蛋白干转仪

8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。 仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。

许多人喝牛奶是为了补钙，不过你如果留心一下国内鲜牛奶包装上的标注，一般没有列出钙的含量，标明的营养成分含量只有两种：脂肪和蛋白质。鲜牛奶有全脂、低脂、脱脂之分，其脂肪含量各不相同，而且在脂肪被视为健康杀手的今天，一般人不会在乎脂肪含量是否达标。蛋白质才是牛奶中的主要营养成分，鲜牛奶包装上都会注着蛋白质含量为100毫升≥2.9克，以表明符合鲜牛奶的国家标准（100毫升≥2.95克）。 生鲜牛奶的蛋白质含量一般在3％以上，所以一般都能达到国家标准，除非往原奶中兑水。要提防有人拿水卖出奶价钱，就有必要在收购生鲜牛奶时检测蛋白质的含量。根据蛋白质的化学性质，有几种检测方法，各有优缺点。食品工业上普遍采用的、被定为国家标准的是凯氏定氮法。这是19世纪后期丹麦人约翰凯达尔发明的方法，原理很简单：蛋白质含有氮元素，用强酸处理样品，让蛋白质中的氮元素释放出来，测定氮的含量，就可以算出蛋白质的含量。牛奶蛋白质的含氮率约16％，根据国家标准，把测出的氮含量乘以6.38，就是蛋白质含量。 所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，显然，如果样品中还有其他化合物含有氮，这个方法就不准确了。在通常情况下，这不是个问题，因为食物中的主要成分只有蛋白质含有氮，其他主要成分（碳水化合物、脂肪）都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。但是如果有人往样品中偷加含氮的其他物质，就可以骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质高含量，用兑水牛奶冒充原奶。 常用的一种冒充蛋白质的含氮物质是尿素。不过尿素的含氮量不是很高（46.6%），溶解在水中会发出刺鼻的氨味，容易被觉察，而且用一种简单的检测方法（格里斯试剂法）就可以查出牛奶中是否加了尿素。所以后来造假者就改用三聚氰胺了。三聚氰胺含氮量高达66.6%（含氮量越高意味着能冒充越多的蛋白质），白色无味，没有简单的检测方法（要采用“高效液相色谱”这种高科技去检测），是理想的蛋白质冒充物。三聚氰胺是一种重要的化工原料，广泛用于生产合成树脂、塑料、涂料等，目前的价格大约是1吨12000元。在生产三聚氰胺过程中，会出现废渣，废渣中还含有70%的三聚氰胺。造假者用来冒充蛋白质的就是三聚氰胺渣，国内有不少“生物技术公司”在网上推销“蛋白精”，其实就是三聚氰胺渣。在饲料、奶制品中添加“蛋白精”冒充蛋白质，已成了公开的秘密，它的流行让这种本来免费的化工废料的价格攀升到了1吨300～400元。 三聚氰胺是怎么加到牛奶中的呢？有两种可能途径。一种是奶站加到原奶中。这样做有一定的局限，因为三聚氰胺微溶于水，常温下溶解度为3.1克/升。也就是说，100毫升水可以溶解0.31克三聚氰胺，含氮0.2克，相当于1.27克蛋白质，由此可以算出，要达到100毫升≥2.95克蛋白质的要求，100毫升牛奶最多只能兑75毫升水（并加入0.54克三聚氰胺）。另一种途径是在奶粉制造过程中加入三聚氰胺，这就不受溶解度限制了，想加多少都可以。 三聚氰胺在国内之所以被当成了“蛋白精”来用，可能是因为觉得它毒性很低，吃不死人。大鼠口服三聚氰胺，半致死量（毒理学常用指标，指能导致一半的实验对象死亡）大约为每千克体重3克，和食盐相当。大剂量喂食大鼠、兔、狗也未观察到明显的中毒现象。三聚氰胺进入体内后似乎不能被代谢，而是从尿液中原样排出，但是，动物实验也表明，长期喂食三聚氰胺能出现以三聚氰胺为主要成分的肾结石、膀胱结石，并诱发膀胱癌。2007年，从中国出口到美国的宠物食品导致许多宠物肾衰竭死亡，调查表明可能是因为宠物食品中混入了三聚氰胺导致的。那么三聚氰胺是否也会对人有同样的毒性？我们无法拿人体做试验，而即使患肾结石的人曾经服用过偷加了三聚氰胺的食物，也很难确定三聚氰胺就是罪魁祸首，除非患者的食物来源很单一，例如只吃配方奶粉的婴儿——没想到还真有人敢拿婴儿来做试验证明了它能吃死人！ 有人认为既然蛋白质检测法的缺陷导致了致命的造假，还不如干脆取消蛋白质检测，默许牛奶兑水得了。其实凯氏定氮法的缺陷并不难弥补，只要多一道步骤即可：先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量。这是生物化学的常识，也早成为检测牛奶氮含量的国际标准（ISO 8968）。“蛋白精”骗局在国内出现已有一些年头，“三鹿奶粉”事件不过是把这一“行业秘密”摆在了公众面前。只有改进国家标准，堵住漏洞，才能挽回人们对国产乳业的信心。2008.9.14（《中国青年报》2008.9.17）转自方舟子博客

实验室准备转做蛋白质组学，哪种质谱仪最好？价格大概在100万左右的哪个公司的质谱仪最适合做蛋白质组学？有推荐的请联系我，QQ：332677682，注明质谱仪。

人类的营养物质有许多种类，最为重要的为蛋白质，碳水化合物和脂肪，其它则是微量营养物质，如维生素、电解质和微量元素等。虽然每一种营养物质对人体来说都是不可或缺的，但绝大多数的营养学家都会有充分的理由认为，真正最重要的营养物质是蛋白质。一、蛋白质是构成人体的基本物质。蛋白质是由氨基酸通过肽链相连而构成的，它是人体包括骨骼、肌肉、皮肤和脑的重要物质基础，同时氨基酸也是生成核酸的基本物质。我们知道，核酸既形成遗传密码，也是体内储存能量的基本物质。因而从根本上说，人体是由蛋白质组成的。构成人体蛋白质的生理功能概括有如下三个方面：1）人体组织的主要构成成份：如肌肉、骨骼、血液、皮肤、神经、肝、心等等。2）具有特殊生理功能：可以这样说，人类的一切生理活动都与蛋白质有关。如酶蛋白能催化机体的一切化学反应，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物的消化等；载脂蛋白运送脂肪；血红蛋白运送氧；激素蛋白调节代谢与生理活动包括情感；血浆白蛋白调节渗透压、运输金属离子、胆红素和抗生素等。3）供给机体能量：成年人每日约需要更新400g蛋白质，每克蛋白质彻底分解能释放出约4 Kcal的热量。4）为机体提供氮原料：人体内所必需的嘧啶、嘌呤、肌酸、胆碱、肾上腺素、肉碱、牛磺酸等，都是以多肽、氨基酸为原料的。表1. 世界粮食组织（FAD）和世界卫生组织（WHO）根据中国人的体质和膳食结构推荐的中国人蛋白质的摄入量（RNLs）。年 龄 蛋白质RNL（g/d）初生—6个月 1.5-31岁 353岁 455岁 557岁 609岁 6510-16岁 75-85成年女性 65成年男性 75妊娠 +15乳母 +20根据统计资料：由于贫困、工作紧张、精神压力、减肥节食、以及肠胃疾病、癌症、贫血、肾病、各种结核病、肝硬化、腹水、烧伤、失血等，以及老龄人均不同程度地存在着蛋白质的摄入不足。上世纪80年代以来，我国营养学家对7个省18个贫困地区，1万名学龄前儿童进行了为期4年的连续调查，发现营养不良现象非常严重，其中蛋白质的摄入量不足WHO规定的60%。近年社会医学工作调查，在发达地区由于生活节奏加快，精神压力异常增加，以及办公室白领阶层的减肥节食，也导致蛋白质摄入不足，代谢异常的人群增加。二、蛋白质缺乏的体征和临床症状单纯的蛋白质营养不良又叫加西长病，这或许是来源于非洲的单词，单纯的能量不足时叫消瘦；临床上通常把这两种现象叫单纯性蛋白质能量营养不良症或PEM。单纯的PEM症在临床上较少见到，但在慢性消耗性疾病患者中则常见，尤其是在癌症患者和艾滋病的患者中几乎占到90%以上。现代都市和贫困地区存在着相当数量的蛋白质营养不良族群，他们的临床表现主要是能量损失或不足，如体力不支、睡眠不安、怕冷、怕热、性冷淡、无法进行正常的体力劳动和运动，其次为肌肉组织萎缩、皮肤松驰；腿部、脸部易水肿、脂肪肝、无名皮疹、伤口愈合不良、记忆力下降、视力减弱等。再者免疫力低下易感冒、感染。在做血检时通常会发现这些族群的血浆蛋白处于正常值的下限，其中白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合前体蛋白和视轴蛋白（retinol-binding protein）均处于低水平时，患者易于感染各种疾病并且出现早衰症状，如果是儿童则感染后死亡率增加30%-40%，对于这类人群WHO的专家最好的建议就是迅速补充优质（或全价）的蛋白质。

