近红像检测

DNA宏条形码技术结合了DNA条形码技术和高通量测序技术，具有高通量、高精度、速度快等特点，为同时检测食物基质中的多个物种提供了理想的方法，包括产品中非预期的物种，因而该技术在肉类及其制品的掺假检测方面具有明显的优势，已成为肉类成分鉴定的新方法。　　很多人都爱吃肉，常吃的肉有猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鱼肉等，其中牛肉成了“造假”的重灾区。近日，一对江苏夫妻因把猪肉上色当牛肉卖被管理部门发现后受罚的新闻也引起了网友的关注和热议。　　“民以食为天，食以安为先”。用猪肉、鸭肉伪造牛羊肉，用低价肉冒充高价肉，动物源性食品中肉类掺假一直是影响食品质量与安全的主要问题之一。那么应该如何快速、准确和高效地进行肉类掺假检测，从而更好地保护好老百姓的“肉篮子”呢？　　DNA宏条形码技术成肉类鉴定新方法　　卖肉作假古已有之。虽然我国已制定相关法规对肉类和肉制品的质量和安全进行监督，但是近年来随着牛肉、羊肉市场需求量增大，以次充好所带来的巨大利润，让肉类掺假现象屡见不鲜。　　如何辨别真假牛肉？有人在网上支招：用眼睛去看，观察和辨别；用鼻子去闻肉的气味；用手去感觉肉的弹性… … 　　但是，消费者仅凭自己的眼睛鉴别肉的真假还是太难。因此，加强检测技术攻关，不断提高检测能力，成为市场监管部门的重要任务。　　“快速、有效、准确和可靠的检测技术是有效监管肉类掺假的关键手段。”广西壮族自治区食品药品检验所微生物室副主任、副主任药师甘永琦表示，脱氧核糖核酸（DNA）检测方法特异性强、灵敏度高，结果不易受到食品加工方式的影响，是检测肉类和肉制品掺假最常用的技术。　　甘永琦介绍，DNA条形码是DNA中的特殊片段，通常由用于区分目标物种的中心可变区和两侧保守区组成，可以作为生物体的遗传标记。利用DNA条形码技术，研究人员对特定区域DNA片段进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序，然后于在线数据库中搜索比对，可以识别出掺假的肉类物种。　　近年来随着基因测序技术的发展，DNA宏条形码技术应运而生。　　“DNA宏条形码技术结合了DNA条形码技术和高通量测序技术，比传统的DNA条形码技术功能更强大，具有高通量、高精度、速度快等特点，为同时检测食物基质中的多个物种提供了理想的方法，包括产品中非预期的物种，因而该技术在肉类及其制品的掺假检测方面具有明显的优势，已成为肉类成分鉴定的新方法。”甘永琦说。　　该怎样具体应用DNA宏条形码技术进行肉类及其制品检测呢？　　甘永琦介绍，为了鉴定样品中的物种，首先要建立一个可靠的数据库，包含目标物种的DNA条形码。使用特定引物对物种DNA的条形码序列进行PCR扩增并获得扩增子，然后合并来自不同样品的扩增子，在一次程序运行中对不同扩增子同时进行测序，将测序得到的物种基因序列与条形码数据库进行匹配，最后通过生物信息学软件分析得到鉴定结果。　　“该方法可以在6小时内同时进行至少96个样品的成分及组分测序分析，提高了检测的效率，节省了时间和人力成本。”甘永琦说。　　最近，甘永琦所在的实验室就从市场上购买了香肠、火腿肠、培根、腊肉、火锅肉片、肉干、肉松、肉丸、烤肉串、肉罐头、肉脯等11种不同类型的肉制品共70多份，使用DNA宏条形码技术进行动物源性成分检测。　　“各样品测序分析结果均符合预期。比如在1份鱼籽包里检测出5种不同动物成分，分别是鸡、猪、鸭、鳙鱼和鲹鱼，与产品标签标示一致。”甘永琦说。　　近年来，该实验室从国内肉制品市场、自然环境中常见的动物及国家重点保护野生动物名录中遴选硬骨鱼纲、软骨鱼纲、哺乳纲、鸟纲、爬行纲等物种作为研究对象，构建了包含1500多个属、2700多个种的动物分类数据库。　　他表示，实验室目前正在扩大测试样本的范围，深入开展肉类掺假检测方法的特异性、灵敏度和准确性研究。　　在全球范围内多个领域得到广泛应用　　目前，DNA宏条形码技术在肉类掺杂检测中还面临哪些挑战？　　有研究表明，目前用于动植物分类鉴定的标准DNA条形码并不完全适用于环境样本的应用。　　甘永琦介绍，首先，标准DNA条形码倾向于那些能够识别相似物种的特殊片段，通常具有较长的基因序列。然而，环境中的DNA容易降解成较短的基因片段，从而阻碍条形码的扩增。　　其次，DNA宏条形码技术需要同时扩增一个样本中所有物种的DNA，那么就必须限制某些物种DNA的过度扩增。因此，需要筛选比较几个非标准的候选条形码，确定新的DNA区域，以达到该方法的限制要求。　　另外，在物种多样性定量分析中，由于高通量测序过程中部分因素可能会导致结果存在偏差，进而影响原始样品中物种定量估算的准确性。　　作为食品安全的主要问题之一，肉类及其制品的掺假问题近年来越来越受到人们的关注。尽管面临一些挑战，但DNA宏条形码技术可以对未知物种进行快速、准确地识别，无疑为肉类掺假检测提供了优异的技术手段。　　除了用于肉类掺假检测，DNA宏条形码技术目前还可以应用在哪些领域？　　“在理论上几乎任何一个样本都可以通过DNA条形码技术进行物种识别。近年来，该技术已应用于多个领域，如生态学、法医学、生物技术、食品工业、动物饮食、食品质量等。”甘永琦说。　　目前，DNA宏条形码技术已经在全球范围内多个领域得到广泛应用。但是由于该技术在国内外未形成完善的检测标准，因此还处于研究阶段。　　甘永琦表示，基于该技术的研究，他们团队已申请2项国家发明专利和1项检测方法的团体标准，未来将搭建一个免费共享的数据分析网络平台，为该技术的应用推广扫清障碍。

