动注释、多模态整合、聚类、跨批次整合、参考映射注释等下游应用。Concerto在各项任务中都展现了优异的性能，进一步丰富了单细胞大数据领域的算法工具。研究背景单细胞多组学工具在解析细胞多样性的研究中发挥着至关重要的作用，可绘制单细胞水平的多组学图谱，进而从多模态角度揭示细胞功能或状态的异质性。百万甚至千万级别的单细胞多组学大数据需要通过智能高效的计算工具助力科学发现，定义细胞类型和状态。同时，已发表的大量未经人工注释或者注释颗粒度不够精细的数据集本身也是宝贵的资源，若加以有效利用，可以帮助快速解读新产生的数据集。目前主流的单细胞数据分析工具大多依赖于统计学特征选择（如高可变基因）和线性降维方法（如主成分分析PCA[1]）来提取关键信息，但该预处理方法可能会造成信息量丢失。此外，单细胞数据集不可避免地存在不同程度的批次效应，在数据整合的过程中需要在保留每个样本包含的细微生物学状态差异前提下完成批次效应的适度去除。随着单细胞大数据时代的到来，亟需可快速构建千万级别单细胞多模态图谱并可实现映射注释的算法。华大智造自主开发的Concerto算法，采用人工智能领域新兴的对比自监督学习框架并进行优化适配，以应用在海量单细胞组学数据的建模中。何谓对比学习？简而言之，就是构造一个直观简洁的学习任务，让机器去对比和区分哪些样本与哪些样本相似，哪些样本与哪些样本不相似，从而学习到每个样本蕴含的高阶特征。这就好比是试图理解世界的婴儿，即使还未建立起认知世界的知识框架，也可能会意识到，相比于“史努比”，“加菲猫”和“黑猫警长”长得更像。婴儿通过比较不同物体之间的异同，或许可以学习到这些物体最重要的特征。对比学习示意图相比于传统的监督学习，在自监督学习中，机器学习的标签来自于样本自身。在真实世界中，有标签或者说有高质量标签的数据集是稀缺的，通过对比学习这样的自监督训练框架，可以很好地利用大量真实世界未注释的数据集。在机器视觉领域，Google和Meta近年来相继提出多种对比自监督学习算法，包括SimCLR[2]、 MoCo[3]等。在ImageNet分类基准测试中，最新的自监督算法甚至能优于有监督的基线方法。正如图灵奖得主Yann LeCun所预测，自监督学习是AI的未来，它就像人一样自觉观察数据，可能使AI产生类人的推理能力。在生物学领域，通过新兴的单细胞、时空组学工具获得的全新数据集，大大拓展了人类对于复杂生物系统的认知，这些数据还有大量未被人类标记或仅仅是依赖于已有知识进行注释。借鉴机器学习领域中不依赖标签数据的智能建模思想，以无偏的方式去利用好这些全新的单细胞数据，可以帮助科学家发现新的细胞类型、细胞状态，进而重新定义细胞类型。华大智造团队通过构造对比学习任务，让每个细胞自己跟自己“学习”，类似的细胞离得更近，不类似的细胞离得更远，从而实现对千万级别单细胞数据的快速建模。基于华大智造自主研发的便携、易用、经济友好的DNBelab C4单细胞建库平台，结合GPU的使用，利用Concerto构建千万级别的单细胞参考集仅需1.5h，快速注释5万个细胞仅需8s。同时，该模型可以整合不同模态、不同批次、不同测序平台和不同单细胞建库的方法。值得一提的是，Concerto的对比学习架构可以有效支持将一个细胞的所有基因作为输入建模，避免了直接降维过程中的信息丢失，同时该优势对于跨数据集的迁移注释至关重要，可以更好地扩展跨数据集间可利用的交集基因信息。华大智造DNBelab C4 Concerto模型架构具体而言，研究团队对每个细胞通过非对称的“双塔”蒸馏模型框架，并借鉴自然语言处理技术中的隐空间Dropout策略[4]，得到一个细胞的两个不同表征（cell embedding）并使其互为正样本，而与其他细胞则互为负样本。通过对比学习在超球面空间[5]上将正样本拉近，负样本推开，从而学习到高质量的细胞表征（图1a）。经过Concerto训练好的细胞表征，可以在zero-shot或者few-shot的场景下应用于多种下游分析任务（图1c）。图1 Concerto模型的结构示意图Concerto整合单细胞多模态数据在RNA和蛋白同时测序的人类外周血单核细胞数据集中（PBMC160K），作者利用Concerto进行多模态数据整合，作者发现：细胞的不同模态信息反应了之前科学家定义的不同细胞分类的颗粒度和类型。例如：CD4 T细胞和CD8 T细胞在只用RNA模态的情况下，不能很好地区分，需要加上蛋白的信息；而如果只用蛋白的模态，单核细胞monocytes和树突状DC细胞不能很好地分开，需要加上RNA的信息（图2）。Concerto在整合了RNA和蛋白质两个模态后，学到了更好的细胞表征：细胞大类和存在细微生物差异的细胞亚群都被很好地区分，而且也很好地捕捉到了细胞发育的轨迹。如CD8 T细胞谱系，可以看到CD8 naïve — CD8 TCM — CD8 TEM的轨迹，并且可以通过高维超球面空间到二维的映射看出，杀伤性的T细胞和NK细胞的距离更近，说明Concerto学习到的映射空间可以将功能接近的细胞互相靠近。图2 Concerto在RNA、蛋白、RNA+蛋白三种设置下学到的细胞表征在迁移注释任务的表现在公开的胰岛细胞数据集上（HP）迁移注释任务中，与目前主流单细胞迁移注释算法比较，Concerto准确率最高（图3），超过了纽约基因组中心Rahul Satija团队开发的Seurat V4[6]、德国亥姆霍兹慕尼黑中心Fabian Theis团队开发的scArches[7]以及Broad研究所Soumya Raychaudhuri团队开发的Symphony[8]。人类胰岛数据集（HP）包括5种单细胞测序方法得到的数据，Concerto整合4种技术构建了一个参考空间，在这个过程中没有用到任何标签信息，只是“each cell learns from itself”。然后把待注释的数据投射到这个参考空间，每个待注释的细胞都可以“找到”在参考空间里和它最像的k个参考细胞，最后只需要综合这k个参考细胞的信息就可以为待注释细胞打上注释。另外，Concerto除了可以跨技术平台进行迁移注释，也可以跨物种进行迁移注释。图3右展示了Concerto利用HP数据构建参考空间，对鼠胰岛（MP）细胞进行注释的性能。图3 胰岛数据集上迁移注释性能比较，华大智造Concerto模型准确率超过现有方法就像序列比对工具BLAST 将生物序列数据比对到参考基因组的功能一样，将新产出的包含不同样本、研究、疾病状态的单细胞数据集，映射到复杂的、数百万细胞的参考图谱上，可以实现快速识别相关的细胞状态和表型，此种方法将成为单细胞数据分析的全新范式。本研究另一亮点在于，利用现有已注释数据构建大型的细胞图谱作为参考（Reference），新的数据作为查询（query），可以直接在Reference上“查找”最相近的“已知“细胞，这样我们就可以知道query细胞的性质了。构建百万级别免疫细胞参考图谱，对新冠数据进行快速注释在COVID-19研究中，研究人员将华大智造DNBelab C4产出的新冠病人外周血单核细胞（PBMC）数据与其他研究小组已发表的通过其他平台所采集的数据进行整合，构建了大型新冠病人外周血免疫细胞参考图谱，涵盖了健康人及轻型、重型COVID-19患者，并针对查询数据集进行快速注释，发现不同感染状态差异的免疫学信号。由于在参考数据中存在与查询数据类似的与疾病相关的细胞状态，所以Concerto可以快速将查询新冠数据集映射到参考图谱上。Schulte-Schrepping等人[9]的研究主要针对髓系细胞，如单核细胞monocytes和中性粒细胞neutrophils在不同感染状态下的差异。通过参考映射的快速注释，复现了该数据集的淋系细胞与其他新冠研究里的一致信号，如Concerto注释了稀有细胞亚群proliferative-exhausted CD8 T，与Su[10]等人的研究一致。此前，深圳华大生命科学研究院刘龙奇团队联合中国疾控中心等机构科学家利用华大智造C4单细胞平台进行了大规模的新冠研究[11]，注释出了activated CD4 T细胞，并发现这种细胞的丰度会在患者体内上调。此次，利用Concerto构建的新冠参考数据集包含了这种细胞类型，也成功在Schulte-Schrepping的数据集中注释出activated CD4 T细胞，同时发现Schulte-Schrepping数据集中新冠患者的activated CD4 T细胞差异高表达CD2AP基因，也与此前华大研究院等人的发现一致。通过此项研究也证明，华大智造C4平台产出的数据可以和其他平台适配。将来科研人员可以利用Concerto构建整合不同单细胞数据产出平台的大型参考数据集，用以对新产出的数据进行快速注释。图4 将健康人与COVID-19患者整合的参考数据集对查询数据集进行迁移注释华大智造高级副总裁倪鸣博士表示：“单细胞组学的研究已进入高通量、大数据、多模态的研究阶段，此次基于对比学习的最新人工智能方法Concerto 用于单细胞参考数据集映射注释成果的发布，丰富了华大智造此前自主研发DNBelab C4单细胞平台，实现了单细胞组学领域硬件与软件的深度结合，相信未来会在单细胞领域赋能更多用户。”单细胞多组学时代的来临，使得重新定义细胞成为可能。华大集团联合创始人、董事长汪建曾提出 “六定”：定性、定量、定位、定时、定向、定标。未来，华大智造将继续开发用于单细胞多组学研究的硬件、试剂、软件工具，支持科研人员提高研究效率、拓展探索的边界。

在无数实战经验中，制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中，如单细胞活性不高，细胞数过低，以及污染和杂质等问题，都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等，最终得到的单细胞数据分析及统计结果不可信。那么，组织如何解离？需要选什么酶？还需要注意什么？科技君根据相关权-威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士，让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。实体组织解离关键——酶的合理选择 实体组织解离两大步骤，包含机械分离和酶消化处理。首先，组织需要通过物理切割或刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同，相关建议可参考如下表格：人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等[1]。 表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]除此之外，常用酶的类型还包括：Accutase™ 、弹性蛋白酶和胶原酶，以及商业酶混合物，如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等[1]，另外，科技君也总结已发表文献中常见实体组织解离所采用的酶，供大家参考，步骤详见参考文献：小鼠心脏肌肉组织：Collagenase IV and Dispase II[2]上皮组织：dispase(Corning) -商业化试剂[3]小鼠胚胎组织：TrypLE Express[4]乳-腺癌及其癌旁组织: Liberase TL (Sigma) -商业化试剂[5]小鼠主动脉血管：Collagenase type II (C6885, Sigma Aldrich) 和 Elastase (LS002292, Worthington Biochemistry)[6]小鼠脑垂体：Collagenase type II, trypsin， DNase I，amphotericin B 混合[7]血液处理成关键——离心稳定操作[1]样品经过密度离心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术)，可以直接用于外周血单核细胞（PBMC）捕获[1]。建议不少于5mL EDTA 抗凝血，且不要使用肝素抗凝管收集血液；同时注意在合适转数离心操作后，管中内容物分为三层，上层为血浆（内含细胞碎片），中间层为分层液，底层为红细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层（ 白膜层，薄）。此时，需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后，再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。单细胞悬液制备的8条建议[1]1. 建议采用无菌样品处理方式，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。2. 为降低对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。3. 在进行细胞清洗和重悬过程中，使用具有合适大小的器皿，避免高浓度导致细胞集聚和结块，请注意选择。4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液，孔径大于细胞直径，以去除团块和碎片。5. 细胞清洗和复苏，推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁)，减少细胞损失和聚集的白蛋白。6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成，在细胞分离过程中，DNase I可减少细胞团块形成。7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度，因此制备后应尽快处理悬浮液，最-好在30分钟内处理。8. 总之，在单细胞制备中，尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录(RT)抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时，最小化这些污染物，可能需要应用优化，例如，调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。

生命早期的免疫-微生物相互作用会影响机体罹患过敏、哮喘和其他炎性疾病的风险。研究表明婴儿肠道微生物组对免疫发育至关重要，尤其是婴儿前三个月。多项研究结果显示早期肠道微生物群失调与多种免疫介导的疾病相关。由于从婴儿中获得样本较为困难，因此对人类免疫发育了解的较少。母乳喂养可以引导健康的免疫-微生物相互作用关系。这种细菌与人类的共同进化在现代社会普遍性逐渐降低。人母乳中含有丰富的人乳低聚寡糖（human milk oligosaccharides HMO），由于人缺乏必需的葡萄糖苷酶，因此无法消化HMO。而双歧杆菌亚种Bifidobacterium longum subspecies (subsp.) infantis (B. infantis)是可以代谢HMO的菌株。B. infantis常见于免疫介导疾病发病率低的国家母乳喂养的婴儿中，如孟加拉国，但是在欧洲很少见。而引入该菌株则能够稳定重塑肠道微生物，减少肠道炎症的发生。近日，来自瑞典Karolinska 大学医学院的Petter Brodin团队在Cell 上发表题为Bifidobacteria-mediated immune system imprinting early in life 的文章。该文发现母乳通过促进双歧杆菌在婴儿体内定植，通过关键代谢产物ILA，促进CD4+T细胞向Treg和Th1方向极化，抑制黏膜炎症反应。作者首先收集了从2014年到2019年出生的208名婴儿共858个不同时间点的样本，通过质谱流式细胞术检测免疫细胞群中的激活和分化标志物。并同时定量分析了355种血浆蛋白含量。作者发现出生后4-7天循环中单核细胞达到峰值，Treg会在出生一周内数量不断增加。出生一个月后循环中的rdT细胞数量急剧增加。两个月时血浆中IL17A含量增加。这一现象跟小鼠断奶后细菌开始定植非常类似，但是小鼠体内细胞类型和蛋白类型以及变化时间不一样。进一步分析作者发现出生后一周，外周血中CD38+记忆CD4+T细胞开始占据主要细胞成分，这一细胞类型是黏膜特异性T细胞，主要位于肠道中。这表明在出生后，黏膜特异性记忆CD4+T细胞会在外周血中遇到抗原并扩增。为了检测免疫系统的变化与双歧杆菌的关系，作者比较了双歧杆菌丰度较高和丰度较低的婴儿。比较后发现双歧杆菌丰度较高的婴儿血浆蛋白中IL27 IL10以及内源性IL1抑制剂IL1RA，以及被认为是抗炎的非经典单核细胞和Treg的比例更高。而双歧杆菌丰度低的婴儿TNFα和IL17A这些肠道炎症的关键介质含量高。双歧杆菌的含量与激活的CD8+T细胞和促炎相关分子呈负相关。这种相关性不存在于缺乏双歧杆菌定植或者出生前一个月没有双歧杆菌定植的婴儿中，他们的全身和肠道炎症水平较高，激活的免疫细胞比例增加。已有研究表明双歧杆菌的代谢物可以调节AhR和NRF-2通路。为了检测HMO代谢使用的基因与双歧杆菌缺乏婴儿免疫系统之间的关系。作者评估了婴儿粪便中57个HMO代谢基因表达的丰度与355种血浆蛋白之间的相关性。分析发现IL6 TNFa IL17A IL13与HMO代谢使用基因丰度呈负相关，而HMO代谢基因高的婴儿IL27水平也高。接下来作者对比了喂食婴儿B. infantis EVC001和对照组之间的区别。作者发现双歧杆菌含量提升后，肠道中Th2和Th17的反应性降低，婴儿肠道炎症降低。双歧杆菌还可以促进CD4+T细胞向Th1方向发生极化以及IFNg表达上调。进一步分析发现双歧杆菌的代谢产物ILA可以诱导Th2和Th17细胞表达T细胞抑制性调节分子galectin-1。本研究细致阐明了在出生后的几周内，肠道定植微生物群引起的免疫系统的动态变化。母乳喂养中的HMO通过影响双歧杆菌定植通过关键代谢产物ILA抑制Th2和Th17诱导的炎症反应，促进Th1和Treg的细胞极化。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.05.030

近期，我国科学家团队在单细胞层面揭示了性别与衰老对外周血免疫细胞的影响，研究成果发表在《美国科学院院刊》（PNAS），标题为“Effects of sex and aging on the immune cell landscape as assessed by single-cell transcriptomic analysis”。　　研究人员采用单细胞RNA测序技术，对不同年龄与性别志愿者的外周血单个核细胞进行单细胞水平的转录组分析，首次在单细胞水平精确绘制了不同性别与年龄的外周血单个核细胞的免疫图谱。研究发现，在年轻人群中男女之间的免疫差异更集中在B细胞与单核细胞，而在老年人群中则主要集中在自然杀伤细胞（NK）。随着年龄增长，男女之间免疫细胞差异会增大，T细胞和B细胞在女性中更显“活性”，相关的激活信号通路富集更加明显。细胞通信分析显示，女性树突状细胞和B细胞之间BAFF/APRIL信号的增加，可能是女性B细胞介导自身免疫病更高发病率的原因之一，而男性则表现出更强的促炎相关通路。　　这项研究扩展了对人类免疫系统的认识，为探索性别与衰老在免疫性疾病发病机制中的作用提供了新的科学依据。 　　论文链接：　　https://www.pnas.org/content/118/33/e2023216118

博士Eric T. Ahrens表示，起初我们想观察这种技术联合作用对于新型细胞疗法的效果，而我们可以通过反馈细胞活性、改善剂量等途径来改善细胞疗法的效率；当前并没有有效的方法对人类机体中的细胞进行成像，早先可以利用基于金属离子的血管MRI对比制剂和放射性同位素来成像，但是其在体内就不能够对细胞进行有效区分了。hz-E10044 human soluble cluster of differentiation 28,sCD28 ELISAkit 人可溶性CD28(sCD28)检测试剂盒 hz-E10045 Human lymphocyte factor ELISAkit 人淋巴细胞因子检测试剂盒 hz-E10046 Human thymus activation regulated chemokine,TARC ELISAkit 人胸腺活化调节趋化因子(TARC/CCL17)检测试剂盒 hz-E10047 Human Neural cell adhesion molecule ligand 1,NCAM-L1 人神经细胞粘附分子配体1(NCAM-L1/CD171)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10048 Human Cobra venom neuronal protective factor,CVNPF ELISAkit 人神经保护因子(CVNPF)检测试剂盒 hz-E10049 Human soluble Tumor Necrosis Factorαreceptor,sTNFαR 人可溶性肿瘤坏死因子α受体(sTNFαR)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10050 Human soluble cytokine receptor,sCKR ELISAkit 人可溶性细胞因子受体(sCKR)检测试剂盒 hz-E10051 Human soluble Factor-related Apoptosis ligand,sFASL/Apo-1 人可溶性凋亡相关因子配体(sFASL)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10052 Human inhibitor of apoptosis,IAP ELISAkit 人细胞凋亡抑制因子(IAP)检测试剂盒 hz-E10053 Human colony-stimulating factor,CSF ELISAkit 人集落刺激因子(CSF)检测试剂盒 hz-E10054 Human monocyte interferon gamma inducing factor,MIGF 人γ干扰素诱导单核细胞因子(MIGF/CXCL9)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10055 Human Interferon inducible T-cell Chemoattractant,I- 人干扰素诱导T细胞趋化因子(ITAC/CXCL11)检测试剂盒 TAC ELISAkit hz-E10056 Human cluster Of differentiation,CDl4 ELISAkit 人CD14分子(CDl4)检测试剂盒 hz-E10057 Human apoptosis inducing factor,AIF ELISAkit 人凋亡诱导因子(AIF)检测试剂盒 hz-E10058 Human leukocyte common antigen,LCA/CD45 ELISAkit 人白细胞共同抗原(LCA/CD45)检测试剂盒 hz-E10059 Human cluster Of differentiation,CD4 ELISAkit 人CD4分子(CD4)检测试剂盒 hz-E10060 Human Placenta Cadherin,P-cad ELISAkit 人P钙黏蛋白/胎盘钙黏蛋白(P-cad)检测试剂盒 hz-E10061 Human Keratinocyte Growth Factor,KGF ELISAkit 人角化细胞生长因子(KGF)检测试剂盒 hz-E10062 Human Platelet-Derived Growth Factor-BB,PDGF-BB ELISAkit 人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)检测试剂盒 hz-E10063 Human CXC-chemokine ligand 16,CXCL16 ELISAkit 人CXC趋化因子配体16(CXCL16)检测试剂盒 研究者表示，这项研究中他们利用全氟碳化合物(PFC)示踪技术和非侵入性磁共振成像成技术进行结合来直接检测标记细胞的氟原子，自然状态下氟原子在机体中的浓度极低，这就可以利用MRI技术对氟标记的细胞进行观察；而本文中研究者首次通过患者的白细胞制备了被修饰和标记的树突细胞，随后研究者将这些细胞注入到4期结直肠癌患者的机体中来刺激机体抗癌T细胞免疫反应。