工厂的秘密1999年，毛立军以自己的乳名“安营”成立徐州安营厂，主要生产动物饲料和相关产品。一位与毛同龄的同村人坚称，毛立军只读过小学四年级。在徐州安营的开业登记中，毛则自称初中毕业。徐州安营所在的沛县，以汉高祖刘邦的故乡和盛产美食沛县狗肉而闻名全国，但此县经济在江苏省排在倒数位置。与这个县城膨胀的经济发展欲望一样，毛的目标是努力致富。同村人证实，毛在成立安营生物前，有数年时间在其出生的村子后梁庄务农。在村人眼中，毛聪明活络，善于结交方方面面的关系。他被形容为不安分的人，做过很多小生意，卖过兽药和饲料，还曾在其大姐夫开的饲料工厂跑销售。毛的工厂最初开在后梁庄。2002年至2004年间，毛将工厂开到了王店村。工商资料显示，至迟在2004年，他开始涉足小麦蛋白粉生产和销售，生产地点就是本文开头联合调查组调查的地方。根据徐州安营厂2004年7月2日填写的《建设项目环境影响申报（登记）表》，新建项目的名称即为“E□□生物蛋白粉”，占地面积4000平方米，总投资120万元，预期投产日期2004年8月。记者实际看到的工厂面积不足1000平方米，但知情人称，毛曾租用别人的厂房。南京农业大学一位教授在1999年曾与毛的工厂有过合作。这位教授说，毛一直在寻找能赚更多钱的新项目，毛认为他的技术专利太陈旧而最终终止了合作。小麦蛋白粉显然成了毛立军“能赚更多钱”的项目。在村民眼中，毛的发迹正是从2004年搞小麦蛋白粉开始的。“约从2005年开始，毛的产品就开始卖到了外国。工厂经常出入大的集装箱，也有河北和山东一带的卡车来送原料。”村民说。尽管被村里人认为钱“来路不正”，毛还是很快拥有了一辆帕萨特轿车，毛曾对人自称一年能赚六七百万元。村民们对毛看不顺眼的主要原因是：从2004年起，毛的工厂里总是冒起能遮住半个村子的“浓雾”，厂里传出的味道十分刺鼻，常熏得人眼睛流泪。村民们并不知道工厂里的奥秘，他们能做的，就是一次次向县环保部门投诉。但这种投诉一直不见效果。一位不愿透露姓名的知情人告诉《财经》记者，毛致富的秘密就在于往小麦蛋白粉中添加三聚氰胺。他一般是用尿素加热来生产三聚氰胺。南京大学研究高分子化学的谌东中博士解释说，目前全球生产三聚氰胺主要采用尿素法，即加热尿素并与液氨发生化学反应，就可以得到三聚氰胺。村民闻到的刺鼻气味，应为同时释放出的氨气，氨气也会刺激人的眼睛。毛甚至还通过互联网公开求购三聚氰胺下脚料。致富“捷径”与制度“漏洞”种种迹象表明，在植物蛋白粉中加入三聚氰胺，并非毛立军的首创。一个例证是，互联网上公开求购三聚氰胺的饲料企业绝非徐州安营厂一家。三聚氰胺是否可以加入食物和饲料，在此次事件前，科学界对此没有过专门论证。在中国，三聚氰胺没有进入饲料添加剂名录，但也无法律法规明令禁止。即使在美国，FDA此前也未对此种化学物质有特别的规定。法律的漏洞为唯利是图的商人们留下了空间，毛立军们在利益的驱使下开始行动。一位熟悉饲料行业的知情人士告诉记者，中国饲料业近年已趋于饱和，也形成了一些知名品牌，刚起步的小型饲料厂家已难以与品牌厂家竞争。小饲料厂一般生产工艺原始且落后，其生产饲料的蛋白质含量一般要比品牌厂家低数个百分点。而每低一个百分点，意味着每吨产品少卖50元至60元，一些小厂基本无利可图。但是，添加三聚氰胺等化学原料可以在检测中提高饲料的蛋白质含量，这一方法很快在业内传开并被许多不良厂家大肆使用。业内人士称，目前国际上测量饲料蛋白质含量通行的办法叫“凯氏定氮法”，即以含氮的多少乘以一定系数得出蛋白质含量。这套检测办法的问题在于，只要在饲料中添加一些含氮量高的化学物质，就可在检测中造成蛋白质含量达标的假象。三聚氰胺成为不法厂商青睐的理想物质之一，分子式显示，其含氮量达66%左右。无棣县一位业内人士曾忠告扮成饲料购买者的记者：不要在本县买蛋白饲料，原因是里面“加了东西”。在追问下，他称除三聚氰胺，有的厂家还有其他提高蛋白质含量的添加物。“一些厂商添加三聚氰胺拉高饲料含氮量后，还可以在饲料中加入低价的淀粉等。这样，他们的饲料不仅蛋白质含量达标，相比品牌厂家反而具备了价格优势，可以低价占领市场。”一位品牌厂家的工程师说。据业内知情人士介绍，由于欧美和东南亚国家的宠物饲料市场比国内发达，且价格一般高于国内，因此这些劣质饲料多数销往国外。记者实地采访发现，徐州安营和滨州富田的生产销售方式雷同，均为在农村或集镇设生产厂房，再在县城内租下数间办公室作销售工作。其办公室内一般要雇佣多位懂外语、熟悉互联网络的大学生，从事“国际销售”。根据国家质监总局的调查，“产品以非法检商品名义报关出口，逃避了检验检疫机构的检验和监管”。美国媒体曾报道，美国政府一份报告说，在美国造成宠物死亡的受污染宠物食品原材料小麦蛋白粉，怀疑在出口商付运时，未宣称做“宠物饲料”，标签上标为“非食品产品”，以逃避中国出口机关检查。记者采访北京市进出口检疫局一位负责人得知，中国出口的产品分为法检产品与非法检产品。“那些关系到人的健康安全、卫生环保之类的产品被列入到强制检验范围，即法检范围。不涉及到这些方面的产品，就列入抽查范围。”照此解释，上述企业产品出口时，即使标明为宠物饲料，也为“非法检范围”，仅是抽查而已。山东滨州检疫部门持同样说法。上述北京市进出口检疫局负责人还认为，宠物饲料只有国家强制要求，或出口国家有相关规定的话，才需要检验。“从法律上讲，此事发生前，我们就是在宠物饲料里检到了三聚氰胺，也不会管。”令人惊讶的一个事实是：正是在这样的监管政策下，徐州安营厂和滨州富田厂开始了大幅度在大米和大麦蛋白中添加三聚氰胺，并依靠低廉的价格从互联网上获得大量订单，成功将产品顺利出口。

蛋白质纯化　蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。　　是当代生物产业当中的核心技术。该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。常用技术有：　　１、沉淀，　　２、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。　　３、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。　　４、层析：　　a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。　　　b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。　　５、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

蛋白分析系统在我们选择蛋白分析工具的时候，通常是根据不同的蛋白来选择不同的分析手段，如凝胶电泳、化学荧光染色、质谱等等。但是目前已经研制出的蛋白分析工具的种类繁多，从这一方面也在一定程度上反映了蛋白分析的复杂性。以下是一些近期推出的蛋白分析系统，希望能帮助您轻松完成研究工作。

质谱与蛋白质组学蛋白质组学对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析，而质谱是它的关键性分析工具。在过去的两年中，标准蛋白质组技术中的进展增进了更高水平自动化和敏感性的蛋白质识别技术。另外，新的技术促成了鉴定蛋白质功能相关特性的里程碑性的进展，包括它们的定量和在蛋白质复合物中复杂情况。缩写2DE two-dimensional gel electrophoresis双向凝胶电泳CID collision-induced dissociation碰撞诱导的解离ESI electrospray ionization电喷雾离子化FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里叶-变换离子回旋加速器共振ICAT isotope-coded affinity tagsIEF isoelectric focusing等电聚焦MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基质辅助的激光解析离子化Q-TOF quadrupole-TOFRP reversed phase反向TOF time-of-flight飞行时间简介蛋白质组学的核心组成是系统识别一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质，以及确定每个蛋白质的突出特征(比如，丰度、修饰状态以及在多蛋白质复合体中的复杂状态)。这些分析的技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的生物信息学。它的初步工具包括使用IEF(等电点聚焦)/SDS-PAGE凝胶的高分辨率的双向凝胶电泳(2DE)，结合质谱和数据库搜索来分离、识别和定量在一个复合样本中存在的个体蛋白质，最终识别被分离的蛋白质。一个常用的方法用在Fig1中用图解说明。此技术以及由此而来的变化(综述见[1])已经被用来识别和分类在复杂样本中存在的大量蛋白质，并在蛋白质组数据库中呈现它们，该过程我们这里称之为"描述蛋白质组学"比如，Shevchenko等[2]从2D凝胶上系统地鉴定了150个蛋白质。数目庞大的这样的数据库现在可以找到。同样的技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应而在蛋白质组中的改变。因为检测动态改变需要精确定量每个被检测成分，我们使用"定量蛋白质组学"来定义。在此报告中，我们总结了自1999年1月至2000年4月来报道的与蛋白质组学和质谱相关的最重要的进展。在核心质谱技术中的进展已经导致2DE为基础的蛋白质组学技术的进一步改进。它们同时又促进了传统凝胶为基础的方法的替代方法，诸如引入以同位素稀释理论为基础的精确蛋白质定量技术和蛋白质复合物的系统分析。蛋白质组分析的MS技术进展在此部分，我们总结了在MS设备、它们的控制和操作中的进展，以及比较质谱数据和序列数据库识别蛋白质所用的搜索工具的进展。随着新型质谱仪的引入，蛋白质组学研究现存类型的质谱仪性能已经显著改进了。在此综述期间最普遍使用的仪器是可以分为两类：单一阶段的质谱仪和串联质谱为基础的系统。单一阶段的质谱仪，最显著的是基质辅助的激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)仪器，被用于无数通过肽质谱图谱技术大规模蛋白质识别的项目中。此方法在鉴别表达自小一些的和完全测序的基因组的蛋白质特别成功[3,4]。串联质谱仪器诸如triple quadrpole、离子捕获(ion-trap)和近来引进的混合quadrupole飞行时间(Q-TOF)被常规应用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS或用电喷雾电离(ESI)来生成肽片段离子谱，以便通过搜寻序列数据库进行蛋白质鉴定。使用仪器控制程序来自动选择肽离子进行碰撞诱导的解离(CID)(数据依赖CID)的不断增多是这些MS/MS仪器的一个明显的趋势。一些新的构造的具有高潜能的质谱仪被引入到蛋白质组学研究中产生深刻影响。两个研究组近来一个MALDI离子源和一个混合Q-TOF耦联了起来[5,6]。Q-TOF提供的质量准确性和敏感性提升了数据库搜寻结果并同时使它成为MS/MS从头测序的当然仪器选择。MALDI Q-TOF构造提供了激动人心的机会进行自动化和高通量应用以及在一个样品盘上存档样品进行日后研究的可能。Medzihradszky等[7]描述了一个不同的混合仪器称之为MALDI TOF TOF。此设备享有许多MALDI Q-TOF的优点，另外能够进行高能量CID和非常快速的扫描速率。傅里叶-变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱对于蛋白质组学来说相对陌生。这些设备具有非常高的敏感性和分辨率，质量精确性可以达到1ppm。这些特征被用来在一次分析中测量和定量几百种蛋白质的完整的分子质量[8]。Goodlett等[9]表明FT-MS测量的一个肽的准确质量以及可以容易获得的限制因素能够通过序列数据库搜索被用来识别蛋白质。蛋白质组学如果没有软件工具来进行质谱数据和序列数据库的关联将变得几无可能。现存的数据库搜索程序已经变得越来越成熟和可以(从网络)可获得。另外，引入了新的算法。主要相关程序是Sequest[10]，MASCOT[11]，PeptedeSearch[12]，PROWL[13]和Protein Prospector[14]。在它们中间，Sequest使用CID谱设置了蛋白质识别的实验室标准(benchmark)，因为它与边界MS/MS数据工作得最好，并高度可信，可以从整个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS实验中自动分析数据，并不需要任何使用者的破译工作。在所提的程序中，然而，只有Sequest不能在网络上搜索。MASCOT是一个新的、快速、网络可进入和多功能的程序，具有进行肽指纹分析、用部分破译或未破译的CID谱进行数据库搜索的功能。

在发明蛋白质印迹法（Western Blot）出现了30多年之后，这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白质印迹法）”的命名者，他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年发明的一项技术，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列）、Northern Blotting（随后发明出的相似策略，用于鉴定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski实验室三者之意。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201309/22/095234xzm2pso06fsmtbof.jpgBurnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来，当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此，这个名称还是沿袭了下来，而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。工作原理蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳（Gelelectrophoresis）按照大小分离蛋白质，然后通过将膜置于胶上，将蛋白质转移到膜上（通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水纸，然后将这套堆层放在缓冲溶液中，这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。另外两项技术是干法和半干转印法，这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整，但是对于高分子量蛋白质而言，效率更低。对于半干转印方法来说，膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间，将这些都夹在阴极和阳极之间，电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中，干法转印最快，但转印效率也最低。转印结束后，膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱，再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。最后一步是检测，通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中，与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应，可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中，抗体探针被荧光集团所标记。荧光检测方法的主要优势在于，它可以同时检测多个蛋白质，并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比，也更有利于量化研究。不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化，期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点，让研究人员能够随时监测实验进展，甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化，从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。加速免疫检测过程转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间，EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程，使用真空装置通过膜推入试剂，而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟，Hatler表示。她解释说：“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走，只是加了一个真空装置。”Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶（8.5×13.5厘米）和迷你凝胶（7.5×8.4厘米），之前则只能用迷你凝胶。“这一设备很便宜，操作也很简便，但切实提高了实验效率，节省了实验时间。” Hatler说。伯乐公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器，能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方，特殊的过滤材料和增强的电流强度（由一个集成电源调节），这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印，并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间，而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。增加验证点以缓解忧虑蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧，尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术，”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说，“我们对用户调查时发现，一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”Short还说：“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶，利用其ChemiDoc MP胶成像系统，使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上，进而确证高质量的蛋白质转移，便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计，能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。这些验证点“真的很有用”，在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我们可以成像这些免染的凝胶，不用加入额外的染料，而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像，如果其中任何一个步骤出现问题，我们都可以在这一点上停止实验进程。”成像和软件提高定量性当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时，世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统，这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力，争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统，其大小可在实验台上操作。Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi，分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统，并配有GeneSys成像软件。2012年10月，赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像仪，使用紫外和可见光透射法，专业的滤镜和电荷耦合器件（CCD）摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。

蛋白质分离纯化鉴定包括蛋白质样品的基本处理注意事项，蛋白质分离纯化方法的基本原理和选择，纯化后蛋白质浓度及蛋白质基本性质的研究方法。 [URL=http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081009/1522386/]http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081009/1522386/[/URL]

来自清华大学生科院、医学院、普林斯顿大学Lewis Thomas实验室等单位的研究人员报道了一种重要的转运因子的蛋白结构，这一结构的6个跨膜区域以未报道过的新折叠形式出现，这一发现对于了解核黄素（维生素B2）的运输，以及进一步拓展其生物学结构具有重要意义。研究论文发表在最近一期《自然》（Nature）杂志上。 文章的通讯作者是清华大学生命科学院院长施一公教授，其研究组主要致力于运用结构生物学和生物化学的手段研究肿瘤发生和细胞调亡的分子机制：专注于肿瘤抑制因子和细胞凋亡调节蛋白的结构和功能研究、重大疾病相关膜蛋白的结构与功能研究、胞内生物大分子元件的结构与功能研究。另外两位作者分别是王佳伟（Jiawei Wang）和张鹏（Peng Zhang）。该研究组近期研究发现了一类重要的蛋白：能量耦合因子（energy-coupling factor，ECF）转运蛋白，这类蛋白是一些微量营养元素的运输因子，负责原核生物的维生素摄入。每个ECF转运因子都包含一种嵌入细胞膜的能结合底物的蛋白结构——S组件。这一结构是能量耦合的关键部件，由两个ATP结合蛋白和一个跨膜蛋白组成。然而目前这一结构的具体构架，以及运输机制并不清楚。