随着生物医学研究的不断深入，科学家希望解决长久以来的一个经典挑战，即如何简单、有效且高质量地分选细胞。NanoCellect WOLF系列微流控细胞分选仪正由此而来，致力于帮助每一位科学家实现更轻松高效、细胞状态健康的细胞分选。NanoCellect新款WOLF G2微流控细胞分选仪大大扩展了传统细胞分选的能力，兼具性能灵活和简单易用的产品特性，是现代生物医学研究领域的理想之选。WOLF G2微流控细胞分选仪的优势基于微流控芯片的流体技术WOLF G2利用专有的微流控分选芯片进行批量分选和单细胞置板，比传统的高压力细胞分选仪更温和，通过实现小于2psi的分选压力，使分选后的细胞保持活力和RNA的完整性。此外，无气溶胶的一次性微流控芯片便于无菌分选，是目前市场上生物安全性最佳的分选工具之一。高配置的光学系统WOLF G2使用基于激光的流式细胞仪技术，同时配备典型的前向（FSC）和后向（BSC）散射探测器，以及3种不同的激光配置来扩大应用性能。简单直观的WOLFViewer软件WOLF G2通过WOLFViewer软件，让工作流程简单直观且兼具齐全的功能。此外，WOLF G2的关机和清理时间仅需不到一分钟，更大程度地为使用者节约时间。灵活高效的性能WOLF G2的功能规格保证了产品应用最大的灵活性，不仅能够分辨淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，以及小至1微米的微生物细胞和大至60微米的细胞，还能实现最高200个细胞/秒的分选速度。精致小巧的体积WOLF G2台式微流控细胞分选仪的体积仅为2立方英尺，占用空间小，可以轻松实现实验室之间的灵活移动。WOLF G2微流控细胞分选仪立足细胞分选前沿科技最新的WOLF G2台式微流控细胞分选仪通过使用两个激光和多达九种颜色，显著扩展了这种温和的台式微流控细胞分选仪的分选能力，同时还保持着简单的批量分选或单细胞置板工作流程。将WOLF G2与N1单细胞分配器结合使用时，即可在96孔或384孔板中完成单细胞分选。WOLF G2台式微流控细胞分选仪更可广泛应用于多个生物医学研究领域，帮助科研人员在基因组学、抗体发现、细胞系开发、基因编辑等方向实现更易于使用、经济灵活的细胞分选。

随着蛋白质组学的迅速发展，基于质谱技术的蛋白质组学分析已经在建立表型和蛋白质水平的联结中作出了贡献，这些研究工作包括绘制组织和细胞特异性蛋白质组成等。然而，转录后、翻译后蛋白加工数据，以及mRNA剪接与修饰相结合导致蛋白质多样性数据并不完备。　　近日，发表在Science上的一项题为“The Blood Proteoform Atlas: A reference map of proteoforms in human hematopoietic cells”的研究中，来自美国西北大学的科学家绘制了人类血细胞蛋白图谱，并进一步研究了蛋白图谱的临床应用价值。研究团队首先通过流式分选获得所需的细胞，共收集了21种人造血细胞和血浆。分析发现共捕获29620种Proteoform（蛋白形态数量总和），数据集比对发现Proteoform是细胞类型更好的标志物。通过对肝移植患者的外周血单核细胞蛋白图谱的应用，发现该血细胞蛋白图谱可以作为临床研究和治疗相关的蛋白质信息。　　本研究通过绘制人血液、造血细胞蛋白图谱，对人体中存在的蛋白成分有了进一步认识。并且通过分析特定临床背景下蛋白图谱，证明了其潜在的临床应用价值。这些针对细胞和分子特异性的研究有助于推进蛋白质水平诊断的发展。　　论文链接：http://doi.org/10.1126/science.aaz5284

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等信息物质在细胞间转运的载体, 是细胞与细胞间通讯的重要媒介，参与大量正常生理和病理过程，包括感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管和其他炎症性疾病、癌症和凝血障碍等，因此研究EV在人类健康和疾病中的作用具有重要意义。EVs常分为三类外泌体 (30-150 nm) ，在胞体内区室中形成多囊泡小体，随后与质膜融合后从细胞中释放。微囊泡或微粒 (100-1000 nm) ，这是质膜起泡/出芽以及随后从细胞中释放的结果。凋亡小体 (1000-5000 nm) ，由凋亡细胞释放。目前还没有特异性标记物可以最终鉴定不同类型的囊泡。因此，我们把这些小的生物颗粒统称为细胞外囊泡。细胞外囊泡示意图EVs检测研究表明，不同疾病状态下，组织器官释放到体液中的EVs的数量及所包裹的物质是完全不一样的，因而通过检测分析EVs的特性即可对相关疾病进行精准诊断、预后判断及指导治疗。EVs具有尺寸小、异质性高且数量巨大等特点，一直以来，检测灵敏度都是EVs研究中的一个重大挑战。虽然一些关于EVs的检测是利用传统流式细胞术开展的，但也暴露出了明显的局限性，一方面由于传统流式仪器更适用于检测细胞，而细胞表面结合的荧光分子数量远远多于EVs表面；另一方面，一些传统流式仪器在检测小于500 nm单个颗粒上表现吃力。因此，想要准确的检测EVs，就需要更强大且具备高通量功能的检测工具。Amnis® 成像流式的技术优势近年来，随着Amnis® 成像流式技术的发展，越来越多的研究利用这项技术解决了EVs检测这一难题。Amnis® 技术的核心是使用时间延迟积分CCD (TDI-CCD)进行信号检测。与光电倍增管(PMT)相比，CCD具有更大的动态范围、更低的“噪声”和更高的量子效率，使其更适合测量微弱信号。与传统流式细胞术相比，这种方法信号整合时间更长，噪音低，灵敏度大幅增加，对研究EVs具有独特的优势。Amnis® 技术EVs应用案例分享以下研究体现了Amnis® 成像流式技术在小颗粒检测中的高灵敏度特点。检测脂质体和微球流式技术对比用常规流式技术 (A-B)和成像流式技术 (C-D)获得的200 nm大小的荧光标记脂质体和不同尺寸的聚苯乙烯珠(220、450、880和1300 nm)。Amnis® 成像流式可以清晰地分辨出缓冲液背景信号(灰色)以上的所有脂质体(粉色)，而常规流式仅能通过荧光分辨出一小部分脂质体。健康人类供体的血浆微粒检测(a)从6名健康供体中获取无血小板血浆，并使用CD235(红细胞)、CD41(血小板)、CD45(白细胞)和CD146(内皮细胞)标记物进行染色以确定微粒细胞的来源。(b)利用CD14(单核细胞)、CD66b(中性粒细胞)和CD3(淋巴细胞)标记物进一步对白细胞微粒进行表型分析，以确定其来源细胞。下方是图库中事件的代表性图片。(c)表为N = 6例供体的绝对计数±SEM。如图所示，Amnis® 成像流式技术可实现不同来源的外泌体的精准鉴定与计数。单核细胞内化外泌体检测(a)用Amnis® 成像流式技术分析PKH67标记的外泌体。BF和FITC荧光图像(E)所示。(b) PKH67预标记外泌体与外周血单个核细胞共孵育。使用Amnis® IDEAS® 软件内化功能测量外泌体的内化程度。Amnis® 成像流式技术不仅实现了PKH67标记的外泌体鉴定，同时也实现了单个核细胞内化外泌体检测，且呈现直观图像佐证结果准确性。小结综上，Amnis® 成像流式技术做到了真正意义上的流式数据可视化。既具备传统流式可大量检测样本的特点，又利用高灵敏度TDI-CCD技术针对每个检测到的外泌体颗粒进行成像，并可通过海量形态学数据分析EVs与亲本细胞或靶细胞间的相互作用。Cytek® Amnis® ImageStream® x Mk II 成像流式细胞分析仪以上研究均通过 Cytek® Amnis® ImageStream® X Mk II 仪器完成。通过将流式细胞术的表型分析能力、高速度和高灵敏度等优势，与荧光显微镜技术在细胞形态学细节的洞察力和针对细胞功能研究的深度有机结合在一起，Amnis® ImageStream® XMk II 平台可高速获取每个细胞的多个图像，包括明场、暗场 (SSC) 和多达 10 色荧光标记。ImageStream® X Mk II 通过高分辨率成像，可以定位荧光蛋白表达位置（细胞膜、细胞质或者细胞核），实现超乎想象的广泛应用需求。技术特点应用广泛：样本利用率高达 95%，可以更高效的方式分析稀有细胞。简单易用：简单友好的用户界面，可实时观察全部细胞图像和统计学数据。配置灵活：最高可升级至 6 根激光器。功能强大：提供数百种量化成像分析参数，实现无与伦比的广泛应用。参考文献：Erdbrügger, Uta, and Joanne Lannigan. "Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques." Cytometry Part A 89.2 (2016): 123-134.Headland, S., Jones, H., D'Sa, A. et al. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry. Sci Rep 4, 5237 (2014). https://doi.org/10.1038/srep05237.Clark, R. Imaging flow cytometry enhances particle detection sensitivity for extracellular vesicle analysis. Nat Methods 12, i–ii (2015). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.380.Gurunathan, S. Kang, M.-H. Jeyaraj, M. Qasim, M. Kim, J.-H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells 2019, 8, 307.https://doi.org/10.3390/cells8040307.

白细胞介素- 1（interlenkin 1，1L-1）的间接作用，可使内毒素引起机体发热。本篇文章介绍IL-1的受体分泌及调节介绍。IL-1的受体有两种：IL-1RⅠ和IL-1R Ⅱ。三种IL-1都能与受体结合，IL-1Ra与受体结合后不引发信号转导效应，但可抑制IL-1α和IL-1β同受体结合。上述两种受体常常表达在同一细胞中，但不同的细胞仅优势表达某一种受体。IL-1RⅠ是相对分子质量为80000的糖蛋白，人的基因位于2号染色体长臂上。主要表达在内皮细胞、平滑肌细胞、T细胞，肝细胞、成纤维细胞、角质细胞和表皮树突状细胞等。IL-1RⅠ高度糖基化，阻止糖基化会降低其生物学活性。IL-1R Ⅰ的胞质内肽链较长，并参与信号转导，与Toll受体的胞质区显著同源，故称为Toll/白细胞介素同源区域（Toll /in-terleukin-1 homologous region，TIR），缺乏酪氨酸激酶的活性。人IL-1R Ⅰ mRNA约5kb，编码569个氨基酸残基，细胞外320个氨基酸残基构成3个免疫球蛋白样功能域，跨膜区有19个氨基酸残基，其余230个氨基酸残基在胞质内。IL-1受体辅助蛋白（interleukin-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）其胞外和胞质结构域与IL-1RⅠ具有同源性，IL-1与IL-1RⅠ结合亲和力较低，可使构象发生改变，并被IL-1RAcP识别，参与受体复合物的形成，能够增强其亲和力，使之发挥生物学效应。IL-1RⅡ主要表达在B细胞、单核细胞和中性粒细胞中。IL-1R Ⅱ的 mRNA约1803bp，编码386个氨基酸残基，是相对分子质量为68000的糖蛋白。该蛋白质含有5个糖基化位点，经过N-糖苷酶处理使糖链分解后，相对分子质量为55000。IL-1RⅡ细胞外的332个氨基酸残基构成3个免疫球蛋白样功能域，其胞内只有很短的29个氨基酸残基，没有信号转导功能。用抗IL-1RⅡ抗体不能阻止IL-1的信号转导，用抗IL-1RⅡ抗体能够有效地阻止IL-1的信号转导。IL-1RⅡ是一个诱骗分子，可为IL-1的自身负反馈。将IL-1RⅡ的细胞外部分与IL-1RⅠ的胞质内部分嵌合构建的嵌合受体能够与IL-1结合并能转导信、号效应。可溶性IL-1受体：健康人和某些病理组织液中可检查到IL-1R Ⅰ和 IL-1RⅡ的胞外结构部分为可溶的IL-1受体，但其具体的生物学作用不是很清楚。IL-1的信号转导途径用图9-1表示。

就像外来非洲杀人蜂(Africanized honey bees)，工蜂像大多数肿瘤细胞，而蜂王是癌症干细胞。蜂王可以重新再生整个杀人蜂群体，但其生存依赖蜂王浆。如果去除蜂王浆，蜂王死亡和整个杀人蜂群也会被杀死，而研究发现Th22源性IL-22就是蜂王浆。HZA007Po ELISA Kit for Angiogenin (ANG) 猪血管生长素(ANG)检测试剂盒 HZA147Po ELISA Kit for Adiponectin Receptor 1 (ADIPOR1) 猪脂联素受体1(ADIPOR1)检测试剂盒 HZA153Po ELISA Kit for Alpha-Fetoprotein (aFP) 猪甲胎蛋白(αFP)检测试剂盒 HZA062Po ELISA Kit for Interleukin 16 (IL16) 猪白介素16(IL16)检测试剂盒 HZB650Po ELISA Kit for Major Basic Protein (MBP) 猪主要碱性蛋白(MBP)检测试剂盒 HZA225Po ELISA Kit for Atrial Natriuretic Peptide (ANP) 猪心钠肽(ANP)检测试剂盒 HZA172Po ELISA Kit for Platelet Factor 4 (PF4) 猪血小板因子4(PF4)检测试剂盒 HZA164Po ELISA Kit for Ubiquitin (Ub) 猪泛素(Ub)检测试剂盒 HZA164Si ELISA Kit for Ubiquitin (Ub) 猴泛素(Ub)检测试剂盒 CEA968Po ELISA Kit for Aprotinin (AP) 猪抑肽酶(AP)检测试剂盒 HZA263Po ELISA Kit for Creatine Kinase, Mitochondrial 1A (CKMT1A) 猪线粒体肌酸激酶1A(CKMT1A)检测试剂盒 HZA083Po ELISA Kit for Leptin Receptor (LEPR) 猪瘦素受体(LEPR)检测试剂盒 HZA085Po ELISA Kit for Leukemia Inhibitory Factor (LIF) 猪白血病抑制因子(LIF)检测试剂盒 HZA088Po ELISA Kit for Monocyte Chemotactic Protein 2 (MCP2) 猪单核细胞趋化蛋白2(MCP2)检测试剂盒 HZA267Po ELISA Kit for Cathepsin K (CTSK) 猪组织蛋白酶K(CTSK)检测试剂盒 HZA274Po ELISA Kit for Insulin Like Growth Factor Binding Protein 6 猪胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)检测试剂盒 (IGFBP6) HZA093Po ELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 1 Beta (MIP1b) 猪巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)检测试剂盒 HZA095Po ELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 3 Alpha (MIP3a) 猪巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)检测试剂盒 HZA096Po ELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 3 Beta (MIP3b) 猪巨噬细胞炎性蛋白3β(MIP3β)检测试剂盒 CEA097Po ELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 1 (MMP1) 猪基质金属蛋白酶1(MMP1)检测试剂盒 HZA098Po ELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 10 (MMP10) 猪基质金属蛋白酶10(MMP10)检测试剂盒 HZA277Po ELISA Kit for Connexin 43 (CX43) 猪间隙连接蛋白43(CX43)检测试剂盒 HZA099Po ELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 13 (MMP13) 猪基质金属蛋白酶13(MMP13)检测试剂盒 HZA302Po ELISA Kit for Galectin 2 (GAL2) 猪半乳糖凝集素2(GAL2)检测试剂盒 HZA304Po ELISA Kit for Galectin 4 (GAL4) 猪半乳糖凝集素4(GAL4)检测试剂盒 Th22是一种免疫细胞类型T细胞的子集，通常情况下，T细胞是免疫系统的“士兵”，杀死肿瘤细胞。在结肠癌的情况下，研究人员发现，Th22作为肿瘤的辅助，实际上支持细胞变得能够再生（肿瘤干细胞的标志之一）。

细胞内有数以亿计的碱基、表达程序以及运行策略，而且各不相同。单细胞测序技术可解读单个细胞里的这些信息，但人工干预多、过度依赖人为选定的标记基因使得单细胞测序技术对细胞的注释稳定性较低。可以理解为，同一类细胞用不同的模型解析，结果不同，对一些特殊细胞“公说公有理婆说婆有理”的分析结果往往难以得到广泛认可。解决上述问题的关键是减少人工干预。9月27日，《自然》子刊《自然机器智能》刊载了我国团队首创的单细胞转录组细胞类型注释算法。该算法可以将细胞中的信息转变为计算机能够理解和学习的“语言”，让计算机和细胞直接“对话”，减少人为因素影响。细分细胞亚型，准确度提升7%据算法研发团队腾讯人工智能实验室方面介绍，新算法，即scBERT模型，对最难分类的外周血单核细胞进行了分类，结果显示人工智能能够做到精准标注、注释极其难区分的两类细胞，例如能够准确区分CD8+细胞毒性T细胞和CD8/CD45RA+T细胞。研发团队成员告诉科技日报记者，“在极具挑战的外周血细胞亚型细分任务上，新算法相较现有最优方法的70%准确度再提升了7%。”此外，团队还在已有的单细胞数据集中，将新算法的性能与其他算法进行了对比，这些数据集涵盖17个主要器官或组织、包含50多个细胞类型、超过50万个细胞。论文中显示，对于每个数据集，团队均采用了五倍交叉验证策略，以避免随机结果对结论的影响。结果显示，新算法对大多数数据集的分析结果在精确度和综合得分方面均表现优异。研发人员表示，针对不同的单细胞分析任务和数据集解析任务，都会有不同的算法成为最佳算法，也就是说有的算法擅长某几类任务，有的算法擅长另几类任务，无法通用，而基于scBERT模型的新算法则表现了很强的通用性，在全部的数据集解析任务中均被列为最佳算法。跨界使用“工具”，让机器读懂细胞语言那么，新算法为什么能让机器通过学习读懂细胞中的复制、翻译、转录的语言呢？相关研发人员解释，“我们首次将‘transformer’运用到单细胞转录组测序数据分析领域。 transformer这种架构从发明以来一直被用在自然语言处理领域，用于进行诸如机器翻译类的工作，成为比较通用的一个框架组件，但我们将它运用到了细胞注释领域。”得益于对计算机处理人类语言和单细胞信息之间的共性理解，团队将已经成熟的人工智能架构进行创新性地“跨界”使用，大大提升了细粒度单细胞分子图谱的构建效率。“跨界工具”让新模型赋予计算机读懂细胞活动的基础，但要想读得准、读得透、读得精，还需要基于大规模的语言预训练。论文显示，为了解决来自不同项目、测序平台的数据难以互通有无的难题，“scBERT” 模型在预训练数据上没有做任何的降维或筛选处理，最大程度上保留数据本身的特性和信息，并学习了包含不同实验来源、批次和组织类型的单细胞数据，以保证模型理解“通用”的知识，不仅捕获单个基因的表达信息还理解基因间的协作。据介绍，该技术可以给生物体中每个细胞都印上专属“身份证”，“单细胞身份证”的应用不仅可以助力疾病致病机制分析、药物靶点发现等基础研究，也可以在临床上高精度地“刻画”肿瘤微环境，推动精准治疗的进一步完善。

免疫治疗是非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治疗方法之一。虽然肿瘤突变负荷（Tumor mutational burden，TMB）与免疫治疗的响应应答相关，但是免疫应答与肿瘤基因型之间的关系还知之甚少。2021年11月11日，美国西奈山伊坎医学院Miriam Merad研究组与Ephraim Kenigsberg研究组合作发文题为Single-cell analysis of human non-small cell lung cancer lesions refines tumor classification and patient stratification，通过建立病人非小细胞肺癌中肿瘤细胞的scRNA-seq以及CITE-seq分析，确定了肿瘤突变负荷以及TP53突变的情况，从而构建了NSCLC肿瘤的细化分类以及患者分层，为免疫疗法的响应提供了新的数据库参考。为了对肿瘤微环境中的免疫细胞的转录状态进行检测，作者们对未进行治疗的、早期的NSCLC患者体内的肿瘤进行切除并对细胞进行分析（图1）。作者们通过CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing）、scRNA-seq以及TCR-seq（T cell receptor sequencing）整合免疫细胞表面标记的抗体分析生成了三个数据库。作者们对8名患者的肿瘤和非肺部组织进行了CITE-seq，对另外27名患者进行了scRNA-seq。CITE-seq中采用了15个用于注释细胞类型的抗体，并最终扩展到81个抗体进行更具体的研究。除此之外，作者们的还对三名患者进行了scRNA-seq/TCR-seq的联合分析。图1 对病人NSCLC肿瘤组织的CITE-seq、scRNA-seq以及TCR-seq分析总的来说，来自35个肿瘤和29个相匹配的非肺部样本中的361,929个单细胞被分为30个注释的转录状态细胞群。基于RNA的聚类分析，作者们共鉴定除了49个免疫细胞群体，包括T细胞、B细胞、浆细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞以及单核吞噬细胞等。CITE-seq数据使用成熟的蛋白质细胞标记物进一步确认了细胞身份。为了确定组织取样是否会导致分析结果的差异，作者们对8名患者的每个肿瘤的三个不同区域进行了取样对比分析。作者们发现免疫细胞表型的差异主要是由肿瘤之间的差异而非区域取样差异造成的。因此，肿瘤微环境中的特征稳健且可重复，促使作者们进一步分析其中转录状态的差异与肿瘤分型之间的关系。通过对肿瘤的scRNA-seq以及CITE-seq分析，作者们发现肿瘤中树突细胞（Dendritic cells，DC）组分主要包括cDC1、cDC2、富含调控因子的成熟mregDC以及DC3类型（图2）。其中DC3是肿瘤中最普遍存在的DC亚型，并且在肿瘤中数量会增加，而mregDC是最为罕见的类型。先前的研究表明mregDC的激活对于诱导肿瘤定向T细胞应答至关重要，因此作者们想对单个载玻片上的肿瘤样品进行连续免疫组化染色，研究检测mregDC在肿瘤中的分布【1】。作者们发现在靠近T细胞的三级淋巴结构区域（Tertiary lymphoid structures，TLS）存在MYH11+滤泡树突状细胞的聚集。TLS结构的形成有助于患者接受免疫疗法以及预后【2,3】。通过对DC3细胞类型的分析，作者们发现DC3的特征介于单核细胞样细胞和cDC2样细胞之间。另外，通过基因表达的差异分析作者们鉴定发现一个DC模块基因mod28富集表达在肿瘤病灶区域，其中包括CD1A以及CD207基因表达，这些基因标记出LCH（Langerhans cell histiocytosis）朗格汉斯细胞组织细胞增生症细胞，因此作者们又将该细胞群的分类名称为LCH-like细胞。随后作者们对NSCLC中的T细胞进行了细致分类。CITE-seq对T细胞的分析鉴定发现CD8+细胞具有自然杀伤细胞样（Natural killer-like）特征，另外也有多种因子表达的激活型T细胞等。除此之外，通过对病人体内的NSCLC肿瘤进行配对的scRNA-seq/TCR-seq分析，作者们发现激活型T细胞是肿瘤中存在最多的类群，而且与非肺部组织相比肿瘤内包含多种类型的T细胞，比如激活型T细胞、周期型T细胞以及调节型T细胞等。作者们对的肿瘤中免疫细胞的数量进行分析后发现，B细胞和浆细胞的数量在肿瘤中都出现了显著的升高，但是B细胞与浆细胞之间的比例相对来说是比较稳定的。为了建立起细胞表型驱动病人多样性的关联，作者们希望对细胞类型出现频率进行归一化分析。通过该分析，作者们发现激活型T细胞、IgG+浆细胞以及MoMΦ-II细胞对于肺癌的出现具有很高的相关性。因此，作者们将该细胞组成称为肺癌激活模块（Lung cancer activation module，LCAM）。作者们可以根据肿瘤免疫微环境中存在的免疫细胞的类型对病人进行分型，与已有的聚类方法Seurat【4】相比LCAM分型方法具有很高的准确性和稳健性，对其他独立于本工作的数据库【5】进行测试也可以确认该LCAM分类方法具有很高的可重复性。作者们发现LCAM评分与病人吸烟的情况具有相关性，该细胞模块的表达是对突变和异位表达的肿瘤抗原的适应性反映的标志。而且，LCAM与TP53突变负担也存在相关性，TP53突变的肿瘤与TP53野生型的肿瘤相比，LCAM评分更高。而且TP53的突变与肿瘤突变负担也存在相关性。为了鉴定这些发现在其他肿瘤中是否具有普适性，作者们在肺鳞状细胞癌中也进行了相似的分析，发现肺鳞状细胞癌中也表现出较高的LCAM评分水平。因此，LCAM与肿瘤突变负担相关，可能可以作为特异性免疫检查点阻断反应的非冗余生物标志物。 工作模型总的来说，该工作通过对35个NSCLC病人中相匹配的肺部肿瘤与非肺部组织的scRNA-seq、CITE-seq以及TCR-seq，构建了迄今为止最大的早期肺癌免疫反应细胞图谱，并通过对其中免疫细胞类型的分析建立了对NSCLC肿瘤进行详细分型的LCAM模块，LCAM评分较高说明患者正在经历一个更有力的抗原特异性抗肿瘤适应性免疫应答过程，同时说明LCAM可以作为更直接的衡量抗原特异性抗肿瘤免疫激活的指标。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.10.009