2013年04月23日 来源： 北京日报 由北京义翘神州生物技术有限公司研制的H7N9疫苗的关键蛋白——血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白已获得成功并规模化生产。记者昨日从北京经济技术开发区了解到，虽然并不意味着真正意义上的禽流感疫苗已经成形，但这些关键蛋白为科研人员进一步研制成功H7N9疫苗以及药物奠定了关键性的基础。目前，蛋白已经被送往国内外几十家科研院所和研究机构，为下一步研制疫苗做准备。 疫苗研制时间省下数月 在位于北京经济技术开发区的义翘神州实验室的一角，一股淡红色的液体缓缓流过白色的纯化柱，经过一系列纯化技术后，淡红色液体变成了无色透明的液体。这股无色液体，就是H7N9疫苗的关键蛋白。 “如果把H7N9比作一个骑车持刀抢劫的歹徒，那么H和N就分别是凶徒的两把利刃，H是指血凝素蛋白，N指的是神经氨酸酶蛋白，前者负责‘刺伤’细胞，后者负责‘开车’，让病毒感染伤害更多的细胞。”义翘神州技术人员张杰告诉记者，血凝素蛋白主要的功能是感染人体内的细胞，神经氨酸酶蛋白的作用则是使已感染的细胞进一步感染其他的细胞，扩散病毒的影响。 “知己知彼方能百战不殆。”要想研发出抑制这两种蛋白作用的抗体和疫苗，关键的一步，就是要根据流感病毒的基因序列研制出相应的重组蛋白。如果没有重组蛋白，科研机构需要利用技术手段研制假病毒，或者利用病毒毒株本身才能进行疫苗研究。 “毒株本身是有毒性的，出于安全考虑，除了疾控中心极少有机构能够获取毒株。而假病毒获取的技术手段有很高的挑战性。”张杰介绍，一个流感爆发后，缺乏蛋白研制经验的科研机构如果要想研制出流感病毒的这两种关键蛋白，快则数月，慢则需要半年甚至更长的时间。 “在安徽流感病人体内提取的毒株，和上海流感病人体内提取出的毒株，虽然基因序列相似，但仍有区别。成功的疫苗和治疗性药物必须对这些不同种类的毒株都有效才行。”张杰介绍，为了给疫苗、药物进一步研发提供更有针对性的蛋白，义翘神州研发的H7N9关键蛋白，已有“安徽株”和“上海株”两种。 关键蛋白研发12天搞定 3月底，全国首例人感染H7N9病例出现之后，中国疾病预防控制中心及时从病例样本中分离到H7N9禽流感病毒，并完成了鉴定和全基因序列分析。4月5日，义翘神州获得了公开的H7N9病毒的基因序列信息，包括公司总裁谢良志在内的30多位科研人员取消了周末，投入了一场与时间赛跑的研发战役。 要想快，不能乱。基因合成和目标载体构建、细胞培养、蛋白质纯化、质量控制和鉴定，这是研制蛋白过程中最关键的几个步骤。这些普通人在大学实验室里才能听到的专业术语和研发步骤，在义翘神州却变成了一场紧张有序的“流水线”式研发。 在分子生物学实验室里，技术人员在根据H7N9基因序列获取病毒基因、构建目标载体的同时，下一道工序的细胞培养实验室里，技术人员已经将细胞培养所需的培养液、器皿准备妥当。几天后细胞培养结束，提纯工序早已“整装待发”。30多位研发人员在上下游阶段有妥善的分工，在各个研发工序的衔接上不敢浪费一点时间。 “相比所有科研人员埋头苦干自己那份科研任务的单纯实验室式的科研，我们的科研流程已经进入了更为有条不紊的流水线式研发阶段，所以才有了12天研制出蛋白的速度。”张杰说，这成为了全球成功研发H7N9流感疫苗关键蛋白并具备量产能力的首个案例。 相关新闻 H7N9患者转诊可提高报销比例 本报讯(记者 袁京)针对我国部分地区出现人感染H7N9禽流感疫情，人力资源和社会保障部昨天发布通知，要求各地保证参保患者及时救治，减轻经济负担。对于因治疗需要转诊至高级别医院的患者，可适当提高报销比例。如果治疗期间使用了非医保药品或医疗项目，各地可根据需要适当放宽报销条件。 人保部提出，各地医保管理部门可根据实际情况和救治需要，在入院标准、定点医院选择等方面适当放宽条件，保证参保患者及时救治。对于因治疗需要，经基层医疗机构转诊至高级别医院的患者，可执行基层医疗机构支付比例或按地方规定适当提高支付比例。对参保患者治疗期间确需使用的不属于基本医保支付范围的药品和医疗服务项目，各地可参考国家卫生计生委制定的《人感染H7N9禽流感诊疗方案》，根据急救、抢救需要，予以放宽，以减轻参保患者治疗费用负担。各地临时放宽纳入基金支付范围的药品和诊疗项目要及时上报，由各省级人保部门汇总报送人保部医疗保险司。 对参保患者在参保地发生的符合规定的医疗费用，各级医保经办机构要实行即时结算；对于因转外就医等原因不能即时结算的，要简化结算手续、缩短结算周期，减轻参保人员垫支负担。对个人负担较重的参保患者，要做好医疗保险与医疗救助、大病医疗保险的衔接工作，具体办法由统筹地区制定。 人保部还提出，各省市要加强信息调度，随时了解掌握本地区人感染H7N9禽流感发病和医保基金支付情况，做好预案，并及时报送疫情及保障信息等。

1. 跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。2. 做WESTERNBLOT 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。3. 可将SDS－PAGE的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10％AP，TEMED不加，切记！！！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP，TEMED即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。

朊蛋白是所有哺乳动物的神经细胞里都有的一种蛋白质。每个神经细胞里都有无数的朊蛋白，但没有人确切知道朊蛋白的作用。如上所述，在染上疯牛病的牛和克雅氏病/新型克雅氏病患者的脑内都有许多变异朊蛋白。而朊蛋白假说是指： 口蹄疫除了疯牛病，您可能还听说过口蹄疫。 一个人从受污染的食品中吸收了变异朊蛋白。 变异朊蛋白被吸收到血流中并进入神经系统。 　　变异朊蛋白接触正常朊蛋白并改变其形状，使成为变异朊蛋白，从而破坏正常朊蛋白的原有功能。 　　然后，原有的和新形成的变异朊蛋白接触并改变神经细胞中其他正常朊蛋白的形状。

[size=3]选择材料及预处理 　　以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 　　微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 一，蛋白质（包括酶）的提取 　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。[/size]

磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展 摘要磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点,对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破,磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。关键词磷酸化蛋白磷酸化肽生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切 摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。 关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析

为何添加三聚氰胺　　三聚氰胺分子式为C3N3（NH2）3，又名氰尿酰胺，俗称蜜胺，是一种有机化工中间体，日常主要用途是与醛缩合，生成三聚氰胺-甲醛树脂，用于涂料、层压板、模塑料、粘合剂、纺织和造纸等，此外还可用于皮革鞣制、阻燃化学品以及脱漆剂等。不法厂商在植物蛋白粉中添加三聚氰胺的前提之一是，三聚氰胺物理性状为“白色单斜晶体、无味”，这与蛋白粉相仿。前提之二，此物质易于购买，也易于生产，成本很低。符合这两个前提的化学物质较多，而三聚氰胺含氮量高才是最根本原因。据业内专业人员介绍，目前，国际上使用最多的饲料蛋白质含量检测办法为“凯氏定氮法”，即测定受检饲料中氮所占的比例，再乘以一定系数得到蛋白质含量。南京大学高分子化学教授谌东中解释说，蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%,而三聚氰胺的分子式显示，其含氮量为66%左右。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量，并不能区别饲料中有无合规添加剂或违规化学物质，所以，加了三聚氰胺的饲料理论上可以测出较高的“蛋白质含量”。但是，三聚氢胺本身无法替代蛋白质，几乎没有任何营养价值。加了这种物质，造成的只是蛋白质含量提高的假象。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，很多厂商用三聚氢胺拉高饲料蛋白质含量后，再加入低价的淀粉等，作低蛋白质含量。以上两种操作，从经济上讲都有较大套利空间。出于相同的原理，只要含氮量大于普通植物蛋白质的化学物质，且性状和价格具备条件，在理论上都存在被不法厂商利用的可能性。《精细有机化工原料及中间体手册》显示，三聚氰胺“本品低毒，无刺激性……高温下可能分解产生氰化物（有较大毒性），故应避免高温”。由国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》（第三卷），对三聚氰胺则有如下描述：“长期或反复接触作用：该物质可能对肾发生作用”。三聚氰胺分子式为C3N3（NH2）3，又名氰尿酰胺，俗称蜜胺，是一种有机化工中间体，日常主要用途是与醛缩合，生成三聚氰胺-甲醛树脂，用于涂料、层压板、模塑料、粘合剂、纺织和造纸等，此外还可用于皮革鞣制、阻燃化学品以及脱漆剂等。不法厂商在植物蛋白粉中添加三聚氰胺的前提之一是，三聚氰胺物理性状为“白色单斜晶体、无味”，这与蛋白粉相仿。前提之二，此物质易于购买，也易于生产，成本很低。符合这两个前提的化学物质较多，而三聚氰胺含氮量高才是最根本原因。据业内专业人员介绍，目前，国际上使用最多的饲料蛋白质含量检测办法为“凯氏定氮法”，即测定受检饲料中氮所占的比例，再乘以一定系数得到蛋白质含量。南京大学高分子化学教授谌东中解释说，蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%,而三聚氰胺的分子式显示，其含氮量为66%左右。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量，并不能区别饲料中有无合规添加剂或违规化学物质，所以，加了三聚氰胺的饲料理论上可以测出较高的“蛋白质含量”。但是，三聚氢胺本身无法替代蛋白质，几乎没有任何营养价值。加了这种物质，造成的只是蛋白质含量提高的假象。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，很多厂商用三聚氢胺拉高饲料蛋白质含量后，再加入低价的淀粉等，作低蛋白质含量。以上两种操作，从经济上讲都有较大套利空间。出于相同的原理，只要含氮量大于普通植物蛋白质的化学物质，且性状和价格具备条件，在理论上都存在被不法厂商利用的可能性。《精细有机化工原料及中间体手册》显示，三聚氰胺“本品低毒，无刺激性……高温下可能分解产生氰化物（有较大毒性），故应避免高温”。由国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》（第三卷），对三聚氰胺则有如下描述：“长期或反复接触作用：该物质可能对肾发生作用”。（来源：《财经》）以上文章来源联众论坛：http://bbs.ourgame.com/bbs_look.asp?Subject_ID=34&BBS_ID=20080912619011&bPage=1 相关联接： 蛋白精(粗蛋白200%)本产品是全国著名生物技术专家王厚德教授的发明专利产品。专利号：cn1119071a。可等蛋白替代鱼粉、豆粕等高蛋白原料，也可以单独添加，使每吨全价饲料降低成本15~80元，且安全无毒，经济效益显著。 沧州市厚德生物新技术研究所 王厚德：全国著名微生物学专家、中国农业大学客座教授、华中师范大学兼职教授、武警医学院高级顾问、天津医科大学教授、中国保健科技学会微生态学会理事长。近20年来在微生物发酵领域获得国家星火二等奖1项，省级科技进步奖8项，并获数枚国际国内金奖，主持过省和国家级科研计划项目26项，并通过了相关级别技术鉴定，拥有32项发明专利