细胞的3D模型培养能够更好地模拟微环境、细胞间相互作用和体内生物过程。相较于生化检测和2D模型，3D模型可提供更具生理相关性的条件。此外，其形态学和功能分化程度更高，这也赋予了它们更接近体内细胞的特征。如今越来越多的研究人员正在应用3D细胞培养、微组织和类器官技术来填补2D细胞培养与体内动物模型之间的差距。 特别是类器官的研究和使用，类器官（Organoid）是源自干细胞的体外衍生3D细胞聚集体，具有类似器官结构和功能。近年来，3D类器官培养技术逐渐成熟，正在成为药物筛选、个性化治疗和发育研究的重要模型。然而，细胞的3D培养技术面临着诸多挑战：首先，培养一致的、可再现的3D 微组织十分困难，尤其是类器官的培养；此外，大而厚的细胞样品成像难度极高；同时，处理3D细胞实验产生的海量数据则是最为严峻的挑战。针对3D微组织样品，使用传统的冰冻切片染色成像或直接使用共聚焦显微镜进行成像都有很多挑战：冰冻切片成像无法获得立体样品的全部信息，特别是Z轴的细胞位置信息；共聚焦显微镜有较高的光毒性和光漂白，不能对立体样品反复多层的成像，成像的层数有很大限制；此外，这两种拍摄方法获取的大量图片还需借助其他分析软件对其数据进行分析和统计，分析通量很低；最重要的是，这两种方法扫描速度都很慢，通量很低，一个3D微组织的扫描分析时间长达几个小时，极大的限制了3D微组织研究的开展。高内涵细胞成像能够在保持细胞结构和功能完整性的前提下，对细胞和亚细胞层次进行多通道、多靶点的荧光全面扫描，检测细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节，在单一实验中获取大量相关信息。在细胞凋亡、细胞周期、细胞毒作用、受体蛋白转位、蛋白相互作用等方面都有很好的应用，被证明是细胞生物学，癌症研究，病原生物学，药物研发，系统生物学，心血管疾病研究，干细胞研究，神经细胞研究等领域的重要研究工具。PerkinElmer公司提供的高内涵细胞成像分析系统，它采用Nipkow转盘扫描技术配以高灵敏度sCMOS探测器，能够快速捕捉到细胞内发生的生物学过程，更因其降低光漂白和光毒性的特点，配合水浸式高数值孔径物镜，可以实现对活细胞、小型模式生物和3D微组织样品进行高通量的共聚焦高分辨率成像。再结合强大的Harmony分析软件，能够对细胞和亚细胞层面各种复杂的表型进行群体性统计分析研究。该系统在细胞生物学研究领域有着非常广泛的应用。PerkinElmer高内涵系统的3D方案不仅仅局限于3D微组织，包括模式生物、细胞伪足等立体结构都可以通过高内涵系统完成全面的检测和分析： 珀金埃尔默的单细胞ICP-MS技术，基于业界最快的的细胞脉冲信号读取速度（可达100000点每秒），能定量单个细胞中低至阿克级别的金属和纳米颗粒含量，测定细胞群中金属质量分布和含金属细胞的数量，从而评估与量化细胞群的异质程度。适用于人体、动物、植物等各种组织器官细胞的深入研究。例如，含金属药物和纳米颗粒越来越广泛的应用于癌症的治疗和检测，单细胞ICP-MS可进行精细跟踪，掌握病变组织在细胞层面上对药物的吸收和代谢，有助于了解癌症机理和提升治疗水平。两株卵巢癌细胞系A2780（ 顺铂敏感型）和A2780/CP70 （顺铂耐药型）随时间变化顺铂摄入量 生物体中的铜含量通过非常有效而复杂的稳态机制得以严格调控，该机制可控制元素的吸收、分布和排出。目前数据得到的细胞铜稳态模型只是一个“骨架” ，用SC-ICP-MS来测量外周血单核细胞（PBMC）中的铜（Cu）含量，对了解稳态机制的失调或失衡可能导致生物体功能异常，并可能与某些疾病（例如炎症、哮喘、衰老过程、癌症等）方面提供了进一步研究的有效手段。外周血单核细胞（PBMC）中铜的含量应用领域举例：3D微组织类器官目前的应用主要集中在肿瘤研究（药筛模型、药筛、肿瘤免疫、个体化医疗）、干细胞和发育生物学、体外模型研究（感染模型、毒性评价）、材料及给药研究等方面：肿瘤研究2019年6月17日，Cell Death and Disease杂志在线发表了钱其军研究组的研究成果Modified CAR T cells targeting membrane proximal epitope of mesothelin enhances the antitumor function against large solid tumor。该工作致力于优化肿瘤CAR T免疫疗法。MSLN（Mesothelin，间皮素）是嵌合抗原受体（CAR）T治疗的诱人抗原，MSLN中的表位选择至关重要。在这项研究中，作者使用修饰的piggyBac转座子构建了两种针对MSLN的I区（meso1 CAR，也称为膜远端区域）或MSLN的III区（meso3 CAR，也称为膜近端区域）的两种类型的CAR系统。其中，meso3 CAR T细胞在激活后表达更高水平的CD107α，并在体外针对表达多种MSLN的癌细胞产生更高水平的白介素2，TNF-α和IFN-γ。之后，作者构建了胃癌和卵巢癌3D肿瘤细胞模型，并用该模型来测试这两种CAR T系统，通过PerkinElmer Opera Phenix高内涵系统完成3D肿瘤 CART杀伤系统的成像和分析，最终证明在3D细胞水平，meso3 CAR T细胞比meso1 CAR T细胞具有更高的杀伤作用。后续的研究中，作者借助PerkinElmer Xenogen IVIS成像系统，在胃癌NSG小鼠模型中进一步进行验证，同样证明与meso1 CAR T细胞相比，meso3 CAR T细胞介导的抗肿瘤反应更强。我们进一步确定meso3 CAR T细胞可以有效地抑制体内大卵巢肿瘤的生长。总体而言，本研究证明meso3 CAR T细胞疗法在治疗MSLN阳性实体瘤方面比meso1 CAR T细胞疗法具有更好的免疫疗法，为实体瘤的免疫治疗提供了新的有效的CAR T疗法。干细胞与发育生物学2018年11月，英国的格拉斯哥大学癌症科学研究所在Nature Communication杂志发表了名为《The Phospholipid PI(3,4)P 2 Is an Apical Identity Determinant》的文章，本文主要以MDCK囊肿为模型，研究了上皮细胞的极化机制，最终发现PI(3,4)P2磷脂酶是决定上皮细胞极化发生的重要分子，并阐明了其调控机制。在本文中，作者首先发现磷酸酯修饰酶PI(3,4)P2的分布在上皮细胞极化的过程中是至关重要的，接下来，他们用PI(3,4)P2的分布作为表型，筛选哪些蛋白的敲除影响其分布。该过程是通过PerkinElmer的Opera Phenix高内涵系统来实现的，作者先通过高内涵系统的预扫描成像功能对微球进行智能的层切式扫描，选取横截面最大的那一层，然后把细胞分区域，分细胞核、细胞质、内侧、外侧和细胞连接处等等，然后计算每个区域的荧光强度。作者使用此方法去分析一些突变过的微球的磷脂酶分布，发现一些重要的上游蛋白（如PIP蛋白）被敲掉后，会发生显著的定位变化。除此以外，作者还利用高内涵系统分析了微球的空腔表型，MDCK囊肿包含多少个空腔直接反映了其功能是否正常，只有极化正常发生的囊肿才能有正常的空腔。同样的，作者使用高内涵预扫描成像功能对所有球做了层切式扫描，选取有空腔的这些层，把它们压到一起，然后通过算法选出空腔，分析其数量。作者也用该方法做了一系列基因的筛选，筛选到几个显著影响空腔形成的基因，并在后续阐明了其调控机制。 体外模型研究——肝损伤模型2018年，王韫芳课题组在新刊Advanced Biosystems杂志上发表封面文章，研究展示一种新型的药物性肝损伤研究模型——LBS微肝球模型(Liver biomatrices scaffolds, LBSs)。该模型在HepaRG细胞的基础上引入天然脱细胞肝脏支架，可进行肝细胞的长期3D培养。在LBS提供的肝组织特异微环境下，新模型具有更高的生理相关性和毒理预测敏感度。作者使用PerkinElmer Operetta CLS 高内涵筛选系统，深入评估了8种抗抑郁药物的肝毒性。结合特定的染料组合，从细胞活力、凋亡、胆汁蓄积、脂肪变、氧化应激和线粒体毒性6个方面检测药物处理对微肝球模型的影响。其中的许多参数都使用了复杂的高内涵分析方法。结果证明LBS微肝球模型能高度特异预测药物肝毒性和协助进一步的毒理机制研究。本研究还用到了PerkinElmer的Engisht多功能成像酶标仪，研究利用Alamarblue法追踪不同培养条件下细胞活力的变化。PerkinElmer提供的分子及细胞水平检测方案贯穿本论文药物肝毒性研究的整个过程。从微肝球模型的细胞增殖、酶活分析，再到3D模型的功能验证和毒理学多指标分析，PerkinElmer均能提供针对性的应用方案。材料及给药研究2019年6月，爱尔兰都柏林大学学院生物与环境科学学院&康威研究所在Small杂志发表名为《A High‐Throughput Automated Confocal Microscopy Platform for Quantitative Phenotyping of Nanoparticle Uptake and Transport in Spheroids》的文章。该研究利用PerkinElmer高内涵Opera Phenix系统，构建了完整的在3D微组织层面研究纳米载体摄取和运输的模型。作者首先进行3D微组织培养和高内涵拍摄的优化，主要研究了培养条件和固定方法对不同浓度的基质胶的影响，并根据该实验结果确定了培养方法、固定方法和基质胶浓度及用量。此外，作者也通过顺式到反式高尔基标记物(GM130、GalT和TGN46)的分布染色考察了高内涵的拍摄质量，证明PerkinElmer高内涵系统确实有极高的分辨率，用来研究纳米颗粒的摄取情况是足够的。接下来，作者通过Harmony软件对层切扫描图片进行重构分析，获取最大亮度投影和3D重构视图，在此基础上定量测量球状体中NP吸收和渗透。最后，作者选择了在纳米颗粒胞吞作用中有功能的蛋白，通过RNAi沉默进行潜在基因筛选，确定该模型可用于评估3D微球NP的摄取和运输过程。 更多详细内容，欢迎您莅临8月4日在中国细胞生物学学会2020年全国学术大会上举办的午餐会，干货报告、午餐礼遇、惊喜礼品等您来参与。点击下方链接完成签到，即可在会议期间至珀金埃尔默展台（T3）领取精美礼品一份。http://suo.im/6tarYZ

红细胞，血小板，中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞。。。这些细胞不仅是我们体内循环系统中常见的细胞类型，在实验室中出镜率也非常高，我们统称它们为悬浮细胞。实际上，对于悬浮细胞的研究，尤其是分选和荧光定量，我们常用的技术手段是流式细胞术FACS。但尽管FACS能准确的进行悬浮细胞的单细胞荧光定量，如果我们想要知道单个细胞的形态变化，蛋白表达的位置信息，以及基于表型的高通量药物筛选，就需要高内涵成像分析系统的帮助啦。之前我们已经给大家介绍过珀金埃尔默高内涵系统实现红细胞变形的药物筛选方法，点下方可以回顾哟。往期回顾Nature Protocol——微球过滤结合高内涵成像实现基于红细胞变形的高通量药物筛选：https://mp.weixin.qq.com/s/2Kz3CDIqKVGbw17-ZyxutQ今天我们再来关注循环系统中一类很特殊的悬浮细胞：循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）。CTC是癌症病人体内由实体肿瘤病灶脱离而进入血管的肿瘤细胞，它们在外周血中痕量存在，大部分也会发生凋亡和被吞噬，但依旧有少数隐藏极好并伺机而动发展为肿瘤转移灶，因此是肿瘤发生恶性转移的凶手之一（图1）。 CTCs在血管中的“命运”大量研究表明，CTC在外周血中以不同形态存在，有游离的单个CTC，也有聚集成团的CTC集簇。而它们形成集簇的能力更是与肿瘤的转移密切相关。今年1月Cell杂志就在线发表了瑞士Basel大学Aceto团队关于乳腺癌病人血中CTC单兵作战和团体作战的相关工作。通过全景观基因测序，他们解释了CTC集簇比起单细胞缺少了关键位点的DNA甲基化重建，因此更容易导致肿瘤的恶性转移。进一步利用Operetta高内涵成像及Columbus分析系统，对CTC成像后集簇的大小及相关功能进行定量分析，试图找到解离CTC集簇使其变为单兵作战从而失去转移能力的方式。幸运的是，通过高内涵筛选他们从2485个FDA批准的药物中找到了一种钠/钾ATP酶抑制剂，可以解离CTC集簇成为单细胞（图2），继而诱导DNA甲基化，最终抑制肿瘤的转移。基于细胞存活率和集簇大小的高内涵药物筛选尽管CTC是外周血悬浮细胞中的稀有事件，但是作为具有高灵敏度，高通量和高速度的表型筛选领导者，PerkinElmer高内涵成像分析系统一如既往的表现出了强大的助力作用，从未让科研工作者失望过。表型筛选，我们是认真的。参考文献1. Gkountela, S., Castro-Giner, F., Szczerba, B. M., Vetter, M., Landin, J., Scherrer, R., Krol, I., Scheidmann, M. C., Beisel, C., Stirnimann, C. U., Kurzeder, C., Heinzelmann-Schwarz, V., Rochlitz, C., Weber, W. P., and Aceto, N. (2019) Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding, Cell 176, 98-112 e114.2. Mocellin, S., Keilholz, U., Rossi, C. R., and Nitti, D. (2006) Circulating tumor cells: the ' leukemic phase' of solid cancers, Trends in molecular medicine 12, 130-139.

前言人类严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒(SARS-CoV-2) 感染会导致多种临床表现，从无症状疾病到急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 和多器官衰竭。除了病毒对呼吸系统和其他器官的直接损伤外，越来越多的证据表明，由 SARS-CoV-2 感染引起的免疫反应有助于冠状病毒病 (COVID-19) 的病理生理学，尤其是在严重的疾病过程中。CD4+ T 辅助细胞和 CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 都有助于控制呼吸道病毒感染。T 细胞免疫反应与 COVID-19 期间疾病结果之间存在复杂的关系。微环境中存在的其他因素可能会影响 T 细胞反应的质量，从而影响病理学。因此，重要的是确定哪些 T 细胞亚群具有致病作用？2022年02月，德国柏林夏里特医学院研究团队在 Cell期刊（IF：66.850）发表了题为 &ldquo Complement activation induces excessive T cell cytotoxicity in severe COVID-19&rdquo 的研究成果，采用单细胞蛋白质组学(CyTOF)和单细胞转录组学研究方法，评估COVID-19重度过程中致病T细胞的功能和诱导信号，发现了患者体内的补体激活可使其T细胞过度毒性。表明T细胞毒性加剧和补体激活使得COVID-19患者患重度疾病或死亡的风险增大。研究背景本篇作者将单细胞蛋白质组学和转录组学与机制研究相结合，揭示 T 细胞区室的改变及它们的上游信号和功能相关性，解释了在严重 COVID-19 中观察到的重要免疫病理学特征。大规模细胞术（飞行时间细胞术 [CyTOF]）和单细胞 RNA-seq(scRNA-seq) 结合基于 VDJ 测序 (VDJ-seq) 的 T 细胞克隆型鉴定用于确定 COVID-19 和严重程度-T细胞区室的特异性改变。作者描述了 C3a 驱动对COVID-19 重症患者的活化 CD16 表达细胞的诱导。这些 T 细胞表现出增加的免疫复合物介导的、不依赖于 TCR 的细胞毒性，导致肺内皮细胞激活和释放趋化因子。这种机制可能导致 COVID-19 患者出现严重的肺损伤和内皮炎。研究思路研究结果1.严重的 COVID-19 中表达CD4 +、CD8 + TCRab +和 TCRgd + T 细胞作者对急性和恢复期的轻度和重度 COVID-19 患者、患有其他急性呼吸道感染（流感样疾病）的患者以及慢性感染人类免疫缺陷病毒 (HIV) 或乙型肝炎 (HBV) 和对照组（图1A）。为了进一步探究 T 细胞空间，将获得的 T 细胞（CD45 + CD3 +CD19 - CD15 -）预先门控到 CD4+T 辅助细胞（CD3 +，CD8 - TCRgd -），CD8 +CTLs（CD3 +，CD8 + TCRgd - ) 和 TCRgd + (CD3 - , CD8 - TCRgd + ) 细胞使用 29 种表面抗原标记。对来自对照、FLI、HIV、HBV 和急性 COVID-19 的样本进行无监督聚类分析，对预先门控的 T 辅助细胞、CTL 和 TCRgd 进行分区T 细胞分别分为 19、15 和 14 个单独的细胞簇（图 1 B-1D）。来自轻度或重度 COVID-19 患者的大部分细胞在统一流形逼近和降维投影 (UMAP) 空间中与其他患者组或对照组的细胞明显分离（图 1B）。与其他组相比，轻度和重度 COVID-19 患者的簇 25 T 细胞（CD8 + CD38 hi HLA-DR +Ki67 +）的比例增加（图1D 和 1E）。重症 COVID-19 的进一步特征是簇 26 T 细胞（CD8 +，高度活化的 NKT 样细胞）的丰度增加，也表达高水平的 CCR6 和 CD16。图1 | HLA-DR hi CD38 hi高度活化但也表达 CD16 的 CD4 +和 CD8 + T 细胞在重症 COVID-19 中的积累2.单细胞转录组学揭示重症 COVID-19 中 T 细胞向高细胞毒性和脱粒潜力转变为了获得有关 COVID-19 和严重程度特异性 T 细胞簇的功能信息，作者对来自急性感染和恢复期轻度和重度 COVID 的外周血单核细胞 (PBMC) 样本以及纯化的表达 CD38 的 T 细胞进行了单细胞转录组scRNA-seq 分析，并对齐 CyTOF 和 scRNA-seq T 细胞簇，得到了 17 个簇（图 2A和2B)。与 FLI 或 HBV 患者以及对照组相比，COVID-19 患者中属于第 7、8 和 10 组的 T 细胞比例更高（图 2D 和 2E)。作者观察到其他具有FCGR3A表达的 T 细胞簇（簇 9、11、12 和 13）。接下来，作者对集群 7、8、9 和 10 进行了基因本体论 (GO) 富集分析，比较了轻度和重度 COVID-19 T 细胞（图 2F）。作者观察到重症 COVID-19 T 细胞脱粒相关基因的特定富集，接着对选择性富集通过基因集富集分析进行基因验证。最后，对来自队列的样本进行的单细胞转录组学scRNA-seq 分析支持了作者在重症 COVID-19 的主要 T 细胞区室中发现了一部分活化的 CD16+T 细胞，并确定了与细胞毒性相关的转录程序的增加。图2 | 急性轻度和重度 COVID-19 期间 T 细胞的单细胞转录组学来自对照组 (n = 6)、FLI (n = 8)、HBV (n = 4)、轻度 COVID-19 (n = 9) 和重度 COVID-19 (n = 10) 的 T 细胞簇的 UMAP患者。3.CD16 介导的 CD8+T 细胞脱粒导致内皮细胞释放趋化因子CyTOF 和 scRNA-seq 分析确定了两个主要的 T 细胞活化特征：(1) 形成高度活化、增殖的 TFH 样 CD4 +细胞和表达 CXCR3 的 CTL，与疾病严重程度无关；(2) 活化的 CD16 + T 细胞特异性。作者测试了 SARS-CoV-2 特异性抗体反应在这些患者中是否更明显？SARS-CoV-2 特异性 IgA 的血清浓度，结果显示，特定 IgG 水平在重症 COVID-19 中更高（图 3A）。接下来，作者研究了与 CD16+CD4+和 CD8+簇相关的功能特性。如 scRNA-seq 所示，与对照组相比，来自重症 COVID-19 患者的样本含有明显更多的表达粒酶 B 的 CD8+T 细胞（图 3C）。CD16 参与重症 COVID-19 最可能的影响之一是在与内皮细胞相互作用期间 T 细胞脱粒增强。事实上，根据对重症 COVID-19 的尸检结果，已经观察到 T 细胞浸润和内皮细胞损伤，即淋巴细胞性内皮炎。可以想象，免疫复合物介导的 CD16+T 细胞脱粒会导致内皮损伤。为了验证这一假设，作者在抗 CD16 抗体存在的情况下，将原代肺微血管内皮细胞与从轻度/重度 COVID-19 患者/对照中分离的富集的非初始 CD8 + T 细胞共同培养。随后，作者分析了炎症介质的释放（图3G）。抗 CD16 触发的严重 COVID-19 T 细胞通过共培养的内皮细胞引起增强的 CXCL8 (IL-8) 和 CCL2 (MCP-1) 释放。与对照 T 细胞相比，来自 COVID-19 患者的 T 细胞放大了伴刀豆球蛋白 A 诱导的跨内皮电阻损失，表明内皮屏障破坏，但这种效应仅对来自重症 COVID-19 患者的 T 细胞显著（图 3 H ）。为了补充作者在外周血中的发现，作者研究了COVID-19 患者肺部CD16 + T 细胞的组织定位。作者发现与来自不同对照尸检组的肺组织相比，CD3 + CD16 + T 淋巴细胞的数量增加（图 3 I 和 3J）。并在死亡的晚期时间点下降（图 3 J）。这些发现支持作者的假设，即在重症 COVID-19 患者中 CD16 +高细胞毒性 T 细胞的生成和局部积累增强，可诱导肺内皮细胞的活化和损伤。T 细胞诱导的化学引诱剂 CXCL8 和 CCL2 的释放可导致 COVID-19 肺炎中中性粒细胞和单核细胞的浸润增加。图3 | 重症 COVID-19 的 T 细胞的脱粒和细胞毒性潜力增加4. 在急性重症 COVID-19 期间诱导的表达FCGR3A的 T 细胞克隆持续存在并保持其增加的细胞毒性潜力来自重症 COVID-19 患者的 CD16 + T 细胞表现出增强的细胞毒性特性，可能导致器官损伤，作者分析了它们在清除急性感染后的持久性。症状发作后 3-8 个月恢复期（图 4A -4E），作者分析了单个 COVID-19 T 细胞簇的克隆富集是否不同。进一步揭示这些克隆的高细胞毒性潜力。随后探索富含反应性缺氧特征的区域。结果显示，重症 COVID-19 患者的 CD16 + CD8 + T 细胞在恢复期持续存在，采用更分化的 CD62L -表型，但仍保持其高细胞毒性潜力。图4 | 在急性 COVID-19 期间扩增的 T 细胞克隆的时间依赖性进化和表型5. C3a 促进表达 CD16 的高细胞毒性 T 细胞的分化因为 COVID-19 的死亡率和严重发病率会不同程度地影响老年人，作者研究了总 CD16 + T 细胞的形成是否与年龄增加有关。作者利用已发表的流式细胞术数据揭示了来自老年人的样本中检测到显著更高比例的 CD16 +细胞，这支持了作者的年龄依赖性增加的假设（图 5 A）。重症 COVID-19 的一个关键特征是补体生成和激活增加，作者分析了补体成分补体因子 D (CFD) 与年龄的相关性。接下来，作者在重组 IL-2 和来自轻度或重度 COVID-19 患者的血清或对照血清的存在下，用板结合的抗 CD3/CD28 抗体刺激来自健康未暴露对照的富集 CD3 +细胞。最后，作者测试了 C3a 是否是导致重症 COVID-19 患者血清 T 细胞分化潜能改变的原因。总之，在重症 COVID-19 中高水平产生的补体分裂产物（如 C3a）会产生炎症环境，促进 CD16+高细胞毒性 T 细胞的分化。图5 | C3a促进表达CD16的高细胞毒性T细胞分化6.活化的 CD16 + T 细胞在严重 COVID-19 期间的病理作用作者比较了死于 COVID-19 的患者和幸存者中活化 CD16 +T 细胞的比例。与幸存者（幸存者）相比，死亡的重症 COVID-19 患者（非幸存者）样本中所有 CD4 +和 CD8 + T 细胞中活化的 CD16 + TCRab +细胞的百分比显著更高（图 6 A）。接下来，作者在更大的队列中测试了 C3a 生成上游补体蛋白的血浆水平是否与患者的病程和结果相关。与轻度 COVID-19 相比，重症患者血浆样本中经典和替代途径的正调节因子水平较高（图6B ）。作者还分析了与疾病轨迹相关的补体蛋白水平，特别是随后疾病严重程度的恶化。临床恶化的患者样本中 C1R 和 CFD 升高，而随后疾病进展的患者样本中抑制经典和凝集素依赖性补体途径的补体因子 I (CFI) 的丰度较低（图 6C）。最后，C1QA、C1QB、C1QC 和 CFD 的数量不仅在重症 COVID-19 中较高，而且与致命结果相关（图 6 D）。总之，这些数据进一步支持了补体系统和活化的 CD16 + T 细胞在严重 COVID-19 期间的病理作用。图6 | 活化 CD16 + T 细胞的比例和血浆补体蛋白水平与 COVID-19 的结果相关相关讨论过度的 T 细胞活化和改变的表型可能导致感染相关的器官损伤。在重症 COVID-19 患者中，作者检测到活化的 CD16 +T 细胞的分化，这显示出免疫复合物介导的细胞毒性潜力和激活肺微血管内皮细胞的潜力。CD16 中的扩展克隆+ T 细胞区室持续存在并保持其高细胞毒性潜力。作者将 C3a 鉴定为分化改变的活化 T 细胞表型的上游信号。活化 CD16 +T 细胞的比例和血浆补体蛋白丰度水平与重症 COVID-19 患者的不良预后相关。因此，SARS-CoV-2 触发的补体激活创造了一种炎症环境，驱动具有高免疫致病潜力的 T 细胞分化。在这里，作者显示重症 COVID-19 患者中 C3a 生成的增加促进了 CD16 +、高细胞毒性 CD4 +和 CD8 + T 细胞的分化。总结全文，研究发现新冠重症患者体内出现高度活化、高细胞毒性的CD16 +T细胞亚群。新冠重症患者体内免疫复合物介导的CD16 + T细胞可以与内皮细胞相互作用促进微血管内皮细胞的损伤、释放炎性趋化因子以及中性粒细胞和单核细胞浸润肺组织。而CD16 + T细胞克隆在急性疾病后仍能保持其细胞毒性表型。补体成分C3a作为其上游信号可以促进高毒性CD16 +T细胞的分化。活化CD16 +T细胞的比例和血浆补体蛋白水平与新冠患者的死亡风险有关，表明T细胞的高毒性和补体激活使得新冠患者死亡风险增加。总之，特别严重的 COVID-19 导致活化的 CD16 + T 细胞数量增加，这些细胞通过不依赖 TCR 的细胞毒性 T 细胞功能触发补体级联反应与内皮损伤和患者存活相关。这在功能上将先天和适应性免疫系统与内皮损伤联系起来，这可能构成一个重要的分子轴，解释了在 COVID-19 中观察到的广泛的器官损伤。

文章来源：中华检验医学杂志, 2023,46(08)：792-801.作者：国家医学检验临床医学研究中心（中国医科大学附属第一医院） 中华医学会检验医学分会 国家卫生健康委临床检验中心 中华检验医学杂志编委会摘要流式细胞术在临床血液及免疫相关疾病的精准诊治中具有重要作用。随着流式细胞仪普及程度的不断提高，临床实验室开展流式细胞术检测，服务临床诊疗的能力和水平也逐渐提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和需求，加强质量控制，结合近年来国内外相关领域研究进展，对2013年发表的《流式细胞术的临床应用共识》进行更新，制定此共识。随着医学的进步及疾病精准化诊治需求的增加，我国临床实验室流式细胞仪的普及水平得到提高，开展流式细胞术检测服务临床诊疗的能力和水平亦不断提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和临床检验需求的更新，我们延续2013年《流式细胞术临床应用的建议》［ 1 ］的编写初衷，并在此前版本的基础上，经专家组讨论，适时对相应内容进行修订和扩增。本共识由国家医学检验临床医学研究中心、中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委临床检验中心及中华检验医学杂志编委会组织专家进行讨论撰写并发布。一、流式细胞仪及器材的准备（一）流式细胞仪的选择2017年12月，我国颁布《流式细胞仪》国家行业标准［ 2 ］，规定了流式细胞仪的产品分类、技术要求、试验方法及使用方法等。在临床检验工作中，应选择有临床注册证的流式细胞仪，满足检测灵敏度和收集速率等的要求；根据检测项目所需参数，确定适宜激光器和检测器，使其检测参数与临床使用的荧光抗体匹配；考虑操作的简便性和兼容性，以及未来可升级满足新检测需求的空间；兼顾临床实验室场地、仪器维护、人员培训、试剂和耗材供应稳定性、售后服务等因素。（二）流式细胞仪的设置1.仪器质控：流式细胞仪的仪器性能与检测结果准确与否密切相关。为保证仪器运转正常，每日开机流程后应运行仪器的质控微球等，保证仪器处于最佳性能状态，变异系数小于仪器软件中的可接受范围。如有可接受范围外的偏离，应及时进行校准和维修。2.仪器维护：（1）环境温湿度可影响激光器、光纤和棱镜等光学元件，使用时可参考仪器说明书推荐的温湿度，推荐室温18~25 ℃；（2）灰尘可损伤激光器和光学元件，降低检测的灵敏度，日常工作中注意仪器的整洁，清洁频率依据环境而定；（3）使用1%的次氯酸或75%医用乙醇每日清洁进样针，宜定期（或按需）清洁流动室，避免黏性大和聚集成团的细胞堵塞进样针；（4）过滤器影响荧光信号的稳定性和压缩空气的供应，在需要时排除气泡并定期更换；（5）鞘液桶、废液桶需维持密闭性，定期清洁和更换；（6）电脑数据定期备份，存储数据不超过硬盘的一定容量，避免损坏和拖慢系统性能；（7）定期对仪器性能进行全面评估、校准和保养，并应出具书面报告。3.补偿设置：传统的多色流式细胞仪存在荧光溢漏，合适的补偿是获得可靠数据的关键［ 3 , 4 , 5 ］。（1）补偿对照可以使用新鲜血细胞制品（更贴近待检测细胞）和商品化的荧光微球（操作简便）。使用荧光微球建立的补偿，宜用待检细胞进行优化；（2）如流式细胞仪具备“自动补偿”功能，可采用自动补偿进行条件设置并进一步手动优化；（3）同一通道检测的相似荧光，建立补偿时不能互相替代，如PE-Cy5、PerCP、PerCP-Cy5.5等，应分别建立补偿；（4）补偿设置的染色处理过程宜与待测项目一致，细胞膜染色和经过固定、破膜的胞浆（或胞核）染色会有不同，建议分别设置补偿；（5）补偿矩阵并非永久适用，当建立新的实验或仪器性能出现允许范围外的变化，应重新建立补偿。（三）移液器、离心机、标本前处理系统等的维护及定期校准上述仪器除日常清洁维护，应按照实验室认可标准（例如ISO15189）的相关要求，定期对不同量程的移液器、离心机和标本前处理系统的性能进行全面评估和校准，并出具书面报告。共识1 临床检测选用的流式细胞仪应有国家有关机构核发的注册证。建议根据临床实验室及流式细胞术检测项目的特点，选择技术性能符合使用要求的流式细胞仪，宜同时考虑相关技术培训及售后服务等。流式细胞仪的使用应注意每次检测过程中的仪器质量控制，应按要求进行维护保养和校准评估。流式细胞术检测相关的器材也应注意日常清洁维护和定期校准评估。推荐强度：强烈建议。二、流式细胞术检测试剂（一）荧光抗体的选择和搭配流式细胞术使用的抗体应符合国家相关标准［ 6 ］。在搭配多色抗体组合时需要考虑［ 5 ］：（1）流式细胞仪的检测通道特性：根据流式细胞仪的配置，选择可使用的荧光抗体；（2）荧光染料本身的强弱、荧光标记物的稳定性、荧光素分子大小、荧光抗体克隆号等，例如同一荧光标记物，不同克隆号抗体对某些抗原的检测效果也会出现差异［ 7 , 8 ］；（3）待测抗原表达强弱：弱表达抗原选择强荧光标记，强表达抗原可选择弱荧光标记；（4）尽量避免光谱重叠多的荧光染料搭配如PE-Cy5和APC等，对细胞共表达的抗原进行染色时，尽量避免选用串色和荧光溢漏大的通道［ 5 ］。（二）抗体的滴定设置通过抗体滴定计算染色指数（stain index，SI），判断荧光染色后阴性群和阳性群的分离效果，是确定最佳抗体使用浓度的重要方法。SI计算公式为：［中位荧光强度（median fluorescent intensity，MdFI）阳性群-MdFI阴性群］/（2× rSD阴性群）［ 5 ］。SI受荧光强度、抗原表达强度、抗体结合力及流式细胞仪设置等影响［ 5 ］。在更换抗体或抗体批号之前，宜进行抗体滴定以确定最佳浓度，避免因抗体浓度不合适，导致弱表达抗原检测不到或强抗原超出检测限。（三）对照的设置和选择选择适宜的对照是流式细胞术检测中正确获取和分析数据的基础［ 5 ］。“荧光减一”（fully stained minus one fluorochrome或fluorescence minus one，FMO）对照是目前确定阴性和阳性细胞群cutoff值的最佳对照，对于弱阳性或阳性细胞比较少的情况尤为适用，可排除交叉干扰等；同型对照可评估Fc受体或蛋白的交叉反应，排除非特异性染色。生物品对照如血液制品质控，可根据制品的cutoff值来确定检测样品的阴阳性。（四）其他试剂红细胞裂解是流式细胞术检测血液白细胞或骨髓有核细胞时不可或缺的过程［ 9 , 10 ］，宜选择相应品牌的裂解液或自行配制。由于裂解液可对粒细胞和单核细胞等造成不同的影响，也会影响染色的效果［ 9 , 10 ］，建议根据检测目的不同进行比对，择优选用。细胞的稀释、洗涤和重悬需使用缓冲液或稀释液［ 11 , 12 , 13 ］，宜依据反应的最适pH值（如中性）、副作用（如磷酸盐缓冲液会导致一些激酶反应的抑制）、可能的络合作用、对光谱的吸收以及成本等进行选择［ 13 ］。日常工作中可选用商品化的缓冲液或PBS，依据检测目的确定是否添加胎牛血清/牛血清白蛋白，以及是否加入叠氮化钠用于保存。此外，细胞培养基和医用生理盐水等也可用作稀释液和缓冲液。不同于细胞表面（细胞膜）的染色，对细胞内（细胞浆或细胞核）的分子进行染色，需要经过“固定”（如甲醛等），保持目标抗原的位点和结构，再通过“破膜”（如Triton-X）使抗体进入细胞。不同品牌破膜剂对细胞内染色有不同程度的影响，建议根据检测效果进行比对，择优选用［ 14 ］。共识2 流式细胞术检测中，建议合理选择和搭配所需荧光抗体，通过滴定确定抗体使用的最佳浓度，并合理选择和设置对照；染色过程中，选择适宜的红细胞裂解液、缓冲液以及固定破膜剂。推荐强度：强烈建议。 三、标本的采集、存储、运输及制备（一）外周血标本（1）患者准备：流式细胞术检测同其他项目外周血采集无异，因脂血等会对检测结果造成影响，采血前尽量清淡饮食；（2）抗凝剂选择：同时进行白细胞分类和流式细胞术检测时，建议使用乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝真空管进行标本采集，室温保存，尽快送检［ 15 ］。如进行T细胞功能的检测如IFN-γ分泌时，因EDTA可螯合钙离子，影响T细胞激活效果，建议采用肝素钠等抗凝。（二）其他标本骨髓标本、造血干细胞采集物的抗凝剂选择可以参照外周血。脑脊液标本一般不需要抗凝剂，渗出液性质的浆膜腔积液常有凝块，建议抗凝处理。因体液标本久置会导致细胞破裂，影响细胞计数、分类等检测结果，所以需要尽快送检。一般要求在采集后立即送检［ 16 ］，如使用特殊保存剂，可以适当延长送检时间［ 17 ］。样品应离心浓缩调整细胞浓度后进行染色。对于淋巴结等组织标本，一般不需要抗凝剂，活检取材后应尽快送检。标本可经过物理研磨法和酶消化法获得单细胞悬液，调整细胞浓度后进行细胞染色。体外培养的细胞（如胞内细胞因子染色时，需刺激后加入蛋白转运抑制剂），根据细胞储存状态（冻存与否）、细胞特性（贴壁或悬浮），进行复苏或消化、洗涤，调整细胞浓度后染色。（三）标本制备流式细胞术标本的制备，需考虑新鲜度和检测项目的要求。（1）细胞浓度：一般不建议超过1×106 cells/ml（参照试剂说明书）；（2）全血体积：一般建议50~400 μl［ 18 ］；（3）活细胞染料：常规新鲜外周血可以不使用活细胞染料，但造血干细胞计数、白血病微小残留病（minimal residual disease，MRD）筛选与监测等，建议添加活细胞染料如7-AAD等，以去除死细胞的干扰；（4）细胞染色、固定与破膜：需考虑细胞膜染色、细胞浆染色和细胞核染色的区别，选择相应适宜的固定破膜剂；（5）染色温度：一般室温染色即可［ 18 ］，但造血干细胞染色、使用某些固定破膜剂时，要求在融冰或4 ℃完成；一些特殊项目（如中性粒细胞吞噬二氢罗丹明辅助诊断慢性肉芽肿）需经过37 ℃孵育；（6）染色时间：受荧光抗体和染色体积影响，一般建议10~30 min［ 18 ］。根据目的抗原的位置分布不同（细胞膜、细胞浆和细胞核），染色时间不同，可依据说明书及检测需求，探索最优染色时间。另外，如染色体积在200 μl以上，可适当延长抗体孵育时间［ 18 ］。共识3 建议根据检测标本的种类及实验需求的差异，选择适宜的抗凝剂，采样后应尽快送检；样品制备时确保细胞浓度在合理的范围内，根据检测项目的特性，选择最优的染色方法和染色条件。推荐强度：建议执行。四、流式细胞术的临床应用（一）淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析是目前流式细胞术临床应用范围最广泛的项目，可获得淋巴细胞亚群，包括CD3+总T细胞、CD3+CD4+辅助T细胞（Th）、CD3+CD8+细胞毒性T细胞（Tc）、CD3-CD19+B淋巴细胞和CD3-（CD16+CD56）+NK细胞的相对百分比（%）和细胞绝对值（cells/μl），在临床诊治中发挥了重要作用。国家卫生健康委员会发布的《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》［ 19 ］（该行标处于修订过程中），以及《流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用共识（2019版）》［ 20 ］和《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》［ 21 ］等，对此项目的开展及应用具有重要的指导意义。（二）免疫细胞精细分型1.淋巴细胞：（1）T细胞：对T细胞的精细分型，根据细胞表面标记区分T细胞，如调节性T细胞（Treg）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、Th1、Th2、Th9、Th17和Th22［ 22 ］，初始（naive）、效应（effector）、效应记忆型（effector memory）和中央记忆型（central memory）亚群、活化细胞亚群等［ 22 , 23 , 24 , 25 ］。（2）B细胞：根据CD27、IgD、CD24、CD38、CD5等表达，可以将B细胞分为不同亚群［ 23 ， 26 , 27 , 28 , 29 ］。（3）NK细胞：根据CD16和CD56表达的不同，可以将NK细胞细分为不同亚群 ［ 23 ， 30 , 31 ］。目前精细分型的方案并未统一， 表1 汇总了文献报道的常见淋巴细胞精细分型方案，可供参考。2.髓系细胞：（1）粒细胞：根据CD45和SSC，CD13和CD16以及CD66、CD123、CD203c、HLA-DR等的表达不同，可以将粒细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞［ 23 ， 30 ］。（2）单核细胞：根据CD45和SSC，CD13、CD14和CD16的表达不同，可以将单核细胞分为不同亚群［ 23 ， 30 ］。（3）树突状细胞（dendritic cell，DC）：使用系列抗原（lineage：CD3、CD14、CD16、CD19和CD56）排除T细胞、B细胞、NK细胞、单核、粒细胞等，再根据CD123、HLA-DR、CD11c、CD1c、CD141等的不同表达，可以将DC细胞分为不同亚群 ［ 23 ， 30 ， 32 ］。（4）髓源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）：根据CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD33等指标的表达，可以将MDSC分为3个不同亚群 ［ 33 , 34 ］。 表1 汇总了文献报道的常见髓系细胞精细分型方案，可供参考。（三）白血病免疫表型分析及微小残留病监测1.白血病免疫表型分析：（1）急性白血病：对于急性白血病免疫分型，2013版《流式细胞术临床应用的建议》［ 1 ］及《四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（2015年版）》［ 35 ］均有详细介绍。在上述《建议》和《共识》中，对白血病免疫表型分析均主要推荐采取“2步法”，但对于某些跨系别表达的抗原或是混合表型的白血病，可能会因为检测抗原不足导致漏检的现象。国家卫生健康委发布的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗规范（2018年版）》［ 36 ］和《儿童急性早幼粒细胞白血病诊疗规范（2018年版）》［ 37 ］，对于急性白血病免疫分型，建议使用多色流式细胞仪，至少检测上述《诊疗规范》提及的35个CD分子，视情况增加更多抗原检测，同时检测的CD分子越多，准确性相对越高。（2）慢性淋巴细胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）/非霍奇金淋巴瘤：流式细胞术检测的抗原可以参考《流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识（2017版）》［ 38 ］。但是对于B淋巴细胞，由于慢淋/非霍奇金淋巴瘤的细胞可能来源于淋巴结的多个结构部位［如DLBCL分为生发中心型GCB型、非生发中心non-GCB型和活化B细胞样（ABC）型］，需注意其免疫表型的多样性［ 39 ］；对于T细胞，如出现异常免疫表型或TCRVβ的单克隆，需要与病毒感染等鉴别。（3）霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）：对于HL，因背景含有大量表型相对正常的淋巴细胞，寻找低比例的Reed-Sternberg细胞存在一定困难。Reed-Sternberg细胞在免疫表型上可以表现为CD45-CD30+CD15+CD71+CD40+CD95+CD3-CD19-等免疫学特征，需要与其他一些表达CD30+的肿瘤细胞进行鉴别［ 40 ］，多色流式细胞术在HL中具有一定的辅助诊断价值，HL最终诊断需要结合组织病理学。2.白血病微小残留病（MRD）监测：（1）急性白血病MRD监测：基于白血病相关免疫表型（leukemia-associated immunophenotype，LAIP，根据非白血病细胞的表达背景来定义）和/或细胞“异于正常（different from normal，DFN）”的表型，可以鉴定出异常的细胞群，进行MRD细胞监测［ 41 ］。急性白血病MRD监测可以参考已发表的中国专家共识［ 42 , 43 ］。（2）慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤MRD监测：典型的CLL免疫表型为CD19+CD5+CD23+CD22+CD200+CD43+CD79blow/-且CD10-FMC7-CD103-CD20lowsIgMlow［ 44 ］，可用于CLL诊断和MRD监测。上述表型可以通过固定的MRD组合进行监测，推荐方案包括CD5/CD19/CD20/CD38/CD81/CD22/CD79b/CD43等［ 44 , 45 ］，需注意美罗华（Rituximab，利妥昔单抗）治疗会使CD20出现假阴性，鉴于CD200在CLL和其他CD5+淋巴瘤如套细胞淋巴瘤中的作用，也可推荐CD200［ 46 ］和CD160［ 47 ］作为CLL的MRD监测指标。对于免疫表型不典型的淋巴瘤等进行MRD监测，需结合其初发时的免疫表型特征。淋巴瘤的分布具有异质性（如可能涉及外周血、骨髓、淋巴结、肝脏、脾脏等），当采样不同时，MRD监测结果可能也不一致。目前，骨髓是使用最广泛的MRD监测标本，但脾脏、肝脏和淋巴结中的MRD监测亦可在疾病复发中起重要作用［ 45 ］。（3）多发性骨髓瘤MRD监测：可参考已经发表的相关共识进行检测［ 42 ］。MRD监测需要获取足够的细胞数，确定检测的最低检出限（limit of detection，LOD）和最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ），推荐固定和规律的取样时间进行MRD监测 ［ 45 ］。（四）细胞因子检测通过流式细胞术检测细胞因子，主要包括2类方法：（1）基于流式微球阵列技术（Cytometric beads array，CBA），可检测血清、血浆或体液等标本中细胞因子水平。其原理为样品中细胞因子与细胞因子抗体预包被的微球及荧光标记检测抗体结合，形成“双抗体夹心”复合物。此方法使用标本量少，2个荧光检测通道可以同时检测多种细胞因子。（2）可检测激活后胞内细胞因子如IFN-γ等表达，用于评估免疫细胞的功能等。此方法需要新鲜肝素抗凝外周血或分离获得的外周血单个核细胞，使用刺激剂激活细胞，并用阻断剂阻断胞内蛋白质转运，使得刺激产生的细胞因子聚集在细胞内。细胞膜抗原染色后，再使用固定破膜剂固定及破膜对胞内细胞因子如IFN-γ等进行染色。共识6 流式细胞术检测的质量控制应贯穿始终，包括检验前的标本、试剂和仪器，检验中的染色、数据获取和数据分析，检验后的报告发放和结果解释，重视人员质控。推荐强度：强烈建议。