胶原蛋白在被大众知晓的短短几年间，就以其与美丽、健康的密切关系，迅速蹿红起来，成为尽人皆知的美容圣品。但是，胶原蛋白到底应该怎么补，你又知道吗? 　　20岁开始补充胶原蛋白 胶原蛋白(collagen)是人体内含量最多的一种蛋白质，约占人体蛋白质总量的25%~33%，它遍及全身的各个组织器官，如：肌肤、骨骼、软骨、韧带、角膜、各种内膜、筋膜等，是维持肌肤与组织器官形态、结构的主要成分。因此，胶原蛋白对人体的健康和美丽扮演着举足轻重的角色，有紧肤平皱、保湿滋润、恢复弹性、乳房挺拔、关节灵活、防止妊娠纹等作用。 女性在20岁时胶原蛋白已经开始流失，含量逐年下降，25岁后进入流失的高峰期，40岁时含量不到18岁时的一半。在肌肤当中，胶原蛋白负责为肌肤提供弹性和紧致度，并扮演着“深层水库”的角色为表皮提供水分。胶原蛋白的流失，导致肌肤出现干燥、粗糙、松弛、皱纹、毛孔粗大、暗淡、色斑等衰老现象。可以说肌肤衰老的过程，就是胶原蛋白流失的过程。因此，女性20岁以后就要注意胶原蛋白的补充了。 补充胶原蛋白，你选哪样？ 目前，补充胶原蛋白的方式主要有3种：1.添加在护肤品中：含胶原蛋白的化妆品有一定保湿、抗皱效果，但仅作用于表皮，很难进入真皮层。2.外部注射：直接皮下注射胶原蛋白，有立竿见影的效果，但存在肌肤排斥、过敏的风险，并且价格昂贵，维持的时间也较短暂。3.口服食用：口服胶原蛋白是最直接有效的补充方式，但要坚持2个月的周期，因为长时间流失掉的胶原蛋白，没有一定时间是难以补回来的。 从饮食上摄取胶原蛋白，如猪蹄、肉皮、牛蹄筋、鱼皮、软骨等可以在一定程度上补充胶原蛋白。但是，这些食物中的胶原蛋白由于是大分子蛋白质，很难被人体直接消化吸收，并且这类食物大多脂肪含量较高，不适合爱苗条的女性经常食用。因此，选择服用提炼加工后的胶原蛋白饮料是补充胶原蛋白最好的方式。刘纳老师还提醒，晚上睡前是服用胶原蛋白饮料的最佳时间，因为夜间10点到凌晨2点是肌肤修复和更新的最佳时段。 选择胶原蛋白的三个重要标准 标准一 胶原蛋白的分子量越小越好 人体在吸收胶原蛋白时，分子量是非常关键的因素，分子量越小越易被人体吸收。刘纳老师指出，胶原蛋白的分子量要在3000道尔顿以下，才适宜被人体吸收。 标准二 胶原蛋白的数量越多越好 人体在每天的自我更新中会不断流失胶原蛋白，女性从20岁开始每天要流失5000mg的胶原蛋白，随着年龄的增长，这一数值还在不断增加。因此，刘纳老师提醒，每天服用的胶原蛋白饮料中胶原蛋白的含量不应少于5000mg。 标准三 胶原蛋白不可缺少的搭档 刘纳老师告诉记者，胶原蛋白饮料中只含有胶原蛋白其效果不会长久，只有在胶原蛋白饮料中同时添加了透明质酸和弹性蛋白这两种物质，才能保证胶原蛋白的效果被完全发挥出来。 　　胶原蛋白产品推荐 1、FANCL胶原蛋白果味饮料?? 容量：50ml×10瓶/盒 价格：298元 自我介绍：特有的HTC胶原蛋白含大量三肽氨基蛋白，无需消化肌肤能直接吸收，有效促进皮肤胶原蛋白的新生。 2、Fine胶原蛋白饮料?? 容量：500ml/瓶 价格：1680元 自我介绍：以日本本地猪胎盘和鱼的胶原蛋白为主要原料，再加以DNA、弹性蛋白、透明质酸、维生素等成分制成。 3、Lumi(康魄)胶原蛋白液态饮料? 容量：50ml×8瓶/盒 价格：216元 自我介绍：胶原蛋白源自日本深海无污染鱼类的鱼皮，并且提取的是分子量为1000道尔顿以下的超细肽分子。 4、海姿丽海洋胶原蛋白果汁饮料? 容量：50ml×10瓶/盒 价格： 258元（基础型） 498元（加强型） 自我介绍：胶原蛋白源自无污染的深海三文鱼鱼皮，有基础型和加强型两种规格可以选择