原标题：清华大学王文会团队: 基于阻抗流式细胞术的单细胞样本“一步式”分选除盐质谱预处理系统——01——研究背景单细胞质谱检测技术为单细胞化学特性分析提供了一种强有力的免标记分析手段，并在癌症分析、药物刺激、免疫分析等临床应用中展现出潜在价值。然而单细胞质谱往往需要进行必要的预处理操作，如将目标细胞从混合细胞群体样本中分离出来以提高质谱检测的准确性；除盐操作去除细胞常见缓冲液中的非挥发性盐，降低基质效应提高质谱检测灵敏度。目前这些预处理往往是通过多种设备或手动操作完成，效率较低；开发有效的一步式预处理方法对于单细胞质谱分析意义重大，但目前这方面的研究较为缺乏。为此，清华大学的王文会教授团队提出一种基于阻抗流式细胞术IFC的“一步式”分选除盐质谱预处理系统，经过处理的细胞样本可直接兼容现有的免标记质谱流式、液滴微萃取等单细胞质谱分析手段。研究工作以“Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single Cell Mass Spectrometry”为题发表在期刊Small上，并被选为Frontispiece。本工作基于IFC原理设计微流控芯片结构，结合压电驱动实现一步式单细胞分选除盐操作，将目标细胞从细胞群中分离出来的同时实现其外基质的置换。经实验验证，系统的分选效率99%、除盐效率99%，并被证实了在癌细胞和血细胞的分离、癌变细胞与正常细胞的分离与质谱检测方面的功能。图1. 基于阻抗流式细胞术的“一步式”分选除盐质谱预处理系统示意图——02——研究内容本工作中搭建了具有四层结构的微流控芯片，如图1所示。利用IFC进行细胞的电学及尺寸特性表征实现不同细胞的识别，待其流经分选区域时由压电执行单元对目标细胞进行分选，通过合适的流速配比，执行单元将目标细胞推至作为下鞘液的质谱兼容的挥发性盐溶液中，同时实现样本的分选与除盐。芯片采用两套电极，其中第1套用于单细胞电学表征，第2套用于表征确认除盐效率。图2. 微流控芯片结构及其工作流程示意图以商用均一性较好的6 μm和10 μm直径的PS微球对系统的分选效率进行了表征。在约9000个样本的实验中，系统展现出了99.53%的分选成功率，同时样本中的10 μm微球纯度由2.48%提升至92.23%，实现了约37倍的富集效率，如图3所示。此外在模拟血液中CTCs分离的实验中，在HeLa癌细胞与人体外周血单核细胞PBMC的混合样本中分选出HeLa细胞，其纯度由15.78% 提升至87.34%，展示出巨大的临床应用潜能。图3. 微流控系统的分选性能评估从定量的角度，以270 mM NaCl溶液作为样本液、去离子水作为下鞘液为例验证了系统的除盐效率，单次分选操作引入的NaCl物质的量仅为0.77±0.16 pMol，即使在300 cells/s的分选通量下除盐效率也能够达到99.62%；同时在实际的细胞样本测试中可以看出，未经除盐的样本信号被完全淹没，而经过该系统除盐后的能够清晰分辨单细胞的典型代谢与脂质峰，证实了系统优秀的除盐性能。图4. 微流控系统的除盐性能评估该系统进一步用于正常乳腺上皮细胞MCF-10A和癌变的乳腺癌细胞MDA-MB-468的分选与检测。通过双频点的锁相检测，分别表征了两类细胞的电学特性，并据此进行了分选操作，结果表明MCF-10A细胞的纯度由 10.64% 提升至77.78%，展现出了约7.31 倍的富集效率。此外将收集到的细胞样本直接与免标记质谱流式装置级联实验，同时表征了两类细胞的代谢特征，结果表明，部分显著差异表达的代谢和脂质可能是致使细胞电学特性差异的原因，充分验证了系统在多模表征与临床分析中的应用价值。图5. 正常细胞与癌变细胞的电学与代谢特性表征分析——03——总结展望本工作提出的基于IFC的一步法单细胞样品质谱预处理方法极大地方便单细胞质谱分析，突破了复杂操作和不必要的损耗。作为一个独立的样品制备模块，本微流控系统能够兼容多种质谱分析方法，为高效的质谱样品制备提供新的范式，进而为单细胞的多模态(如电学特性、代谢特征)表征提供新的思路。论文信息Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single-Cell Mass Spectrometry ；Junwen Zhu, Siyuan Pan, Huichao Chai, Peng Zhao, Yongxiang Feng, Zhen Cheng, Sichun Zhang, Wenhui Wang* (王文会，清华大学)；Small, 2024, https://doi.org/10.1002/smll.202310700作者简介本工作的完成单位为清华大学精密仪器系、精密测试技术与仪器全国重点实验室。精仪系王文会教授为通讯作者，精仪系博士研究生朱焌文为第一作者。清华大学张四纯教授、程振助理研究员、清华大学博士生潘思远、柴惠超、赵鹏、丰泳翔为论文工作做出了重要贡献。本研究得到了国家自然科学基金的资助。【相关阅读】有望提高2个数量级微流控介电泳分离通量！清华大学王文会Advanced Materials封面成果速递https://www.instrument.com.cn/news/20240604/722338.shtml 3i流式KOL|清华大学王文会教授团队在阻抗流式细胞术上取得系列进展https://www.instrument.com.cn/news/20231030/689623.shtml

高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见的卵巢癌病理亚型，75%以上的患者首诊时已是晚期，常伴有广泛的网膜转移和腹水产生。此外，免疫检查点阻断等免疫治疗手段仅在10%左右的卵巢癌病人中起效。研究表明，卵巢癌腹水中的成纤维细胞亚群可以通过激活肿瘤细胞中的JAK/STAT通路以影响患者的预后及其对免疫治疗的响应。然而，卵巢癌腹水环境中的其它细胞类群对其肿瘤微环境的影响方式和途径仍不明确。7月24日，北大张泽民教授课题组与上交大附属新华医院汪希鹏课题组、上海免疫学研究所李子逸博士以“Single-cell analyses implicate ascites in remodeling the ecosystems of primary and metastatic tumors in ovarian cancer”为题在Nature Cancer杂志联合发表了研究论文，揭示了卵巢癌腹水对肿瘤原发和转移病灶微环境的重塑作用。研究人员对5个肿瘤相关部位，包括原发性卵巢肿瘤（Pri.OT）、网膜转移瘤（Met.Ome）、腹水、盆腔淋巴结（PLN）和外周血（PB），进行了单细胞转录组测序和T细胞受体(TCR)测序，共将223,363个高质量单细胞编入五个主要细胞谱系，并通过规范标记表达进行注释，从而描画出了 OC TME 的综合图谱。B细胞和CD4 T细胞在PLN中占主导地位；而淋巴细胞和单核细胞构成了PB样本的主要细胞成分；在Pri.OT和Met.Ome中鉴定出了五种主要细胞系，而且大多数细胞类型的富集模式在这两个部位之间没有明显差异，这表明原发性和转移性肿瘤细胞的发展都需要类似复杂的TME。腹水经常出现在晚期卵巢癌患者中，与化疗反应有关，腹水中含有大量免疫细胞和基质细胞，其中，CD8 T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）是腹水的主要成分，表明腹水中存在炎性微环境。5个部位的单细胞测序描画了晚期卵巢癌图谱与非恶性细胞不同，由推断拷贝数变异（inferCNV）定义的肿瘤细胞表现出很强的患者间异质性。值得注意的是，所有腹水样本中都发现了肿瘤细胞，平均比例为 2.7%（53499 个样本中的 1444 个），这与 OC 肿瘤细胞更倾向于 "播种"到腹腔而不是通过血管扩散的观点一致，凸显了腹水与 OC腹腔内扩散之间的紧密联系。此外，推断CNV分析表明，在Met.Ome中发现的肿瘤细胞亚克隆也可在Pri.OT中检测到，表明这些亚克隆是腹膜转移的致瘤群体。通过对单细胞转录组和 T 细胞受体（TCR）的系谱追踪和轨迹推断，研究人员鉴定了多个具有不同分布模式的T细胞群，并揭示了OC中T细胞从腹水到肿瘤组织的潜在动态特征。他们发现腹水富集的记忆T细胞（CD8 GZMK T++EM和 CD4 T+CM）可能是TIL的潜在重要补充库，包括CD8 T+EX和 CD4 T+H1样细胞，特别是对于Met.Ome。这些结果暗示了腹水在T细胞浸润期间塑造OC的TME的潜在作用。此外，作者描述了腹水和肿瘤组织中巨噬细胞的功能状态和本体，肿瘤富集的巨噬细胞偏向于单核细胞来源的本体，而腹水中的巨噬细胞更多来源于组织驻留巨噬细胞（RTM）。HGSOC 中肿瘤富集巨噬细胞和腹水富集巨噬细胞的两种不同功能状态此外，研究人员还鉴定了恶性腹水中的 MAIT细胞和树突状细胞，以及原发性肿瘤中的两个内皮亚群，通过比较不同化疗响应情况的患者治疗前样本中细胞亚群的分布情况，发现肿瘤原位灶中VCAM+内皮细胞占比较高的HGSOC患者对化疗敏感，而IL13RA1+内皮细胞的占比高则提示患者对化疗耐药，这可能是治疗效果的一个重要评价指标。总之，该研究提供了女性恶性腹水生态系统的全貌，为其与肿瘤组织的联系提供了有价值的见解，并为OC疗效评估和治疗耐药性的潜在标志物的开发提供了重要参考。卵巢癌（OC）是一种异质性疾病，由具有不同组织学亚型、分子生物学和微环境特征的恶性肿瘤组成，是致死率最高的妇科恶性肿瘤，占女性癌症死亡人数的 5%。在所有 OC 类型中，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是最常见的组织学亚型，占 OC 患者的 70%以上。一旦确诊，超过 75% 的 HGSOC 患者病情已到晚期，并伴有广泛转移和腹水。据报道，由于网膜的脂肪结构和腹膜循环，OC 患者通常会向网膜转移。虽然化疗加贝伐单抗的治疗可延长患者的 5 年生存期，但总体疗效仍然有限。此外，免疫检查点抑制剂等免疫疗法在临床试验中的客观反应率仅为 10%，而由于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的比例和质量不同，OC 亚型往往对免疫疗法表现出不同的反应。因此，描述 OC 的肿瘤微环境（TME）特征至关重要，因为肿瘤微环境中的多种细胞成分在疾病进展和治疗反应中发挥着重要作用。

美天旎全自动多功能细胞处理系统CliniMACS Prodigy® ，是在美天旎磁珠分选MACS® 技术和CliniMACS® Plus系统基础上开发出的一款集合细胞分选、细胞离心、清洗和细胞培养等多种功能于一体的全自动细胞处理系统。自动化、标准化、规模化、集成化的GMP级细胞制备平台CliniMACS Prodigy® 仪器将复杂的细胞治疗实验室整合在一个平台中，通过标准化程序自动控制的方法，配合密闭的无菌管道完成各种复杂的细胞操作，有效避免了人工操作过程中可能出现的失误和污染风险，极大地提高实验效率，保证GMP级细胞制备的可重复性。因此，利用这个稳定而又灵活的平台，可以方便地将基础研究转化到创新性的细胞治疗应用中。美天旎全自动多功能细胞处理系统CliniMACS Prodigy® 应用：移植工程——CD34造血干细胞富集移植工程——TCRαβ+T / CD19+B细胞去除细胞治疗——CD14单核细胞分选及MoDC诱导生成细胞治疗——T细胞转导（TCR-T / CAR-T）细胞治疗——细胞因子捕获系统（CCS-IFN-γ 富集）细胞治疗——CAR-NK细胞制备干细胞制备——间充质干细胞分离与扩增干细胞制备——多能干细胞制备干细胞制备——多巴胺前体细胞分化干细胞制备——心肌细胞分化创新点：美天旎全自动多功能细胞处理系统CliniMACS Prodigy® ，是一款集合细胞分选、细胞离心、清洗和细胞培养等多种功能于一体的全自动细胞处理系统，将复杂的细胞治疗实验室整合在一个平台中，通过标准化程序自动控制的方法，配合密闭的无菌管道完成各种复杂的细胞操作，有效避免了人工操作过程中可能出现的失误和污染风险，极大地提高实验效率，保证GMP级细胞制备的可重复性。因此，利用这个稳定而又灵活的平台，可以方便地将基础研究转化到创新性的细胞治疗应用中。 全自动多功能细胞处理系统CliniMACS Prodigy system

过继性细胞疗法 (Adoptive Cell Therapy, ACT) 目前在肿瘤治疗过程中取得了令人振奋的临床结果，美国和中国也相继批准了多款靶向CD-19 和 BCMA 的临床产品。然而这种治疗方案面临着一个很棘手的临床问题––抗原丢失问题，即一部分肿瘤细胞会通过下调抗原表达或不表达抗原从而逃脱TCR-T细胞或CAR-T 细胞的杀伤，从而导致癌症的进展，直至病患的死亡。多年来美国维克森林大学医学院鲁勇课题组在Th9细胞的抗肿瘤功能的研究方面做出了一系列卓越的工作，并定义了Th9 细胞代表着一种全新的T 细胞模式 (New T cell Paradigm) 能够攻击晚期肿瘤。这些工作发表了包括Lu et al JCI 2012【1】，PNAS 2014， Cancer Cell 2018【2】等一系列论文。2021年10月21日，鲁勇课题组（现已任职于Houston Methodist/Weill Cornell Medicine，详情请见本文最后）再次在Cancer Cell上发表了题为 Adoptive cell therapy with tumor-specific Th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss variant tumor cells的研究论文，首次报道了肿瘤特异性 Th9 细胞 (TCR-Th9 或 CAR-Th9) 可以根除含有特异性抗原丢失癌细胞的晚期恶性肿瘤。在该项工作中，研究人员首次发现在晚期恶性肿瘤中的细胞免疫治疗中，使用传统的CAR-T或者TCR-T虽然在前期都能产生良好的抗肿瘤作用。不幸的是这些治疗总是伴随着后期的肿瘤的复发，而且T细胞治疗剂量增加5-10倍 (high dose) 也不能有效的控制肿瘤复发。非常有趣的是当使用Th1高剂量或者Th17细胞进行治疗时，复发的黑色素肿瘤大面积肿瘤组织由原先的黑色变成了白色。研究者通过大量实验发现这是因为T细胞攻击的名叫TRP-1的抗原发生了丢失，而TRP-1蛋白是黑色素瘤产生黑色素时必须的。当黑色素瘤发生TRP-1抗原逃逸时，肿瘤停止产生黑色素，其颜色也随后自发发生了变化。类似于这样的抗原丢失情况在文中使用的多种肿瘤模型中都很常见。但是研究者发现只有使用肿瘤特异性的Th9细胞进行治疗时，能治愈这些晚期肿瘤，且不会出现复发的情况。研究发现Th9 细胞除了通过直接靶向杀伤表达特异性抗原的肿瘤细胞外，具备其他类型T细胞没有的特性（机理总结见下图）：即可以通过eATP-ERVs-TLR3/Mavs途径刺激招募到肿瘤中的单核细胞释放一型干扰素（Type I IFN）进而激活宿主自身免疫系统杀伤抗原丢失的肿瘤细胞，最终达到彻底根除肿瘤的目的。这种能激活达到如此强度的自身免疫系统杀伤能力的T细胞目前只发现存在于Th9细胞治疗中。这项工作的意义在于为过继性细胞治疗中出现的抗原丢失临床问题提出了切实具体的解决方案，具有极高的转化意义和临床应用价值。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.011