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq][b][font=Calibri]WB([/font][font=宋体]蛋白质印迹[/font][font=Calibri])[/font][/b][/url][font=宋体]是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面针对[/font][b][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]在实验过程中遇到的问题进行罗列及解答：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]请您检查所使用的封闭液并注意封闭以及洗膜的时间。有两种常用的封闭液：脱脂奶粉或[/font][font=Calibri]BSA[/font][font=宋体]。脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白的封闭，因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合在膜上并与磷酸化特异性抗体结合导致高背景。并且稀释抗磷酸化酪氨酸抗体与脱脂奶粉中的酪蛋白结合后，用于检测的抗体较少导致信号减弱。此外，避免封闭时间过长，否则会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致高背景。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用含[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]，含吐温[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]作为封闭液，请勿使用脱脂奶粉。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？[/font][/font][font=宋体]如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，可能的原因及解决方案如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①可能的原因一：使用了不同的样本。[/font][font=宋体]解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。[/font][font=宋体]②可能的原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。[/font][font=宋体]解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。[/font][font=宋体]③可能的原因三：抗体被污染。解决方案： 旋转小瓶，检查是否有沉淀。[/font][font=宋体]④可能的原因四：二抗失效。解决方案：更换新的二抗。[/font][font=宋体]⑤可能的原因五：蛋白质转膜效率低。解决方案：配置新的转膜液；根据蛋白分子量大小调整转膜时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、如何避免转膜不充分或结果不理想的问题？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于[/font][font=Calibri]180 kDa[/font][font=宋体]，则需要通过以下方式优化转膜条件：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 使用[/font][font=Calibri]20% MeOH[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 加入[/font][font=Calibri]0.05% SDS[/font][font=宋体]转膜缓冲液。[/font][/font][font=宋体]? 增加裂解物的上样量。[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]110 V[/font][font=宋体]恒压转[/font][font=Calibri]150 min[/font][font=宋体]，湿法转膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免进行蛋白免疫印迹法时出现[/font][font=宋体]“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法[/font][font=Calibri]: [/font][/font][font=宋体]? 延长封闭时间，以优化封闭效果。[/font][font=宋体]? 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。[/font][font=宋体]? 在配置封闭液时，确保奶粉完全溶于溶液。[/font][font=宋体]? 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、如何避免印迹上出现“点状”、不均匀的斑点？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免印迹上出现[/font][font=宋体]“点状”或不均匀斑点，请尝试以下几种方法：[/font][/font][font=宋体]? 检查所有缓冲液是否被细菌污染。[/font][font=宋体]? 确保在抗体和清洗孵育过程中膜完全浸入。[/font][font=宋体]? 在转膜时，排除薄膜和凝胶之间的所有气泡。[/font][font=宋体]? 将膜放在摇床上，确保均匀地接触。[/font][font=宋体]? 清洗蛋白免疫印迹所需的设备。[/font][font=宋体][font=宋体]? 过滤[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]结合物，除去任何可能的聚集物。[/font][/font][font=宋体]?减少底物暴露时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、选择什么作为[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]抗体的阳性对照？[/font][/font][font=宋体]为了使您的蛋白免疫印迹抗体中获得最佳性能，请使用技术数据表中推荐的阳性对照。阳性对照将帮助您按照制定的方案，在实验中获得准确的结果。[/font][font=宋体][font=宋体]我们建议将这些裂解物放置在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下长期储存。裂解物非常稳定，它们是细胞制剂，所有酶均变性和灭活。我们做了大量的研究，证实了不同条件下的稳定性。例如，大多数裂解物的完整性和质量不受反复冻融的影响，可在[/font][font=Calibri]25[/font][font=宋体]℃下储存长达[/font][font=Calibri]12[/font][font=宋体]周。但裂解物在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]下[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]周时开始降解。然而，根据裂解物的来源，稳定性可能存在一些轻微差异，因此我们建议将其储存在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、应该分析多少蛋白质？[/font][/font][font=宋体]我们建议：[/font][font=宋体]样本类型[/font][font=宋体]每条泳道[/font][font=宋体]全细胞裂解液[/font][font=宋体][font=Calibri]50 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体]细胞核提取物[/font][font=宋体][font=Calibri]25 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、应该使用多少浓度的丙烯酰胺凝胶来分离蛋白？[/font][/font][font=宋体]为了更好地分离感兴趣蛋白，丙烯酰胺凝胶的百分比应基于蛋白分子量。我们建议：[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白大小（[/font][font=Calibri]kDa[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]丙烯酰胺凝胶百分比（[/font][font=Calibri]%[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri] 80[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7.5[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用硝酸纤维素（[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]）膜。虽然聚偏二氟乙烯（[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]）膜、尼龙膜和[/font][font=Calibri]DEAE[/font][font=宋体]纤维素膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是实验过程中使用山羊多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]10[/font][font=宋体]、应该使用什么封闭缓冲液？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]封闭液的选择与目标蛋白有关，我们建议一般使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]5%[/font][font=宋体]脱脂奶粉、[/font][font=Calibri]0.05%[/font][font=宋体]吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]作为封闭液，在室温下封闭[/font][font=Calibri]30-60[/font][font=宋体]分钟或在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃下封闭过夜。请注意，如果封闭过夜，缓冲液中应不加吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]。如果目标蛋白较特殊（如磷酸化），建议使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]并含有吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]的封闭液，可得到较清晰条带。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]11[/font][font=宋体]、一抗的稀释倍数一般是多少？[/font][/font][font=宋体]请查看各个抗体的数据表，因为这通常记录起始稀释度。如果数据表上没有具体稀释信息，我们建议您对相关的阳性和阴性对照进行连续滴定。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]12[/font][font=宋体]、为什么实际的蛋白免疫印迹条带大小与预期的不同？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白免疫印迹法是根据蛋白质大小分离蛋白的技术。一般来说，蛋白越小，其在[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]凝胶中移动的速度就越快。然而，移动速率也受到其他因素的影响，因此实际条带大小可能与预测不一致。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①翻译后修饰[/font][font=宋体]例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质的大小。[/font][font=宋体]②翻译后切割[/font][font=宋体]大多数蛋白质首先合成为前体蛋白形式，再经切割产生活性形式，例如前体半胱天冬酶。[/font][font=宋体]③剪接变体[/font][font=宋体][font=宋体]可变剪切会产生从同一基因产生不同大小的蛋白质。剪接变体的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件[/font] [font=宋体]。[/font][/font][font=宋体]④亚型[/font][font=宋体]许多蛋白质表达多种不同大小的亚型。相同靶蛋白不同亚型的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件。参照不同的网站，确定特定靶标的亚型。[/font][font=宋体]⑤相对电荷[/font][font=宋体][font=宋体]氨基酸组成（带电[/font][font=Calibri]vs.[/font][font=宋体]不带电）。[/font][/font][font=宋体]⑥多聚体[/font][font=宋体]例如蛋白质二聚化。尽管相互作用可能导致出现较高条带，但在还原条件下需防止该情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]13[/font][font=宋体]、为什么蛋白免疫印迹结果信号微弱或完全没有信号？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①抗体滴定 [/font][font=宋体][font=宋体]应使用多种抗体浓度进行抗体滴定实验，以确定最佳信噪比的合适抗体浓度。一般而言，滴定浓度应在[/font][font=Calibri]0.2-5.0 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/mL[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②组织[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]细胞特异性 [/font][/font][font=宋体]靶蛋白表达取决于待测的细胞或组织。应进行文献检索，确保您正在使用的细胞等条件适用于检测靶蛋白。[/font][font=宋体]③复溶 [/font][font=宋体]在重新溶解冻干抗体时应注意，确保抗体全部溶解。尽管冻干抗体沉淀通常位于试管底部，但有时粉末可能位于管壁上。因此，溶解时应覆盖试管的整个表面，以确保抗体完全溶解。然后进行短暂离心，确保将所有粉末收集在试管底部。[/font][font=宋体]④阳性对照 [/font][font=宋体]在您的蛋白免疫印迹中添加阳性对照泳道是评价抗体是否正常工作和实验条件是否适当的最佳方法。另外，基于文献或实验结果的阳性对照也可以用来评估抗体是否正常发挥作用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]蛋白免疫印迹法常见问题详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服[/b][/url]务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font]