仪器信息网特别策划话题：#3i流式大咖说#（点击查看），邀请高校、科研院所、临床、生物技术企业等流式技术研发、应用专家分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解相关技术应用进展、学习仪器使用方法。本期，西南医院西南癌症中心流式平台负责人马清华副研究员带我们了解FSC与SSC在流式细胞术中的应用。FSC与SSC在流式细胞术中的应用作者：西南医院 马清华 副研究员流式细胞术利用细胞大小和粒度定义细胞群特征。细胞大小用前向散射光FSC（Forward Scatter）测量，细胞的粒度用侧向散射光SSC(Side Scatter)测量。FSC收集细胞折射后向前散射的光，所以FSC除了测量细胞大小，还与核质比、膜形貌和其他细胞特征相关；SSC收集垂直于激光束的散射光以及细胞内部颗粒的散射光，所以SSC可以反映细胞复杂性和粒度，如下图。1.细胞亚群的分类 FSC和SSC一般以线性模式运行，范围从0到250000。大细胞具有较高的FSC和SSC值，位于FSC/SSC图的右上部分（如粒细胞）。红细胞等小细胞具有较低的FSC值，由于实验中红细胞已被溶解，其碎片出现在散点图左下角；淋巴细胞是小细胞，颗粒不大，因此FSC和SSC值较低。单核细胞更大，颗粒更大，细胞群在FSC轴上进一步向右移动，在SSC轴上向上移动一点，因此它们的FSC和SSC值更高。顾名思义，粒细胞是颗粒状的，也很大，所以它们有很高的FSC和SSC值。2.判定细胞活性状态 FSC/SSC不仅可以对细胞群进行分类，而且有助于排除细胞碎片和死细胞， 用于细胞活性状态的判定。通常死细胞与细胞碎片的FSC和SSC较低，而凋亡细胞的FSC会变小SSC变大。如下图，通过FSC与SSC判断，A图细胞活性差，基本是死亡细胞与凋亡细胞（P1门内为89.6%）；B图中细胞群分为两群，P1门中的细胞群为凋亡及死亡细胞（27%），P2门中的细胞活性状态好。FSC/SSC常被应用于判定分选前及检测时的细胞活性状态、分选后细胞的活性状态以及原代细胞提取的活性状态。FSC/SSC是否能够真实的反应细胞死活状态呢，我们用7AAD对B图的细胞进行分析，从下图可以看出P门中有95.2%的7AAD-细胞，而P1门中有52.5%的7AAD-细胞。虽然P1门中有52.5%的7AAD-细胞，但是从图中可以发现其细胞大部分集中于左下角。这与7AAD的染色原理有很大的关系。7AAD 是经典的核酸染料，判断细胞的活性通常依赖于其插入DNA。7AAD不能穿透完整的细胞膜，但可以通过细胞凋亡过程中形成的膜裂口和孔隙。7AAD可以使任何缺乏完整膜的细胞都能被核染色。但是，在严重受损的细胞后期如细胞凋亡的晚期，只有含有核酸的凋亡小体才能够被7AAD染成阳性，其余的细胞碎片没有或含有低的DNA含量，这部分群体将会成为7AAD-群体事件。所以FSC/SSC可以用于判定活死细胞。3.排除细胞双链体FSC与SSC信号脉冲由信号处理器把脉冲信号高度（Height）、面积（Area）和宽度（Width）定量为一定的数值。这些数据有流式细胞仪的配置计算机工作站进一步分析处理。因此，可以通过面积信号、宽度信号、高度信号对双链体的细胞进行处理。一般用FSC-H/FSC-A、FSC-H/FSC-W以及SSC-H/SSC-W处理双链体细胞。 小结 FSC与SSC是流式细胞术的基本术语。科研工作者充分利用好FSC/SSC，能够轻松的判断分选及检测前细胞活性状态、细胞分选后细胞活性状态、免疫细胞分群等，同时还可以利用FSC/SSC去除细胞中的黏连体细胞。【个人简介】西南医院西南癌症中心流式平台负责人 马清华 副研究员现任西南医院西南癌症中心流式平台负责人，主要从事流式细胞平台的运行管理、用户培训以及流式细胞分选及分析工作。目前，承担省部级课题一项，参与多项国家级课题。以第一或通讯作者发表流式细胞术相关SCI论著2篇，参与多篇高分SCI论著的发表，并参编专著 1 部。（本文编辑：刘立东KOL） 相关推荐：流式大咖说|量化成像分析流式在水生生物研究中应用——中国科学院水生生物研究所高级工程师 汪艳流式大咖说|流式检测中最易忽视的时间参数——首都医科大学中心实验室副主任技师 徐晓雪 流式大咖说|技术干货|如何去黏连？流式新手绕不开的数据处理难题 流式大咖说|流式细胞技术平台发展与使用心得分享中科院分子细胞卓越中心 俞珺璟博士【行业征稿】若您有生命科学、医药、临床等行业相关研究、技术、应用、管理经验等愿意以约稿形式共享，欢迎自荐或引荐投稿联系人：刘编辑word图文投稿邮箱：liuld @instrument.com.cn微信：JaysonXY（备注来意：投稿）

英国初创公司CS Genetics正致力于将一种无需专单细胞专用析仪器的单细胞分析技术商业化，该公司称这种技术简单、灵活、易于扩展。 预计该公司将在2024年发布首个单细胞RNA测序试剂盒。首席执行官杰里米-普雷斯顿（Jeremy Preston）于2022年加入CS Genetics公司，此前曾在Illumina公司工作十多年，他表示："我们的第一款产品将是SimpleCell™ 3′基因表达产品，名为SimpleCell，这个名字展示了我们拥有最简单的单细胞技术，没有之一。CS Genetics 技术的核心是一种单细胞索引方法，它借助所谓的动力学约束（kinetic confinement）来控制三维溶液空间内的反应动力学。"公司的基础技术是由公司创始人兼首席技术官卢卡斯埃德尔曼（Lucas Edelman）博士开发的。总体而言，CS Genetics 的动力学约束技术利用了两种专有解决方案：一种名为 CPair 的索引试剂，可将索引序列直接传递给单个细胞；另一种是动能封闭缓冲液 (KCB)，这是一种双功能试剂，可实现热激活细胞裂解和动力学约束索引。更具体地说，CPair解决方案包含细胞结合分子，这些分子锚定在所谓的编码链的末端（这正是CS Genetics的名字来源），这些编码链是附着在珠子上的工程化DNA链。编码链还包含用于对核酸进行条形码处理的索引寡核苷酸。当细胞被引入CPair 试剂时，经过优化的化学计量促使 CPair 与细胞以一比一的比例结合。随后加入一种专有的粘性缓冲液，这种缓冲液的设计目的是防止索引寡核苷酸在细胞-CPair 复合物之间的空间扩散。细胞与CPair 试剂结合后，可在进一步处理前冰冻或冷藏保存。细胞配对后，加入动力学约束缓冲液，通过热激活裂解细胞，释放细胞中的核酸成分。温度升高也会释放编码链上的索引寡核苷酸，然后通过冷却反应将条形码与目标核酸杂交。之后，用户可以使用标准分子生物学技术制备测序就绪的单细胞文库。据普雷斯顿介绍，该方法的一个优点是，不需要物理分离细胞来进行单细胞定位，因此不需要专用的单细胞处理设备。此外，他还表示，该方案以溶液为基础，不涉及组合索引或乳状液，执行起来相对简单。"只要你有一台可以旋转条形试管或平板的离心机，有吸管，精准的多通道移液器，和一台热循环PCR机，你就可以进行测定，基本上就是这样。"他还表示，在细胞配对和热激活裂解之间停止这一过程的能力 "非常有价值"。"通常情况下，单细胞检测一旦开始，工作量就很大。CPair解决方案给了你巨大的灵活性——可以批量处理更多样品，也可以进行一些时间点和多参数实验。"到目前为止，该公司已在人和小鼠细胞上 "广泛"测试了这项技术，包括外周血单核细胞（PBMC）、神经元、小鼠脑组织离体细胞和脾脏组织细胞。该公司还没有在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本上测试过这种方法，但普雷斯顿表示 "没有理由说它行不通"。至于灵敏度，内部数据显示，该方法可以常规地捕获每个细胞中的2000多个基因，不过普雷斯顿认为这一指标还可以更高。虽然该公司尚未最终确定其产品规格，但他表示公司的目标是每个样本最多能捕获约 5000 个细胞，此外，细胞捕获率达到 40% 以上。就周转时间而言，从进行实验到测序的工作流程大约需要七个小时，CS Genetics将努力进一步缩短周转时间。普雷斯顿表示，自动化也还有 "很大的空间"，有可能为 "更大规模的单细胞研究 "采用这种方法打开大门。虽然公司的初始产品是基于Illumina测序平台开发的，但单细胞文库可以通过商业化工具包去适配到其他测序平台。他补充说，内部研究表明，使用 Element Biosciences 和 Illumina 平台对相同样本进行测序时，数据质量 "完全相同"。此外，普雷斯顿声称该公司的方法可以 "自然地获得最长的 RNA 片段"，因为它 "对细胞非常温和"，没有任何微流体或剪切成分。该公司还用 PacBio 测序技术测试了该产品，在没有任何优化的情况下，测序结果 "很好"，读取长度达到 2 kb。定价方面，普雷斯顿表示该技术将比市场领先者 "便宜很多"，同时与其他无仪器单细胞技术 "相当"。CS Genetics公司在 6 月份启动了一项技术开放计划。由于 "资源有限"，该公司只接受了十几家早期客户，包括英国癌症研究中心、斯托沃斯医学研究所、苏黎世大学和纽卡斯尔大学。普雷斯顿说："我们正在努力解决一些小问题，并提高产品的稳定性和可重复性。"该实验的 "占地面积极小"，只有两个盒装组件。第一款产品设计可容纳 8 个样本，但该公司计划随后推出 16 个样本的版本。最初的目标客户将是核心实验室，但该公司也瞄准了可能在药物研发流程中部署单细胞分析的制药公司。据悉，CS Genetics 已经获得了一笔 "小额 A 轮投资"，计划在 2024 年进行 B 轮融资。普雷斯顿表示，随着公司筹集到更多资金，他们将在欧洲和美国建立并扩大一支跨洲团队。目前，公司在英国剑桥设有小型研发总部，约有 20 名员工，另外，包括普雷斯顿在内的五名员工在加利福尼亚州负责商业运营。除转录分析外，该公司还计划进一步开发动力学约束技术的其他应用，如利用抗体选择性捕获单细胞。该公司还在单细胞水平上开展了蛋白质组学分析的概念验证工作。征稿通知：基因测序仪是解码生命科学的利器，因其技术壁垒高、开发难度大，市场长期被少数几家跨国企业垄断。近些年，基因测序仪市场格局正在快速发生变化，涌现出许多新企业并纷纷推出自主研发的商品化测序仪。基于此，仪器信息网特别策划“基因测序仪新势力”专题，并向测序技术研究专家、测序仪应用专家和基因测序仪企业广泛约稿，充分了解基因测序新企业、新仪器、新技术及新应用进展。投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn点击图片了解详情

单细胞全基因组测序技术（scWGS）可以有效揭示生物样品中不同细胞之间的异质性，并系统鉴定单个细胞的基因组中发生的遗传变化，例如拷贝数变异（CNV）和点突变（单核苷酸变异，SNV）等。过去十年，研究人员已经开发出多种单细胞基因组扩增技术，例如简并寡核苷酸引物PCR扩增技术 (DOP-PCR)，多重置换扩增技术（MDA），多重退火和基于环的扩增循环技术（MALBAC），以及通过转座子插入和体外转录进行线性扩增技术（LIANTI）等。但是，目前的单细胞全基因组测序技术均基于二代测序（NGS）平台，该平台检测准确度高，但是测序读长相对较短（通常只有150bpX2），主要适用于检测单个细胞中的单核苷酸变异（SNV）、小的插入缺失（该研究的主要突破有：1：开发了一种高精度的基于三代测序（单分子测序）平台的单细胞基因组测序方法—SMOOTH-seq（Single-MOlecule real-time sequencing of LOng Fragments amplified THrough Transposon insertion）。使用优化后的Tn5转座反应，SMOOTH-seq能够从单个细胞中扩增出平均长度约6kb的基因组片段（测序读长比单细胞基因组二代测序技术长了20倍左右），通过引入与单分子测序平台兼容的细胞条形码使单细胞基因组DNA扩增子适用于Pacbio sequel II平台的HiFi测序模式。测序后的数据中，产生的环化测序（circular consensus sequencing, CCS）的读长平均在6kb左右, 最长可达43kb。(如图1所示)。 图1 SMOOTH-seq的流程和评估 2：该研究开发的SMOOTH-seq方法能够在单个细胞中高效检测基因组结构变异。在单个K562细胞中，当测序深度仅为0.4X时，基因组覆盖度可达19%。该研究对91个单细胞进行SMOOTH-seq分析，从中检测到4,790 个缺失事件和 5,589个插入事件, 其中87%的缺失片段和 91% 的插入片段长度小于1kb，检测到的插入事件DNA片段最长达到 7.7kb。同时，该研究也在 K562细胞中检测到521个易位事件，包括准确检测到两对经典融合基因：BCR-ABL 和 NUP214-XKR3。SMOOTH-seq技术对结构变异的检测精度高，当使用K562大量细胞的基因组三代测序结果作为比较基准时，该研究中使用的K562细胞系的每个单细胞中的结构变异检测平均精确度为75％，特别是在单个细胞中检测插入事件平均精确度为85％。此外，SMOOTH-seq 也可以以 1Mb 的分辨率准确检测到两个 K562 克隆之间的不同拷贝数变异（CNV）事件。(如图2所示) 图2. 单个K562细胞中CNV及结构变异检测的精确度 3：该研究开发的SMOOTH-seq方法能够在单个细胞中高效检测染色体外环形DNA（ecDNA）。已有的研究报道表明，染色体外环形DNA在肿瘤发生中比较常见，且致癌基因能够在染色体外环形DNA中进行大量扩增，促进肿瘤发生和转移。SMOOTH-seq技术产生的长读长数据，使其能够被用于在单个细胞中精准捕获小于10kb的全长染色体外环形DNA。本研究同时开发了用于鉴定K562细胞系中的染色体外环形DNA的生物信息学分析方法。当仅有一个拷贝的Tn5转座酶与一个染色体外环形DNA分子结合时，整个环形DNA分子就可被完整扩增为一个线性片段，即单个读段即可覆盖一个染色体外环形DNA分子的全长序列。通过统计Tn5插入位置不同但长度完全相同的一组读段，即可判断它们是否来源于同一个环形DNA。同时该特征可用于帮助精准区分染色体外环形DNA和串联重复序列(如图3所示)。图3:SMOOTH-seq 精准检测染色体外环形DNA的示意图4：该研究开发的SMOOTH-seq方法能以较高准确度检测基因点突变（SNV）。由于三代测序平台本身的局限性，使用 SMOOTH-seq方法在单个细胞中检测SNV的假阳性率为 2.0 × 10-5。(如图4所示)图4: SMOOTH-seq 检测单细胞K562中SNV的假阳性率 5：该研究开发的SMOOTH-seq方法可以在结直肠癌肿瘤样本中准确检测出各种基因组结构变异事件。在对患者结直肠癌肿瘤样本的分析中，以在结直肠癌的至少2个单细胞中同时检测到为标准，该研究检测出8,594个结构变异事件（4,089个插入事件，3,852个缺失事件，341个易位事件，以及312个重复事件）。通过将结直肠癌肿瘤样本和K562细胞系中共有的结构变异去除后，该研究共得到3,570个结直肠癌肿瘤细胞特异性的结构变异事件(1,376 插入事件, 1,661 缺失事件, 230 易位事件以及303 重复事件)。同时，该研究通过设置多个对照基因组（包括相应的肿瘤组织、与肿瘤相邻的正常组织、GM12878细胞系和另一个体的外周血单核细胞的基因组）对检测出的结构变异事件进行了PCR验证。此外，该研究发现结直肠癌肿瘤样本和K562细胞系中共有的结构变异在所有被检测的多个人类基因组DNA样品中均存在，说明这些结构变异事件实际上是由于当前的人类参考基因组不够完善，缺失了部分关键序列信息引起的。今后三代测序将有助于组装出更完整精准的人类参考基因组序列。(如图5所示)图5: PCR验证基因组结构变异的结果综上，该研究开发的单细胞基因组单分子测序技术（SMOOTH-seq），将长读长的三代测序技术巧妙运用到了单细胞基因组测序上，能够实现对于基因组结构变异、染色体外环形DNA等多种分子事件的高精度检测，大大提高了单细胞基因组测序技术的适用范围，具有广阔的应用前景。该研究开创了单细胞基因组单分子测序时代，该研究开发的单细胞基因组单分子测序技术将揭开更多的人类基因组中的“暗物质”的奥秘，给人类生物医学研究带来全新的发展机遇。生物岛实验室研究员范小英、北京大学杨成博士以及北京大学前沿交叉学科研究院博士生李文为该论文的并列第一作者。北京未来基因诊断高精尖创新中心、北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬教授为该论文的通讯作者。该研究项目得到了国家自然科学基金委、北京市科技委和北京未来基因诊断高精尖创新中心的支持。 论文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02406-y

Xevo MRT新品应用速递 在今年ASMS美国质谱年会上，由英国萨里大学和沃特世联合发布的一篇海报，介绍了一套单细胞脂质组学工作流程，这套工作流程采用ACQUITY™ Premier液相色谱(LC)与新型多反射飞行时间质谱Xevo™ MRT系统，以脂质标准品和培养的人白血病单核细胞系建立而得。 结果表明： Xevo MRT可实现单细胞脂质组学分析，具有优异的分辨率、灵敏度、动态范围和质量精度； FACS提供了一种将细胞制备用于单细胞MS分析的精简工作流程； 展示了一套可对各种细胞类型进行单细胞分析的精简LC-MS工作流程。 参数研究和优化 使用浓度为0.5 - 1,000 ng/mL的EquiSPLASH® (Avanti Polar Lipids)稀释系列，在不同参数下进行LC和MS性能基准测试。后续实验选择以粗体突出显示的条件。 色谱柱填料：C18、C30、C8 色谱柱柱长：50 mm、100 mm、150 mm 色谱柱内径：2.1 mm和1 mm 梯度时长：3.7 min、6 min、12 min、19 min、28 min、29 min 流速：0.1 - 0.4 mL/min 图1.浓度为1,000 – 5 ng/mL的18:1 d7 LPC的平均总峰面积。 图2.(A)18:1 d7 LPC的提取离子流图(EIC)和(B)相应的质谱图。50 pg，12 min梯度，10 Hz，MSE，C18 CSH(1.7 µm 2.1×100 mm)。 左右滑动查看更多工作流程 单细胞MS工作流程 选择THP-1、C1R和Jurkat细胞系进行研究。用含有EquiSPLASH(100 ng/mL)的IPA提取混合细胞，并稀释至10,000、1000、100、10和1个细胞/µL的浓度。 此外，通过荧光激活细胞分选术(FACS)将细胞以1、10和100个细胞/孔的数量分配到96孔板中，并用含有EquiSPLASH(10 ng/mL)的IPA进行提取。使用Xevo MRT分析脂质组，并通过Progenesis™ QI、MetaboAnalyst和Lipostar等软件包进行数据分析。 结果 1 THP-1、C1R和Jurkat的BPI显示各类脂质的性质和丰度存在明显差异(图3)。这些细胞的不同特征亦可通过PLS-DA图(未显示)予以确证。从该图可看出，除空白、媒介、内标物和QC样品之外，这些细胞类型相对于彼此的离散位置。 图3.(A)THP-1、(B)C1R和(C) Jurkat(10,000份混合细胞提取)细胞的BPI色谱图。 2 此外，在1、10和100个细胞之间，可以观察到混合细胞稀释法和通过FACS制备的细胞之间存在明显分离(图4)。 图4.(A)通过FACS制备的C1R细胞所得PLS-DA图，(B)使用混合细胞稀释法制备的C1R细胞所得PLS-DA图。使用Progenesis QI鉴定脂质，并借助MetaboAnalyst完成统计分析和图像创建。 3 Lipostar以高置信度标注了各种脂质类别，如图5中的TG 52:4所示，其置信度得分为89.76。 图5.(A)TG 52:4的匹配碎片离子(蓝色，原始MS2，绿色理论碎片离子)，置信度得分为89.76。使用Lipostar和MS/MS验证器工具标注THP-1混合细胞稀释法结果。(B)来自THP-1(10,000个细胞)的MS1数据；(C)来自THP-1(1个细胞)的MS1数据。 4 可以使用LC-MS Toolkit从原始数据中探寻标注的脂质，例如PC 36:2(图6)，此标注可以在整个稀释系列中看到。 图6.(A)从10,000个细胞到THP-1的单个细胞中所提取稀释混合细胞的PC 36:2([M+H]+，计算值m/z 786.6007)总强度。(B)为PC 36:2的代表性MS1谱图，质量精度为380 ppb。 5 THP-1(1000个细胞)的脂质特征突显出从细胞中所提取脂质的样品内动态范围，以及使用Xevo MRT检测超过5个数量级的此类脂质的能力，如图7所示。 图7.Xevo MRT检测到的THP-1细胞内脂质的动态范围。定量曲线由具有通过内部数据库鉴定所得初步鉴定结果的脂质特征组成。 后记 近年来，前沿科学工作者们越来越关注单细胞研究，这也对质谱仪提出了更高的要求，要求其有更高的灵敏度、分辨率及分析速度等，沃特世新发布的多反射高分辨质谱Xevo MRT在较高的扫描速度如100Hz下可实现十万质量分辨率，可对单细胞脂质组进行分析。 本文中使用了Lipostar新软件，可对脂质结构进行快速确认，具体功能详情介绍参见：代谢组学和脂质组学全新软件MARS和Lipostar 2，现在这两款新软件也在限时试用中，可扫描下方二维码进行申请。 △扫描申请试用啦！ 相关阅读： 沃特世推出Xevo MRT质谱仪，为高速、高分辨率的质谱分析树立全新性能标杆 沃特世Xevo MRT新产品发布会在北京圆满举行

细胞是生物结构、功能单元及生命活动的基本单位，对其深入研究有助于进一步认识生命规律。临床样本量通常较少，单细胞多指标分析对疾病早期诊断及预后、药物开发等具有重要意义。为了满足对单细胞多参数分析日益增长的需求，Tanner等提出了质谱流式细胞仪的概念。与传统的荧光流式相比，该仪器基于非光学物理检测原理与金属标签抗体识别细胞，检测通道理论上可达上百种，同时，检测通道之间相互无干扰，具有高灵敏度、高稳定性及低变异系数的优点。 目前常见的质谱流式金属标签是基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸等配位基团的聚合物金属标签（MCP），每条聚合物链上仅连有20-50个金属原子，相当于每个抗体上连有150-200个金属原子，无法实现低丰度标志物的检测。此外，MCP聚合物标签只可与稀土金属和铋等的三价离子配位（对应约40个检测通道），超过60%的同位素通道并没有实际使用，制约了质谱流式在实际应用中的多指标检测能力。由此可见，提高质谱流式金属标签的灵敏度，实现低丰度细胞标志物的检测以及开发新的质谱流式同位素通道，提高质谱流式多指标检测能力是当前质谱流式技术亟需解决的问题。因此，需要开发设计新型的金属同位素载体提高单个金属标签上金属原子个数及负载稀土之外金属元素。 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所研究员白鹏利课题组是国内最早进行质谱流式检测试剂研究团队之一，经过多年的积累，已掌握金属标签的合成、筛选及抗体标记等技术，积累了深厚的学术与技术基础。近期，白鹏利课题组首次提出了一种基于便捷的金属元素掺杂聚苯乙烯纳米球的质谱流式金属标签合成策略，将稀土、锆和铪等金属元素通过溶胀的方法掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中，并进行抗体偶联，制备了一系列质谱流式金属标签，实现了对单核细胞（MNCs）的单细胞高灵敏多指标检测。 纳米颗粒通常会与细胞产生强烈的非特异性吸附，可能导致假阳性结果，影响检测结果的准确性，因此降低材料的非特异性吸附水平对质谱流式检测试剂颇为重要。科研人员通常对纳米颗粒进行复杂的表面修饰来降低材料的非特异性吸附水平，操作繁琐困难。本研究发现改变染色缓冲液成分可有效降低聚苯乙烯纳米材料对细胞的非特异性吸附，例如，使用含10%FBS的PBS缓冲液时聚苯乙烯纳米颗粒与细胞的非特异性吸附水平下降至使用商品化缓冲液的5%，这为改善纳米颗粒类质谱流式金属标签非特异性吸附性能提供了新的发展方向。 该团队将Eu金属掺杂到200nm聚苯乙烯球中后与抗CD8抗体偶联制备的金属标签，可实现对MNCs中CD8+T细胞的有效分群，分群效果与商品化的MCP标签一致，当标签用量为4000NPs/Cell时，检测灵敏度可达到商品化标签的5倍，且该标签对商品化标签表现出颇高的兼容性，证明其具备在实际质谱流式检测中具备应用潜力。 该工作将La、Zr和Hf等金属掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中，与抗CD45抗体偶联制备相应的金属标签，均能够实现对MNCs细胞的分群，并首次实现了177Hf、178Hf、179Hf和180Hf四个元素通道在质谱流式检测中的应用，拓宽了质谱流式检测通道。未来，将其他金属同位素掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中制备金属标签将会开拓更多的元素通道。该工作为质谱流式检测通道拓展提供了一种通用易行的策略。 相关研究成果以A Universal Mass Tag Based on Polystyrene Nanoparticles for Single-Cell Multiplexing with Mass Cytometry为题，发表在Journal of Colloid and Interface Science上（2023, 639, 434-443.）。研究工作得到国家重点研发计划、江苏省自然科学基金、中科院仪器装备项目和中科院青年创新促进会等的支持。 图1.基于金属掺杂聚苯乙烯纳米颗粒的质谱流式金属标签制备策略及单细胞多指标检测示意图 图2.Eu-PS-NPs标签在不同细胞染色缓冲液中对MNCs细胞染色后质谱流式散点图。（a）Fluidigm CSM，（b）PBS，（c-f）5-20% of FBS in PBS，相应信号强度柱状图（g）和热图（h）。 图3.商品化标签及Eu-PS-NPs标签染色后质谱流式散点图对比。（a）141Pr-MCP_CD45、152Sm-MCP_CD3、151Eu-MCP_CD8、159Tb-MCP_CD4，（b）141Pr-MCP_CD45、152Sm-MCP_CD3、151Eu-PS-NPs_CD8、159Tb-MCP_CD4。 图4.Eu、Zr、Hf、La掺杂聚苯乙烯纳米球标签制备及对MNC细胞分群结果

每年2月的最后一天是国际罕见病日，今年的国际主题是“Share your colours”——“点亮你的生命色彩”。罕见病的检测治疗进展如何？国家罕见病医学中心的设置标准、需要哪些科学仪器技术？在上篇中我们汇总了相关内容（点击查看：一文了解罕见病|PCR\基因测序\流式细胞术助力）。本文，跟随安捷伦细胞分析事业部一起了解流式细胞术在罕见病中的应用。——流式细胞术FCM在罕见病中的应用——Flow Cytometry Application【1】诊断和鉴别诊断FCM可以辅助阵发性睡眠性血红蛋白尿和原发性联合免疫缺陷的诊断及鉴别诊断。罕见病及诊断相关检验项目阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH）是一种罕见的获得性造血干细胞克隆性疾病，由于基因突变导致部分或完全的GPI锚合成和表达障碍。FCM通过检测红细胞、粒细胞等不同血细胞群体GPI 锚连蛋白及锚的缺失、精确量化PNH克隆的大小及其特性，可对PNH进行诊断和分型。FCM是当前PNH检测的金标准。PNH流式检测报告单模板及方案：红细胞（CD235a-FITC 和CD59-PE），白细胞（粒细胞：FLAER 和CD24/CD157；单核细胞：FLAER 和CD14/CD157）原发性联合免疫缺陷病（Primary combined immunodeficiency，CID）是一组以T/B细胞缺陷为主，同时可伴有不同程度其他细胞缺陷的异质性疾病。CID中最为严重的类型称为严重联合免疫缺陷病（severe combined immunodefiency，SCID），常引起T细胞数量显著降低甚至缺如，B细胞和NK细胞不同程度降低或功能异常。原发性联合免疫缺陷诊疗流程其它类型罕见病：FCM也应用于其它多种罕见病如X连锁淋巴增生症、重症先天性中性粒细胞缺乏症等的诊疗中。X连锁淋巴增生症（XLP）诊疗流程重症先天性中性粒细胞缺乏症诊疗流程【2】遗传咨询和产前筛查诊断对于有特定免疫表型的PID，可在17周胎龄后进行脐带血穿刺术，通过流式细胞检测进行快速且敏感的产前诊断检测；另外WAS是一种X连锁隐性遗传疾病，女性携带者将致病突变位点传递给其男性后代的概率为50％，当先证者致病突变已知时，可对男性胎儿进行羊毛膜、羊水细胞DNA 测序、脐带血WASp流式检测。【3】PID新生儿筛查除了产前筛查诊断外，对新生儿进行原发性免疫缺陷病筛查，可帮助医患及时诊治新患病的新生儿、提高患儿的生存预后。新生儿SCID筛查流程现有证据表明对于已明确定义的免疫缺陷综合征（WAS、DGS、ATM等）患儿接种灭活疫苗基本是安全的，但不推荐接种活疫苗。PID患儿免疫接种前建议咨询临床免疫学专家明确诊断后再做疫苗接种决定；胸腺发育不全者应免疫评估其淋巴细胞亚群及增殖试验，决定是否接种减毒活疫苗：CD3 + T ≥ 500× 106 /L、CD8+ T ≥ 200×106 /L和增殖试验正常者应接种麻疹-风疹-流行性腮腺炎联合疫苗，胸腺发育不全者 CD3 + T 细胞＜500× 106 /L，WAS禁忌接种减毒活疫苗。PID 患儿接种疫苗的安全性和有效性【4】罕见病的治疗干细胞移植：造血干细胞移植（HSCT）是治疗血液系统疾病、自身免疫性疾病、某些实体瘤和基因缺陷疾病的重要手段之一，尤其是针对罕见病，HSCT是POEMS综合征、WAS等重要治疗手段，更是SCID、重症先天性中性粒细胞缺乏症（Severe CongenitalNeutropenia，SCN）等目前唯一的根治手段。FCM进行CD34+干细胞计数具有快速、简便、可定量等特点，已广泛应用于移植物中HSC/ HPC数量的检测及确定采集时机等。PNH分型及用药：FCM结合其它检测项目可帮助对PNH进行分型，从而指导临床精准用药治疗。针对PNH不同亚型的治疗方法——罕见病的重要发展历程——History of Development2008年2月29日：欧洲罕见病组织eurordis发起国际罕见病日的活动。由于2月29日每4年才出现一次，因此被作为国际罕见病日。在没有29日的那一年，将2月28日作为该年的国际罕见病日。意在通过各种形式来促进人们对罕见病的认识、关注和理解。2018年5月22日：国内发布《第一批罕见病》目录，纳入121种疾病。2019年2月27日：国内发布《罕见病诊疗指南（2019年版）》。2022年12月20日：国内发布《国家罕见病医学中心设置标准》。参考文献1.维基百科，国际罕见病日https://zh.wikipedia.org/zhhans/%E5%9B%BD%E9%99%85%E7%BD%95%E8%A7%81%E7%97%85%E6%97%A52.国家卫生健康委, 科学技术部, 工业和信息化部, 等. 关于公布第一批罕见病目录的通知（国卫医发201810号）［EB/OL］.3.张抒扬, 张学. 近年中国罕见病相关政策和实践探索[J]. 罕见病研究, 2022, 1(1): 1-6.4.国家卫生健康委办公厅关于印发罕见病诊疗指南（2019年版）的通知http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7659/201902/61d06b4916c348e0810ce1fceb844333.shtm5. 国家卫生健康委办公厅关于印发国家罕见病医学中心设置标准的通知http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s3594q/202212/a9b6203ebb7f4833ab68d77486008d50.shtml6.中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断与治疗中国专家共识 [J] . 中华血液学杂志,2013,34( 03 ): 276-279.7.王晓川, 文旻. 原发性免疫缺陷病的产前诊断和出生筛查 [J] . 中华实用儿科临床杂志,2017,32 (21): 1601-1603.8.王晓川. 原发性免疫缺陷病与预防接种 [J] . 中华儿科杂志,2020,58 (05): 440-442.预防接种知情告知专家共识(上)[J].实用预防学,2021,28(04):385-411.9.孙金峤.特殊健康状态儿童预防接种专家共识之三——原发性免疫缺陷病的预防接种[J].中国实用儿科杂志,2018,33(10):740-742.10.万岁桂,刘艳荣.CD34阳性细胞绝对计数的流式细胞术测定指南[J].中华血液学志,2015,36(07):539-546.

对于许多适应症，细胞疗法是一种越来越可行的治疗选择，尤其是对于已经用尽传统治疗方法的患者。大量的临床活动和几种自体、患者特异性疗法的批准增加了行业需求，也突显了生产工作流程中的瓶颈。必须解决这些瓶颈，以提高生产效率、安全性以及及时向患者交付。在自体环境中，每个患者的健康状况和人口统计数据转化为一个独特的细胞群体，这给随后的细胞治疗生产过程带来了可变性。因为存在这种可变性，这意味着过程控制在确保药品一致性方面的重要性。一个重点领域是过程分析技术（PAT），这对于在整个生产过程和QC检测中提供关键质量属性（CQA）信息至关重要。实时过程反馈对于加强过程监控以确保生产成功至关重要，但关键过程反馈往往因检测时间过长而延迟。在最近的一次美国基因+细胞治疗学会（ASGCT）在线会议上，Bristol Myers Squibb的Rich Rogers概述了基于质谱的过程分析策略，以支持细胞治疗过程的开发和优化。Rogers概述了PAT的分析需求和仪器要求，以及基于MS的PAT如何有望成为一种强大的技术，以克服当前分析工具所面临的许多挑战。CAR-T疗法的属性监测Rogers首先概述了BMS用于开发其基于自体慢病毒的CAR-T平台的平台。在生产自体CAR-T疗法时，这一过程始于使用白血病细胞采集患者的细胞。一旦收获了单核细胞，在细胞疗法可以重新应用到患者体内之前，需要采取许多步骤来分离、激活、改造和扩增T细胞。目前，BMS使用PAT来监测细胞增殖（即活率、细胞密度），并在每个阶段使用流式细胞法来进行T细胞和杂质分析（即污染细胞类型的存在）。虽然这些工具的数据是足够的，但有机会对细胞健康和代谢状态进行更深入的监测还是有必要的，因为这很可能会影响最终产品的疗效。实施PAT的可能性是无限的，适用于生产过程的各个方面。PAT可用于确定工艺杠杆，以确保产品的一致性，并提高上游（即温度、pH、葡萄糖、氨基酸、细胞活率和代谢物）和下游（即工艺相关杂质）的生产成功率，以及量化最终产品中的CQA（即纯度、效力、安全性和CAR频率）。Rogers概述了使仪器适用于过程PAT的一些关键功能：&bull 仪器占地面积：生产洁净间通常空间有限，因此需要考虑仪器尺寸&bull 资本投资：与研发仪器不同的成本考虑&bull 生物测定的数量：可以进行多属性测试的仪器是首选&bull 低体积样品要求：尤其是在生产过程中，通常无法采集大体积样品进行过程中检测&bull 运行分析的时间：从采样到得到数据的时间应该很快；检测时间对于提供相关过程反馈至关重要&bull 技术专业知识要求低：操作过程中仪表所需的培训应较低，且无需专家参与&bull 数据速度：尽可能短/接近实时，对生产过程产生最大效益基于质谱的PAT策略Rogers详细介绍了BMS为过程分析开发的基于MS的非目标和目标PAT策略。MS是一种公认的技术，用于在单克隆抗体等大分子治疗中生成稳健且可重复的数据。然而，将这一策略应用于涉及数千种蛋白质的细胞治疗会带来需要解决的障碍。一个障碍是作为CAR-T疗法基础的细胞的复杂性。大分子治疗只需要纯化单克隆抗体，而细胞治疗可能需要考虑数千种蛋白质。因此，传统的大分子MAM（Multiple Attribute Methodology）方法不能直接应用于细胞治疗。基于蛋白质组学的PATRogers还描述了BMS使用的基于MS的细胞表面蛋白质组学方案，该方案在整个生产阶段对T细胞进行非靶向细胞表面分析。细胞表面蛋白用生物素标记，然后进行细胞裂解、标记的链霉亲和素富集、酶促消化和MS分析。这种非靶向方法是有利的，因为它不需要特异性靶向细胞表面蛋白的试剂（与流式细胞法方法不同），这提供了T细胞表面蛋白组成的无偏见的全局视图。过程残留和分泌蛋白监测是另一个正在开发多属性靶向蛋白质组学方法来取代ELISA的领域，ELISA受到开发靶向特异性检测试剂的需要的限制。这种MS方法是高度敏感的，因此允许同时对数百个蛋白质靶标进行多重定量。从色谱分离、片段化和Orbitrap MS分析中选择靶向肽，提供了过程残留物和T细胞分泌蛋白的定量检测。在总结这些蛋白质组学方法时，Rogers评论道，虽然他们对结果的准确性感到鼓舞，但这种方法仍需要努力，以满足他在演讲早些时候概述的PAT要求。MS仪器占地面积大，成本高，人员培训广泛，需要提高数据传输速度，以便在生产运行期间实时向实验人员提供及时的信息。基于靶向代谢组学的PAT在演讲的后半部分，Rogers使用REBEL分析仪（908 Devices）专注于基于代谢组学的靶向PAT。该台式设备通过采集来自生物反应器的培养基反应液来对T细胞进行在线代谢分析。细胞分泌和代谢产物分析可以提供关于细胞健康和效力的有价值的信息。BMS计划在过程开发的每个阶段利用REBEL分析仪来实施代谢组学的研究。这包括慢病毒载体的组建以及T细胞增殖过程本身，其中REBEL分析仪已被用于提供关于T细胞健康和代谢状态的有价值的信息。REBEL分析仪满足PAT的所有要求：&bull 占地面积小（微波炉大小），成本合理&bull 同时监测30多种分析物&bull 只需要10μl样品体积&bull 移液技能是唯一的技术要求&bull 所需培训最少&bull 检测时间快-大约~7分钟/样本&bull 快速获取数据：集成软件执行分析并自动生成报告，该报告可以导出为与LIMS、PIMS兼容的CSV或PDF文件在方法和仪器评估过程中，使用REBEL对同一生物反应器运行的三个单独样品进行5次重复，以证明高重复再现性，如下图1所示。在结束演讲时，Rogers强调了PAT对提高细胞疗法的工艺理解和生产成功的重要性。对PAT和创新技术的投资正在推动当前方法的通量和准确性极限，Rogers表示，他认为基于MS的方法在靶向和非靶向蛋白质组学和代谢组学表征方面都有很大的机会。在整个细胞治疗制造过程中提供对T细胞的广谱、全局评估。在研讨会的下一次演讲中，908 Devices的产品经理Kerin Gregory分享了如何使用REBEL分析仪通过对细胞培养基（即氨基酸、维生素、生物胺）的快速成分检测来实现及时和有用的过程分析。细胞培养基为离体培养的细胞提供关键营养，并对细胞生长、生产力和后续治疗的功能有直接影响。深入的培养基分析可以帮助深入了解营养的消耗，以促进培养基优化工作，从而提高CQA。营养成分分析和培养基优化特别是对于病毒载体的生产，满足临床和商业目标的需求需要提高病毒滴度。因为克隆差异会影响宿主细胞（即HEK293）的代谢，培养基/反应液成分分析可以更好地了解宿主细胞的需求，并为优化培养基以提高病毒滴度提供了机会。虽然市场上有许多商业培养基配方，但相对浓度和组成成分可能差异很大，如下图2所示，这些不同的培养基选择可能对病毒载体的滴度和完整性产生重要影响。REBEL也可用于监测所选配方中的批次差异，以确保一致性和重复性。此外，研究表明，T细胞培养基需要几种关键氨基酸来调节体外激活和扩增，它们在CAR-T细胞的代谢准备状态和引入体内肿瘤微环境后的抗肿瘤功效中发挥作用。这强调了细胞培养基成分对细胞生长、代谢和生产力的深远影响。血清置换Gregory补充道，由于两个原因，细胞治疗行业已经从含血清的培养基配方转向无血清：1）血清存在批次间的差异；2）除了在临床应用中的免疫原性风险之外，血清还具有潜在的被外来成分污染的风险。化学限定培养基（CDM）的开发代表了一个领域，在这个领域，REBEL可以用来表征成分，用于培养基的的配方工作。REBEL的动态范围为5-100μM，可准确检测低浓度的氨基酸和其他营养物质。与其他定量方法不同，分析不受血清蛋白存在的影响。