条条大路通罗马，纯化之路千万条。本篇是写给蛋白质纯化新手的，就一些最常用的纯化工艺、概念方法作一些列举。以起始原料的不同来进行分类，分为：大肠杆菌、酵母、细胞培养、腹水、血清、生物组织六个板块。板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。四、菌体破碎（1）破菌前处理诱导表达的菌体在发酵离心后，最好先用PBS缓冲液或其它缓冲液立即洗涤一次。菌体洗涤可以去除一些培养基中的杂质，及代谢产物，减少对后续纯化的影响。如果菌体已经冻存过，冻融的菌体可能有部分破碎，就不要洗涤菌体了。小量菌体的悬浮可以用5ml的枪头吹打，再磁力搅拌。大量菌体的悬浮可以用分散乳化机。破菌缓冲液的用量一般为1∶10—1∶20，即1g湿菌体用10—20ml的破菌缓冲液。（2）破菌缓冲液的选择选择何种破菌缓冲液，应该与后续的纯化方法密切相关，不能一刀切。而且，破菌缓冲液还与是否可溶表达相关。对于可溶表达的重组蛋白，一般就选用第一步层析纯化的平衡缓冲液为破菌缓冲液。对于不可溶表达的重组蛋白，最简单的就是选用PBS为破菌缓冲液。在选用破菌缓冲液时，有个小小的trick，加EDTA。有个别重组蛋白很脆弱，在超声破菌时就有大量的降解。注意，不是表达降解，而是超声过程中降解。特别是用pET32表达的his-tag融合蛋白容易降解，我运气好，遇到过2次这种超声降解。第一次碰到时，害得我好苦。反复找原因，是诱导表达温度？是超声温度过高？超声功率？外源蛋白酶污染？……最后用EDTA解决了。在破菌缓冲液中加0.5mM的EDTA就不会降解了。推测原因，可能是大肠杆菌自身有那么一种蛋白酶，破菌释放后就正好会攻击我的宝贝蛋白。而这种蛋白酶是金属蛋白酶，加EDTA后把它的枪栓（金属离子）给卸了，我的蛋白小命也就保全了，哈哈。第二次在SDS-PAGE上看到降解时，心里就不慌了。可能有战友会问，his-tag的蛋白加了EDTA后还怎么过Ni柱啊，恭喜你，问对了。我的解决方案是先过离子交换柱。EDTA带负电荷，用Q/DEAE吸附EDTA，或用SP柱吸附目标蛋白后，再透析一下，过Ni柱纯化。爱探险的dora跳着舞，成功啦，you did it！。（3）破菌方法大肠杆菌的破碎方法常用的大概有：反复冻融加溶菌酶法、超声法和压力匀浆法。一般来说处理菌体的量也是这个顺序。冻融方法我不喜欢，处理量太少且费时，要买溶菌酶，还是个外源蛋白。我喜欢强力型的超声和压力匀浆。超声法是小规模和中等规模破碎菌体的首选，选择好相应的超声探头，一次处理菌体量为0.1g-100g。压力匀浆为中到大规模破菌的首选，处理量大、快，破菌效果好，但发热量大，对温度非常敏感的蛋白慎用。超声破菌：以10g湿菌体为例，加入破菌缓冲液100ml，玻璃烧杯中磁力搅拌悬浮充分。冰水浴超声。设置超声时间4s，间隙时间4s，超声功率400-600W，超声次数100-200次。压力匀浆：以200g湿菌体为例，加入4℃预冷的破菌缓冲液3000ml，用分散乳化机充分混匀。匀浆压力800bar左右，压力匀浆发热非常大，流出液要冰水浴加磁力搅拌。一次匀浆完毕后，让菌液充分冷却后再进行二次匀浆。匀浆完毕的菌液如果粘度比较大，可用超声破碎仪超声40次，打碎核酸减小粘度，以方便离心和纯化。（4）破菌后离心高速冷冻离心机离心，50ml的小管18000rpm，20min，4℃；500ml的瓶用10000rpm，30min，4℃。50ml小管的离心效果比500ml的瓶好，如果你的溶液量在300ml以下，还是勤快点，多装几根50ml的小管吧。（5）过滤对上清可溶表达的蛋白在收集破菌离心上清后，必须过滤后才能上柱纯化。在园子里常看到有战友说我的柱流速很慢，层析柱压缩等很厉害，柱头有杂质堵了等等，这多数是因为没有进行过滤操作。过滤一般采用真空负压抽滤，可以选择0.8um的膜或双层滤纸过滤。多数层析的要求都是过柱溶液需经过0.45um的膜过滤，但实际上对破菌后的上清液或包涵体的溶解上清样，0.45um膜太难过滤了，mission impossible，无法完成操作。所以在实际工作中，我们都是采用双层滤纸或0.8um的膜过滤。在此推荐我用的一套设备组合：millipore wp6122050型台式真空压力两用泵和Sartorius 16201不锈钢过滤器，非广告，好用哦。五、包涵体处理前面说过对纯化来说，我不赞成包涵体的提法，但为了表述方便还是不妨借用一下，谁…谁在拍砖头啊。（1）包涵体洗涤我的蛋白是包涵体表达，用什么来洗涤啊？此类问题战友常问。其实还真不好回答。用什么溶液来洗涤包涵体也是与后续纯化方法相关的。例如，后面接离子交换层析，洗涤液不能加盐；后面接Ni柱，洗涤液不能加EDTA等等。罗列了一些可用的洗涤液成分如下，根据自己的需求来增减。pH6.0-pH9.0：高pH使得包涵体倾向于溶解，杂蛋白也去除的好些，但高pH有可能使目的蛋白降解。10-50mM PB，10-50mM Tris：维持缓冲环境，后接离子交换时选低一点的浓度。0-0.5N NaCl：盐洗涤有助于核酸的去除，多年前有位做干扰素的可爱老太太教我，盐洗涤后包涵体的OD280/260的比值（溶解后）会升高很多，也就是核酸去除很多，有利于后续纯化。0.5-5mM DTT：提供还原环境，打开蛋白中的二硫键，使得包涵体倾向于溶解，有利于杂蛋白的去除。但浓度太高了使得包涵体真的溶解就不是洗涤了。后续用Ni-IDA柱不可以加，用Ni-NTA柱少加。0-1%beta-ME：同DTT，还原能力稍弱。气味那个香啊……0-2N Urea：变性剂，有利于包涵体中氢键、疏水键、范德华力……的打开，有利于洗涤去除杂蛋白。同样高浓度会使包涵体溶解。类似的是盐酸胍，更强的变性剂，更高的价格，我等不穷的人也消费不起。当然，你很富就用吧，有时候更有利于包涵体蛋白的线性化。0.05-1%Triton X100：非离子型表面活性剂，像洗衣粉一样用了。同样的还有zwittergent，一种我一直想找机会试试的东东，当年为了溶解beta干扰素包涵体搞得我好苦。0-2mM EDTA：螯合剂，去除金属离子，有利于蛋白的稳定和溶解。Ni柱禁用。其它：期待各路英豪奉献。（2）包涵体溶解看了包涵体洗涤部分，怎么溶解包涵体应该心中有数了。无非就是pH，变性剂，还原剂，表面活性剂等等的组合。经典的包涵体溶解液的配方为：pH8.0，20mM Tris，8M Urea。说它经典，是因为我用的最多，嘻嘻。再根据个性蛋白纯化的需要往这个配方里面加调料，如Ni柱纯化的咪唑、氯化钠；溶解或吸附不好时再加点DTT、Triton。包涵体的溶解也有两个小Trick，独门秘籍哦。第一，包涵体沉淀在溶解时往往会有一些像硬胶状的块块，有弹

perforin免疫蛋白的功能及微孔的形成 能够形成微孔的免疫蛋白“perforin”是消除被病毒感染的细胞及癌变细胞所必需的，由自然杀手及细胞毒性T-细胞释放。现在，一种“perforin”单聚物（小鼠perforin R213E）的结构已被确定。对该结构所做分析同时结合对低聚孔的一个冷电子显微镜重建结果表明，这个孔内的“perforin”单聚物与依赖于胆固醇的溶细胞素在结构上同源的单聚物相比采用一种“内面向外”的取向。这种新颖的适应性也许可解释“perforin”是怎样将支持细胞凋亡的蛋白酶(granzymes)送入目标细胞中的以及相关的互补免疫蛋白是怎样组装成微孔的。

北京易斯威特生物医学科技有限公司产品介绍 铁蛋白（FER）检测试剂盒 （胶体金法）1.国内第一家免疫层析法检测FER的产品。2.本产品应用世界上最先进的单克隆抗体技术结合胶体金（纳米金）免疫层析技术，以双抗体夹心法快速定性检测人血清，血浆中的铁蛋白，适用于急性贫血，肝脏损伤等相关疾病的辅助诊断3.最快速准确的辅助诊断方法。4.血清铁蛋白是血液去铁蛋白和铁核心Fe3+形成的复合物。是检查体内铁缺乏的最灵敏的指标。血清铁蛋白测定在临床上常用于缺铁性贫血的诊断。简单 便捷 快速 灵敏 环保 肌红蛋白/肌酸激酶/心肌肌钙蛋白I，心梗三项检测试剂盒（胶体金法）1.本产品应用世界上最先进的单克隆抗体技术结合胶体金（纳米金）免疫层析技术，以双抗体夹心法快速定性检测人血清，血浆中的肌红蛋白，肌酸激酶，心肌肌钙蛋白I检测，用于临床快速诊断急性心肌梗塞（AMI）.2.最快速准确的辅助诊断方法。3.肌红蛋白：是心肌梗死的标志物，增高表示冠状动脉堵塞引起心肌严重缺血造成心肌梗死；4.肌钙蛋白：是一种心肌蛋白，升高见于心肌损伤，多见于心肌梗死，也见于心肌炎和心肺复苏后患者，特异性较高，阳性的话一般可确诊心肌损伤，阴性的话不能排除，因为肌钙蛋白的升高出现在心肌梗塞3-6小时之后，之前可能出现阴性。肌酸激酶敏感性较高，特异性较低，升高也出现在心梗3-8小时之后。5.肌酸激酶：主要存在于骨骼肌和心肌，在脑组织中也存在，是参与体内的能量代谢的一种酶。在临床上主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2－4小时，血液中此酶活动即开始升高。比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早。 简单 便捷 快速 灵敏 环保 C反应蛋白（CRP）检测试剂盒（胶体金法）1.国内第一家免疫层析法检测CRP的产品。2.本产品应用世界上最先进的单克隆抗体技术结合胶体金（纳米金）免疫层析技术，以双抗体夹心法快速定性检测人血清，血浆中的C反应蛋白，适用于感染，炎性疾病，组织损伤，手术创伤及组织坏死等病变情况的辅助诊断3.最快速准确的辅助诊断方法。4.是一种能与肺炎球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白。可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断简单 便捷 快速 灵敏 环保

蛋白质分子量肌球蛋白甲状腺球蛋白β-半乳糖苷酶副肌球蛋白磷酸化酶a血清白蛋白L-氨基酸氧化酶地氧化氢酶丙酮酸激活酶谷氨酸脱氢酶亮氨酸氨肽酶γ-球蛋白，H链延胡索酸酶（反丁烯二酸酶）卵白蛋白醇脱氢酶（肝）烯醇酶醛缩酶肌酸激酶胃蛋白酶原D-氨基酸氧化酶醇脱氢酶（酵母）甘油醛磷酸脱氢酶原肌球蛋白乳酸脱氢酶胃蛋白酶转磷酸核糖基酶天冬氨酸氨甲酰转移酶，C链羧肽酶 A碳酸酐酶枯草杆菌蛋白酶γ-球蛋白，L链γ-blobulin,L chain糜蛋白酶原（胰凝乳蛋白酶原）木瓜蛋白酶（羧甲基）β-乳球蛋白[font=Tim