2024年4月1日，卫健委发布WS/T360-2014《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，本标准于2011年首次发布，本次为首次修订。与WS/T360-2011相比除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下:【1】增加了流式细胞仪性能验证内容(见5.1)；5.1流式细胞仪的性能验证5.1.1 验证时机当新仪器启用前、搬移后、仪器发生重大维修(如更换激光、光纤、光电倍增管或流动室等)后、仪器软件系统更新后、仪器性能出现问题或环境严重失控时，需对流式细胞仪进行性能验证，所用流式细胞仪应符合医疗器械注册要求。荧光通道线性应在流式细胞仪常规使用过程中每年至少进行1次验证。5.1.2 验证参数验证参数应包括灵敏度、分辨率、荧光通道线性、仪器稳定性和携带污染率等。5.1.2.1 灵敏度5.1.2.1.1 散射光灵敏度采用己知大小的校准微球检测仪器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散点图上，应检测出直径0.5μm或更小的微球，或满足制造商声明的要求。5.1.2.1.2 荧光灵敏度即流式细胞仪能检测到标准荧光微球上的最少荧光分子数，可用等量可溶性荧光分子(MoleculesfEquivalent Soluble Fluorochrome，MESF)表示。可采用2~4种不同荧光素校准微球针对所用激发光源进行检测，其中FITC、PE及APC等通道的平均荧光强度(x)与其荧光分子数(y)分别进行双对数线性回归，得公式y=a+bx，其截距a的反对数值即为流式细胞仪的荧光灵敏度。FITC的荧光灵敏度应≤200MESF、PE的荧光灵敏度应≤100MESF、APC≤200MESF，或满足制造商声明的要求。5.1.2.2 分辨率5.1.2.2.1 散射光分辨率采用EDTA盐或肝素抗凝全血，取适量样品稀释后直接上机测定，标本在FSC/SSC散点图可将红细胞和血小板清晰地区分开 取适量样品裂解红细胞后上机测定，标本在FSC/SSC散点图可将淋巴细胞、单核细胞、粒细胞清晰地区分开，即认为散射光分辨率符合要求。示意图参见附录A。5.1.2.2.2 荧光通道分辨率采用校准微球上机测定，各荧光通道的分辨率CV值应符合制造商声明的要求。5.1.2.3 荧光通道线性可采用含有不同荧光强度的校准微球(已知其相应荧光素的可溶性荧光分子数)进行检测，计算每-种荧光微球的MFI，MFI与己知理论值的相关系数r应≥0.98，此方法适用于校准微球上的荧光素可被定量检测的荧光通道。亦可同时使用两种荧光强度不同的微球，在待测荧光通道下，通过改变光电检测器的电压，使两种荧光微球的实际MFI检测值由低到高分布,两种荧光微球的荧光强度比值应保持不变。此方法适用于流式细胞仪所有荧光通道。5.1.2.4 仪器稳定性连续开机条件下，采用荧光微球在开机稳定后0h和8h各检测一次FSC及各荧光通道的IFI，以第一次检测时间点测定的各通道MFI值作为基线值，荧光微球8h上机测定的每一通道的MFI变化范围均应在基线值土10%范围内。5.1.2.5 携带污染率使用浓度为5000个/HL~10000个/HL的校准微球上机进行测定，获取至少100000个颗粒，连续测定3次，计算检测通道内设定区域的颗粒数，分别记为H1、H2、H3:再使用空白溶液上机测定，获取颗粒303，连续测试3次，计算该检测通道内设定区域的颗粒数，分别记为L1、L.2、L3。按照此步骤重复循环3次。按携带污染率公式[(L1-L3)/(H3-L3)]X100%进行计算，取最大值。携带污染率应≤0.5%。【2】完善了仪器质量控制和项目性能验证内容(见5.2、7.2.2)；5.2外周血淋巴细胞亚群检测系统的性能验证5.2.1 验证时机及验证内容淋巴细胞亚群检测项目临床开展初期、更换试剂品牌、更换检测系统或仪器的重大部件维修后，应对检测项目的精密度、稳定性、线性范围、可比性和正确度等参数进行验证。5.2.2 验证方法建议使用配套试剂盒时开展性能验证，使用自选试剂时实施性能确认:需要分别描述性能验证和性能确认的方法和评价标准。5.2.2.1 精密度5.2.2.1.1 批内精密度选取至少5个新鲜全血样品，样品的淋巴细胞亚群细胞计数应覆盖低中高水平。每个标品从荧光染色到上机检测重复3次，并确保所有测试都在同一台仪器的同一批内测定，整个操作过程由同一个操作人员完成。先计算每个样品重复3次后检测结果的CV,然后计算所有样品的平均CV，所有样品的平均C宜10%，最大不超过20%。实验室可根据不同水平的淋巴细胞亚群细胞计数设定不同程度的可接受Q标准。5.2.2.1.2 日间精密度宜使用正常和异常两个浓度水平的全血质控品，每天从荧光染色到上机测定重复操作3次，至少市复4天，整个操作过程可由不同操作人员完成。先计算每天每个全血质控品重复3次检测结果的CV值，然后据此计算每个全血质控品4天的平均CV，最后得出两个全血质控品检测结果的平均CV。结果判定同本标准第5.2.2.1.1条。5.2.2.2 稳定性5.2.2.2.1 样品稳定性验证样品在确定的抗凝及处置条件下的稳定性。采集健康人或患者的样品至少5份，即刻染色-裂晖-固定并上机测定，以此结果作为基线参考水平，按照实验室的具体环境温度控制条件和预期的样品待检时间，在抗凝剂保存时间内，设置不同的时间点对上述样品进行重复处理和上机测定，获取检测结果，并与基线水平结果进行比较以相对偏差或绝对偏差表示,检测结果应符合实验室制定的验证要求。险证要求的制定应考虑不同水平的淋巴细胞亚群计数设定不同程度的偏差值，淋巴细胞亚群计数过低者，宜以绝对偏差进行验证:亦可对试剂说明书声明的稳定性条件进行验证。5.2.2.2.2 处理后标本稳定性旨在明确处理后标本的最长待检时间。采集健康人或患者的样品至少5份，对完成染色-裂解-固定后的标本即刻上机检测结果作为基线水平。按实验室获得检测结果的最长可接受时间为期限，设置不回的时间点对固定后标本进行上机检测。结果判定同本标准第5.2.2.2.1条。亦可对试剂说明书声明的稳定性条件进行验证。5.2.2.3 线性范围适用于淋巴细胞亚群绝对细胞计数。根据试剂说明书声明的线性范围，取一份淋巴细胞计数或亚群计数接近线性范围上限的临床样品，采用样品稀释液按照比例制备5~9个不同浓度的标本(如0、25%、50%、75%、100%等)，浓度范围应覆盖临床医学决定水平:通过染色-裂解-固定后，上机测定，每个标本重复测定4次，取均值。分析实际测定的亚群细胞数量均值与理论值之间的相关性，相关系数应≥0.975。5.2.2.4 可比性5.2.2.4.1 不同检测系统间的可比性验证宜使用至少5份新鲜全血样品(样品的淋巴细胞亚群细胞计数应覆盖低中高水平)和2份不同浓度水平的全血质控品，完成染色-裂解-固定后，分别采用待评价检测系统和比对检测系统进行检测。比对检测系统应为仪器性能良好、规范开展室内质量控制、室间质量评价成绩合格的淋巴细胞亚群常规检测系统，以比对检测系统的测定结果为参考，计算相对偏差或绝对偏差。检测结果应符合实验室制定的验征要求。验证要求的制定应考虑不同水平的淋巴细胞亚群计数设定不同程度的偏差值，淋巴细胞亚群计敬过低者，宜以绝对偏差进行验证。5.2.2.4.2 抗体试剂批次变更前后的可比性验证宜使用至少3份健康人的新鲜全血样品和2份不同浓度质控品采用新批号抗体试剂和当前批号抗体试剂进行荧光染色、上机检测，以当前批号试剂检测结果为参考，计算相对偏差或绝对偏差。检测结果立符合实验室制定的验证要求,验证要求的制定应考虑不同水平的淋巴细胞亚群计数设定不同程度的偏叁值，淋巴细胞亚群计数过低者，宜以绝对偏差进行验证。5.2.2.4.3 不同检测人员间的可比性验证宜使用至少5份新鲜全血样品和2份不同浓度水平的全血质控品分别由实验室内淋巴细胞亚群检测培训合格的不同检测人员完成染色-裂解-固定、上机检测和数据分析，计算不同检测人员间检测结果的相对偏差或绝对偏差。验证结果应符合实验室制定的验证要求。5.2.2.5 其他可使用室间质评回报结果验证淋巴细胞亚群项目的准确度亦可采用包含正常和异常浓度水平的具有溯源链的定值样品验证正确度，每一样品重复测定3次，每次测量值均在给定范围内且3次测量值的均值与标准值的偏倚在允许范围内为通过。选择至少20份表观健康人样品按照常规方法进行淋巴细胞亚群参考区间验证。7.2.2 仪器稳定性验证7.2.2.1 光路/液路稳定性验证检测当天宜使用校准微球进行光路/液路稳定性验证。记录每个检测通道的分辨率的变异系数(CV)，CV值应满足本标准第5.1.2.2.2条荧光通道分辨率要求。7.2.2.2 检测通道电压稳定性验证和调整应使用标准微球进行各检测通道电压验证检测通道电压的浮动应在标准微球的说明书允许范围或者实验室自建的可接受范围内。自建方法如下:在相同的电压设置下，10~20个工作日内检测标准微球20次，使用Levy-Jennings图建立每个参数的可接受范围(均值士2SD和均值士3SD)。【3】梳理和保留了检验前、检验中、检验后过程的内容及要求(见第6、7、8章)；【4】删减了标本采集和处理及临床意义内容(见2011年版的第4、10章)；【5】增加了淋巴细胞亚群六色分析方案(见4.1.3、附录C)。以下为完整内容：本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询,由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位:中国医学科学院肿瘤医院、北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市交通大学医学院附属第一人民医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海长征医院、苏州大学附属第一医院/江苏省血液研究所。本标准主要起草人:崔巍、彭明婷、屈晨雪、黄春梅、李莉、沈立松、周琳、朱明清、崔婵娟、李臣宾。

杨州大学生物科学与技术学院人畜共患病与免疫学研究室焦新安教授领导的课题组采用现代分子生物学方法，研制成功一种ELISA试剂盒研制细菌快速检测成功，该试剂盒能同时检测沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌两种病原菌，并且整个检测过程只需两天，远比国标法快速，且敏感性高、特异性强，结果分析简单。 产单核细胞李斯特菌经过扩增后出现的不同特异性条带，ELISA试剂盒来达到检测目的。整个检测过程24小时左右，并做到随时随地取样，定性检测出食品中的沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌。 该ELISA试剂盒具有高度的特异性、敏感性、快速简便、费用较低等优点，既可保证样品检测的准确性和可靠性，ELISA试剂盒又可节省大量的人力、物力和财力，有巨大的社会经济效益，极具推广应用价值。可广泛应用于食品加工、市场检疫、出入境检验检疫、医院临床检测等行业和机构。

前言B 细胞具有产生针对多种靶标的抗体的独特能力，可提供针对感染的保护，同时还有助于免疫失调环境中的发病机制。人类 B 细胞分为五个群体：过渡、幼稚、非转换记忆、转换记忆和浆细胞。识别和分类人类 B 细胞的功能亚群，阻碍了作者在自身免疫中选择性靶向致病性 B 细胞和在疫苗接种中诱导记忆反应的能力。为了表征外围成熟的人类 B 细胞，本文作者开发了一种高度复用的单细胞筛选方案，通过使用大规模细胞术来量化 351 个表面分子的共表达。基于作者的研究结果，作者提出了一种分类方案，将来自外周血、骨髓、淋巴结和扁桃体四个组织的的 B 细胞分为 12 个独特的亚组，并构建了具有表面表型、代谢、生物合成活性和对免疫激活的信号反应特征的广泛单细胞图谱。这个人类 B 细胞身份图谱将使研究能够在稳态、疫苗接种、感染、自身免疫和癌症的背景下进一步确定 B 细胞亚群的功能。本篇为斯坦福大学研究团队在 Immunity期刊（IF:43.474）发表的题为 “An Integrated Multi-omic Single-Cell Atlas of Human B Cell Identity”的研究成果，采用改进的质谱流式细胞仪、流式细胞术等研究方法，成功量化了百万级人类B 细胞上 351 种表面分子的共表达模式。通过鉴定了差异表达的分子，对比VDJ 序列、代谢谱、生物合成活性和信号反应。提出了新的 B 细胞分类方案：在四种淋巴组织中鉴定出 12 个独特的亚群，包括 CD45RB + CD27 -早期记忆群体、类别转换的 CD39 +扁桃体常驻群体和有效响应免疫激活的 CD19 hi CD11c +记忆群体。该分类框架和基础数据集为进一步研究人类 B 细胞身份和功能提供了资源。技术流程研究结果1.高度多重的单细胞表面筛选揭示了人类 B 细胞表面蛋白质组为了识别区分 B 细胞亚群的分子，作者开发了多重筛选的方法，并量化了健康人类 B 细胞上 351 种表面抗原上的共表达模式（图1A）。通过设计了 12 个质谱抗体组，每个组由 9 个用于子集的保守分子和 30 个对每个组独特的可变分子组成。门策略可以实现四个典型 B 细胞亚群：过渡、幼稚、非转换记忆和转换记忆（图1B）。在设置了一个严格的阈值（图 1 C）后，作者确定了 98 个在人类 B 细胞上表达的表面分子（图 1D)。作者的单细胞筛选策略实现了对人类 B 细胞表达的表面分子的可靠鉴定。图1 |高度多重的单细胞表面筛选揭示了人类 B 细胞表面蛋白质组a)实验概述 (n = 2 个捐助者)。b)典型种群的代表性门控。c)屏幕上分子阳性的代表性阈值。d)总 B 细胞（顶行）的百分比阳性和 B 细胞表达的分子子集（底行）的中值表达。2.差异表达分析揭示了幼稚 B 细胞的无反应特性通过规范门控策略识别组织B 细胞的成熟状态：从过渡到幼稚、非切换和切换记忆。为了探究在整个过程中发生的蛋白质组学变化，作者评估了所有分子的子集中每个成对组合之间的表达差异。作者绘制了 61 个差异表达分子（图2A ）。正如预期的那样，未成熟的同种型 IgD 和 IgM 在过渡和幼稚亚型中富集，而经典记忆分子 CD27 在记忆细胞中富集。CD305在抗原缺乏经验的细胞中比记忆细胞富集， CD45RB (RB) 是 CD45 的同种型，优先在记忆细胞中表达。作者绘制了幼稚细胞与其他子集的比较（图2B），作者发现幼稚细胞表达的与运输相关的分子数量少于任何其他子集，这表明它们对刺激的反应较小。事实上，幼稚细胞对 16 种转运分子的中位表达值最低，在所有 46 种转运分子中平均表达最低（图 2C）。作者探索了这种趋势在 GO 术语中是否一致，并发现幼稚细胞在 30 个术语中的 19 个具有最低的平均表达值（图 2 D）。事实上，当对所有 98 个分子的中位表达值进行平均时，幼稚细胞的平均值最低，这表明它们比其他 B 细胞亚群处于更无反应的状态。这些发现证实了幼稚 B 细胞的无反应特性。图2 | 差异表达分析揭示幼稚 B 细胞a)子集的每个成对比较的中值表达差异。所有非白色瓷砖都是显著的（p 0.005）。b)比较的火山图，与 GO 术语“运输”相关联。框中列出的显著不同的分子按表达差异幅度的递减排序。c)转运分子 (颜色) 的中值表达。所有转运分子的中位表达平均值（黑色）。d)与 GO 术语相关的分子的中值表达平均值 (颜色)。所有分子的中值表达的平均值（黑色）。e)在幼稚细胞中表达更高的六种分子的表达 (p 3.CD45RB 标记人类记忆 B 细胞并识别早期记忆群体为了找到唯一识别不同 B 细胞的标记，作者以无偏方式分析了所有 B 细胞中分子的共表达模式。作者生成了统一UMAP图，通过使用所有 12 个试管的供体汇集数据来展示保守分子的表达（图 3A）。作者绘制了与保守分子相关的分子，并按功能和相关保守标记进行展示（图 3 B）。在 UMAP 坐标上叠加规范门控标签，尽管表型相似，但细胞被规范门控视为不同的子集（图 3C）。大多数 CD27 +细胞也是 RB +，而 RB + CD27-群体包含 25% 未封闭的细胞（图 3 D 和 3E）。鉴于 RB + CD27 -细胞和 CD27 +细胞在 UMAP 上的共定位，作者假设这些细胞代表在当前分类方案下未被识别的记忆细胞群。为了评估 RB 和 CD27的记忆细胞谱，作者前瞻性地从健康的人类 B 细胞（n = 2 个供体）中分离出 CD27 × RB双阳细胞，并通过下一代测序对 IgH 基因座进行测序（图 3 F）。作为抗原暴露的代表，作者测量了互补决定区 3 (CDR3) 之外的 IgH 基因座中核苷酸的供体汇集突变频率（图 3 G）。正如预期的那样，CD27 +细胞具有相对较高的突变负担，在接触抗原后通过体细胞超突变 (SHM) 获得。作者量化了四个种群在一系列多样性顺序中的多样性并发现 RB - CD27 -细胞的多样性最高，而 RB + CD27 +细胞的多样性最低（图 3 H）。作者进一步探索来自一个群体的细胞是否倾向于与来自任何其他群体的细胞克隆相关（图 3 I）。作者发现来自四个群体中的每一个的细胞都更有可能与来自同一群体的细胞共享克隆谱系，而不是来自不同群体的细胞（图 3J)。这表明 RB 和 CD27 的表达在克隆谱系中是高度协调的，正如对响应抗原结合而表达的两种分子所预期的那样。总之，这些发现提供了强有力的证据，表明 RB 的表达是外周血记忆 B 细胞的指示，并且与 CD27 的缺失相结合，可用于对早期记忆群体进行分类。图3 | CD45RB 标记人类记忆 B 细胞并识别早期记忆群体4. 将 B 细胞分为表型和同型不同的亚群系统筛选了数十种在 B 细胞中差异表达的分子，因此作者假设作者可以将 B 细胞分类为更细粒度的亚群。作者对新鲜、健康的人类外周血 B 细胞（n = 3 名供体）进行了染色，细胞降维成十个不同的群体，包括两个幼稚和六个记忆子集（图 4 B）。表面表达谱提示成熟顺序排列（图4B）。七种不同分子的特征表达以手动门控每个群体，因此也用于标记该方案中的群体：CD11c、CD73、CD95、CD27、CD38、RB 和 CD19（图 4 C D）。子集倾向于在图上形成独特的岛屿，为作者的分类方法提供正交验证 （图 4 D）。为了评估子集之间的表型相似性，作者计算了中值表达谱之间的成对欧几里得距离（图 4 E）。对于每个群体，作者量化了表型最相似的子集。RB + CD27 -记忆和 RB + CD27 + CD73 -彼此最相似，进一步验证了 RB + CD27 -细胞作为记忆子集的状态。在汇总数据（图 4 F）中，组织 B 细胞也会导致跨个体供体存在同种型。通过规范门控，30% 的 IgG +细胞和 20% 的 IgA +细胞由于缺乏 CD27，这表明 CD27 单独作为记忆分子的不足（图 4 G）。相比之下，作者的方法正确地将超过 99% 的 IgG +和 98% 的 IgA +细胞分类为记忆细胞。已知 Ig 同种型的使用会影响下游效应器功能和分化模式。因此，作者还在同种型的基础上组织了 B 细胞，并观察到BCR 复合物的两种成分的不同表达模式：表面 Ig 和 CD79b（图4H）。鉴于这些趋势，作者探索表型或同种型是否对预测表面 Ig 和 CD79b 的表达量贡献更大。作者创建了单细胞多元线性回归模型，其中细胞的表型标记和同型标记用于预测 CD79b 或表面 Ig 的表达（图4H）。尽管两者都提供了丰富的信息，但细胞的同种型对预测两种分子的表达的贡献超过了细胞的表型。总而言之，这些发现表明，作者的高维分类将外周血 B 细胞组织成十个表型不同的亚群，比典型的门控策略更准确地划分细胞。此外，这些表型分区显示出同型限制，这进一步有助于 B 细胞的身份。图4 | 将 B 细胞分为表型和同型不同的亚群5. B 细胞亚群功能的研究提示了不同的代谢、生物合成和免疫信号活性特征为了研究作者改进的 B 细胞分类方案的功能特性，作者探索表面蛋白是否表示其他潜在功能细胞过程的差异。作者对来自其他供体（n = 9 个供体）的健康人外周血单核细胞 (PBMC) 进行了染色，并使用质谱仪组来探索 B 细胞代谢谱、生物合成活性和免疫信号传导特征（图 5A）。作者量化了与四种代谢途径相关的八种酶的表达：糖酵解或发酵、ATP 感应、氧化磷酸化和脂肪酸氧化 (图5B )。幼稚细胞在所有亚群中的表达最低，而 RB + CD27 -记忆细胞具有介于幼稚和记忆亚群之间的中间代谢特征。这些通路使用的差异可能是由于不同的功能作用，因此不同的代谢需求。通过将 5-溴尿苷 (BRU) 和嘌呤霉素标记与质谱仪相结合，量化从头RNA 和蛋白质合成以及功能和表型特征。作者发现转录活动几乎不能解释在翻译活动中观察到的差异 (图 5 C)，突出了这两个过程的差异调节。CD19 hi CD11c +记忆细胞具有最高的中位转录活性，其次是 CD73 +幼稚细胞，其具有最低的中位翻译活性（图 5D)。发现转录活性浆细胞中的翻译活性和 CD184 表达高于转录lo浆细胞（图 5E)。这种转录活跃的群体可能是长寿命的浆细胞，而转录不活跃的群体可能是短寿命的浆细胞。为了评估亚群之间免疫激活敏感性的差异，作者用不同剂量的 BCR 交联剂和 CD40 配体刺激 B 细胞 10 分钟，然后用包含抗B 细胞信号传导固有的磷酸化靶标（图 5A）。作者测量了脾酪氨酸激酶 (pSYK) 和下游磷脂酶 Cγ2 (pPLCγ2) 的磷酸化（图 5F）。作者在双轴等高线图上可视化了 BCR 复合信号级联中两个分子 SYK 和 PLCγ2 的磷酸化状态变化，并发现子集之间的分布变化存在鲜明对比（图 5 H）。为了量化信号响应，作者计算了推土机在基线细胞和受刺激细胞之间的距离，发现这两个记忆群体以及浆细胞比所有其他子集的响应性明显更高（图 5 I）。作者量化了表型和同种型使用的相对贡献，以预测代谢途径表达、生物合成活性和信号响应的表达（图 5J)。总的来说，这些发现表明作者的表型分类捕获了代谢途径使用、生物合成活性和对免疫激活的信号反应的功能差异。图5 | B 细胞亚群功能的研究揭示了不同的代谢、生物合成和免疫信号活性a)实验工作流程 (n = 9 捐助者)。6. 淋巴组织特异性 B 细胞群的表征为了将人类 B 细胞分析的范围扩大到外周血之外，作者分析了来自外周血的骨髓 (n = 3)、扁桃体 (n = 3)、淋巴结 (n = 1) 和其他外周血样本 (n = 4)一个新的健康捐赠者队列（n = 11），通过大规模细胞术（图 6A）。为了探索组织之间 B 细胞表达的整体差异，作者评估了所有分子的供体组织表达差异。作者确定了至少一对组织之间存在差异表达 (p 0.005) 的 21 个分子，并绘制了它们的分布，按功能组织（图 6 B）。淋巴结也明显偏向未成熟同种型（图 6 C）。然而，扁桃体没有富集任何抑制分子（图 6 B），主要由具有记忆表型的细胞组成（图 6 C 和4 G）。为了评估组织内 B 细胞表型的组成，作者绘制了子集比例图，并且根据同种型数据，作者发现淋巴结大量富含 CD73 +幼稚细胞（图 6 D）。为了评估组织的差异性，作者根据子集组成计算了每个组织之间的成对曼哈顿距离（图 6 E）。作者确定了外周血中不存在的两个亚群：生发中心 (GC) B 细胞，存在于扁桃体和淋巴结中，以及一个 CD39 +扁桃体群（图 6 D)。GC 细胞是 CD38 +和 CD32 - (图 6 F)。图6 | 淋巴组织特异性 B 细胞群的表征a)实验工作流程 (n = 11 捐助者)。b)分子的小提琴图在至少两种组织中显著差异表达 (p 0.005)。研究讨论为了探究原代细胞的深层表型多样性，作者开发了一种高度多重的单细胞表面筛选，并将其应用于识别可以分离人类B 细胞亚群的分子。这种方法使作者能够区分四种淋巴组织中的 12 个 B 细胞亚群并关联它们的功能特征。作者确定了六个记忆群体，证实了先前关于小鼠和人类抗原识别后表型多样化的报道。作者还确定了一个 CD19 hi CD11c +记忆群体，它与在自身免疫、感染和衰老背景下描述的几个群体具有一些共同特征。卡内尔等人，2017）。在这个群体中，作者通过 CD27 表达分离细胞，发现 T-bet 和 PD-1 在 CD27 - CD19 hi CD11c +记忆细胞中富集，类似于在 T 细胞中看到的效应记忆表型。在这里，作者通过对健康个体中多组学整合进行的深度表型分析揭示了新的、更细的B群体确定，全面映射了人体血液和淋巴组织中的 B 细胞身份。对几个细胞过程中表型与同种型使用的贡献的定量评估突出了对超越谱测序和同种型身份进行分析以了解人类 B 细胞免疫功能的必要性。研究结果作为未来研究在疫苗接种或疾病背景下研究体液免疫反应的资源，描述的群体和分子可能对于理解 B 细胞介导的发病机制或保护至关重要。