蛋白质数据库 1. PIR和PSDPIR国际蛋白质序列数据库(PSD)是由蛋白质信息资源(PIR)、慕尼黑蛋白质序列信息中心(MIPS)和日本国际蛋白质序列数据库(JIPID)共同维护的国际上最大的公共蛋白质序列数据库。这是一个全面的、经过注释的、非冗余的蛋白质序列数据库，包含超过142,000条蛋白质序列(至99年9月)，其中包括来自几十个完整基因组的蛋白质序列。所有序列数据都经过整理，超过99%的序列已按蛋白质家族分类，一半以上还按蛋白质超家族进行了分类。PSD的注释中还包括对许多序列、结构、基因组和文献数据库的交叉索引，以及数据库内部条目之间的索引，这些内部索引帮助用户在包括复合物、酶－底物相互作用、活化和调控级联和具有共同特征的条目之间方便的检索。每季度都发行一次完整的数据库，每周可以得到更新部分。PSD数据库有几个辅助数据库，如基于超家族的非冗余库等。PIR提供三类序列搜索服务：基于文本的交互式检索；标准的序列相似性搜索，包括BLAST、FASTA等；结合序列相似性、注释信息和蛋白质家族信息的高级搜索，包括按注释分类的相似性搜索、结构域搜索GeneFIND等。 PIR和PSD的网址是：http://pir.georgetown.edu/。 数据库下载地址是：ftp://nbrfa.georgetown.edu/pir/。 2. SWISS-PROT SWISS-PROT是经过注释的蛋白质序列数据库，由欧洲生物信息学研究所(EBI)维护。数据库由蛋白质序列条目构成，每个条目包含蛋白质序列、引用文献信息、分类学信息、注释等，注释中包括蛋白质的功能、转录后修饰、特殊位点和区域、二级结构、四级结构、与其它序列的相似性、序列残缺与疾病的关系、序列变异体和冲突等信息。SWISS-PROT中尽可能减少了冗余序列，并与其它30多个数据建立了交叉引用，其中包括核酸序列库、蛋白质序列库和蛋白质结构库等。利用序列提取系统(SRS)可以方便地检索SWISS-PROT和其它EBI的数据库。 SWISS-PROT只接受直接测序获得的蛋白质序列，序列提交可以在其Web页面上完成。 SWISS-PROT的网址是：http://www.ebi.ac.uk/swissprot/。 3. PROSITE PROSITE数据库收集了生物学有显著意义的蛋白质位点和序列模式，并能根据这些位点和模式快速和可靠地鉴别一个未知功能的蛋白质序列应该属于哪一个蛋白质家族。有的情况下，某个蛋白质与已知功能蛋白质的整体序列相似性很低，但由于功能的需要保留了与功能密切相关的序列模式，这样就可能通过PROSITE的搜索找到隐含的功能motif，因此是序列分析的有效工具。PROSITE中涉及的序列模式包括酶的催化位点、配体结合位点、与金属离子结合的残基、二硫键的半胱氨酸、与小分子或其它蛋白质结合的区域等；除了序列模式之外，PROSITE还包括由多序列比对构建的profile，能更敏感地发现序列与profile的相似性。PROSITE的主页上提供各种相关检索服务。PROSITE的网址是：http://www.expasy.ch/prosite/。 4. PDB蛋白质数据仓库(PDB)是国际上唯一的生物大分子结构数据档案库，由美国Brookhaven国家实验室建立。PDB收集的数据来源于X光晶体衍射和核磁共振(NMR)的数据，经过整理和确认后存档而成。目前PDB数据库的维护由结构生物信息学研究合作组织(RCSB)负责。RCSB的主服务器和世界各地的镜像服务器提供数据库的检索和下载服务，以及关于PDB数据文件格式和其它文档的说明，PDB数据还可以从发行的光盘获得。使用Rasmol等软件可以在计算机上按PDB文件显示生物大分子的三维结构。RCSB的PDB数据库网址是：http://www.rcsb.org/pdb/。 5. SCOP 蛋白质结构分类(SCOP)数据库详细描述了已知的蛋白质结构之间的关系。分类基于若干层次：家族，描述相近的进化关系；超家族，描述远源的进化关系；折叠子(fold)，描述空间几何结构的关系；折叠类，所有折叠子被归于全α、全β、α/β、α＋β和多结构域等几个大类。SCOP还提供一个非冗余的ASTRAIL序列库，这个库通常被用来评估各种序列比对算法。此外，SCOP还提供一个PDB-ISL中介序列库，通过与这个库中序列的两两比对，可以找到与未知结构序列远缘的已知结构序列。SCOP的网址是：http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/。6. COG 蛋白质直系同源簇(COGs)数据库是对细菌、藻类和真核生物的21个完整基因组的编码蛋白，根据系统进化关系分类构建而成。COG库对于预测单个蛋白质的功能和整个新基因组中蛋白质的功能都很有用。利用COGNITOR程序，可以把某个蛋白质与所有COGs中的蛋白质进行比对，并把它归入适当的COG簇。COG库提供了对COG分类数据的检索和查询，基于Web的COGNITOR服务，系统进化模式的查询服务等。COG库的网址是：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG。下载COG库和COGNITOR程序在：ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/COG。

据美国物理学家组织网报道，北卡罗莱纳大学科学家的一项最新发现显示，细胞感染人类疱疹病毒（EBV）后，会产生小泡或被称为外体的液囊，从而改变细胞中所含的蛋白质和RNA（核糖核酸）。这种变质的外体一旦进入健康细胞，就能转变细胞的良性生长方式，使之变成不可控的致癌生长。这一发现刊登于美国《国家科学院院刊》网络版。EBV可能是世界上最成功的病毒，它无法被免疫系统彻底清除，几乎每个人终生都被它感染。它们不断进入唾液，在这里进行有效地传播。感染这种病毒很少致病，然而在几种主要的癌症中都发现了它的踪迹，包括淋巴瘤和鼻咽癌，它的蛋白质劫持了细胞生长调控机制，引发不可控的细胞生长，从而导致癌变。研究认为一种名为潜伏膜蛋白质1的蛋白质是EBV的致癌基因。通过外体，它们被传递给未受感染的细胞。研究人员还指出，EBV也彻底改变了外体的内含物，在细胞之间传递能激活癌症的蛋白质，这是值得注意的地方。这些发现表明，通过这种方式，病毒感染细胞能广泛影响并潜在控制全身其他细胞，引发它们的不可测生长。免疫系统不断地监视着外来病毒蛋白质，然而经外体携带的这些蛋白质可以不向免疫系统“报告”感染，并刺激癌细胞生长，由此容许了一种不可测的生长。该研究还显示，细胞能产生血管，这一被称为血管新生的过程很容易接受变质外体并引发潜在生长。北卡罗莱纳大学莱恩伯格综合癌症研究中心微生物与免疫学教授南希·瑞玻-特拉玻说：“外体就像特洛伊木马，EBV通过木马甚至能控制那些还没有感染的细胞。但重要的是，外体的产生可能为我们提供了一种新的治疗标靶，封锁它们就能控制癌症蔓延。”论文第一作者、瑞玻-特拉玻实验室博士后戴维·麦克表示，下一步研究是测定哪些蛋白质被选中进入外体，病毒如何控制了这些蛋白质，以及怎样才能遏制这一过程。

可促进深度睡眠的蛋白质6月22日,日本研究人员宣布，他们发现了一种可促进深度睡眠的新型蛋白质。这一研究成果已经刊登在美国《睡眠》杂志网络版上。日本自然科学研究机构生理学研究所科研人员22日发表公告说，他们发现的这种新型蛋白质名为“神经肽B”。迄今为止，安眠药都是通过抑制整个脑神经的活动来促进睡眠，而“神经肽B”只对能促进睡眠的神经发挥作用，因此有望用其开发出只需少量服用就能提高睡眠质量的安眠药。公告说，研究人员2002年就发现人脑存在“神经肽B”，但是一直没有弄清其具体功能。今年，研究人员在一次实验中向老鼠头部注射“神经肽B”，发现夜行性的老鼠在进入深夜后依然保持睡眠状态。而且，他们利用仪器观察睡眠中老鼠的脑电波和肌肉状态时发现，老鼠的大脑和身体都处于休息状态，属于深度睡眠。他们因此认定“神经肽B”具有促进深度睡眠的作用。

想了解蛋白蛋白氨基酸是否有食品级标准

[font=宋体, SimSun][size=15px]蛋白质按来源可以分为动物蛋白和植物蛋白，两者所含的氨基酸是不同的。[/size][/font][font=宋体, SimSun][size=15px][/size][/font][font=宋体, SimSun][size=15px]一般说，植物蛋白和动物蛋白从本质上没有太大的区别，但是在氨基酸组成和数量上有一定的不同。[/size][/font][font=宋体, SimSun][size=15px][/size][/font][font=宋体, SimSun][size=15px]尽管植物蛋白取材来源广泛，但其蛋白的种类和相对数量与人体的要求有一定差距。[/size][/font][font=宋体, SimSun][size=15px][/size][/font][font=宋体, SimSun][size=15px]例如，植物蛋白中缺乏免疫球蛋白[i][/i]，谷类中则相对缺乏赖氨酸等。植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差，但是植物蛋白的优势是不含有胆固醇。动物蛋白相对与人类的营养结构比较吻合，其蛋白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨基酸(特别是蛋制品和奶制品)，所以动物蛋白质比植物蛋白质营养价值高。[/size][/font]