摘 要 本文介绍了食品中苏丹红检测方法的研究进展，主要包括高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、薄层层析法等。 　　关键词 苏丹红 高效液相色谱 液相色谱-质谱 气相色谱-质谱联用 薄层层析 　　近年来，一些国家和地区不断发生食品污染等恶性事件。特别是随着科技的发展，一些原来认为无害的食品添加剂，发现存在慢性或致癌作用,原来检测不出的有害物质被查出等。苏丹红是偶氮苯类人工色素，属于工业染料，主要用于油、蜡、鞋等的增光着色。由于苏丹红I、II、III、IV及其代谢产物具有致癌性，国家禁止作为色素添加剂在食品中使用。苏丹红I、II、III、IV的检测方法有高效液相色谱法[1]、液相色谱-质谱法[2]、气相色谱-质谱联用法[3]、薄层层析法[4]等。 　　1. 高效液相色谱法对食品中苏丹红的检测 　　高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代色谱柱分离分析方法，它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术发展起来的[5]。原则上讲，只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱法分析。在目前已知的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析[6]。高效液相色谱法主要有以下几种： 　　1.1 欧洲委员会推荐的液相色谱法[7] 　　该方法是将样品经匀浆化或粉碎后，加入乙睛(苏丹红III、IV加入氯仿)提取，过滤，滤液用反相高效液相色谱仪进行色谱分析。苏丹红I、苏丹红II的检测波长为478nm，苏丹红III、苏丹红IV则为520nm。苏丹I的检测限是0.013&mu g/ml、最低浓度为0.106&mu g/ml、在辣椒粉样品中的添加回收率高于90%。 　　1.2 国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会发布的高效液相色谱法 　　该方法在欧洲委员会公布的检验方法的基础上作了改进。苏丹红检测方法国家标准采用了简单的正相吸附固相萃取原理，一次性去除了样品中红辣椒和番茄中的干扰成分，使用目前国内已广泛应用的高效液相色谱仪就可准确完成4种苏丹红染料的检测。该法用正己烷代替乙睛做提取液，提取后经旋转蒸发仪蒸发浓缩，氧化铝层析柱固相萃取净化后，采用梯度洗脱，用反相高效液相色谱进行色谱分析，外标法定量。 　　检测波长:苏丹红I为478nm 苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV为520nm。于苏丹红I出峰后切换。 　　王艳春[8]等简化了样品的前处理，避免高效液相色谱淋洗液乙睛、丙酮溶液对人体的损害，降低了成本，提高了仪器稳定性[9]。用0.1%甲酸的甲醇溶液作为淋洗液，不用梯度洗脱测定食品中苏丹红含量。研究了用高效液相色谱法测定食品中苏丹红的色谱条件、线性范围。该方法的检出限苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV分别为:11&mu g/kg、10&mu g/kg、8&mu g/kg、8&mu g/kg，相对标准偏差2.6%，回收率为88%～106%。 　　1.3 凝胶柱净化-高效液相色谱法 　　凝胶层析是指混合物随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起过滤或&ldquo 筛&rdquo 的作用，故又称为凝胶过滤或分子筛层析(gel chromatography)[10]。 　　Mazzctti M报道了一种简单而快速的苏丹I检测方法[11]，包括Soxtcc萃取、高压凝胶层析纯化，HPLC紫外/VIS 检测器检测。最低检出限为7&mu g/kg，定量分析限为13&mu g/kg。 　　杨建荣等[12]认为苏丹Ⅰ分子结构上的偶氮键可表现为弱碱性，在低pH值时，偶氮键的氮原子可吸引少量质子H+，增强分子极性，洗脱加快 但洗脱液pH值在2～4.5时， pH值变化对分子极性影响不大，而pH值在4.0～6.0时,分子极性随pH值变化非常明显。并考察了联苯胺、苏丹红Ⅲ、偶氮蓝、丽春红4R四种偶氮染料对苏丹红I色谱分离的干扰，发现以pH值为2.65的冰乙酸水溶液和乙腈为流动相进行线形梯度洗脱，可获得很好的分离效果。杨建荣等[13]考察了不同配比的乙腈-磷酸、乙腈-乙酸乙酯和乙腈-甲酸体系对苏丹红的分离情况。结果表明，采用乙腈-乙酸溶液为流动相体系时，待测物谱峰纯度高。欧盟法[14]流动相为16.5%乙酸水溶液和乙腈，酸度较高，对柱子要求也比较高。张玉黔等[15]分别用0.1%、1%、10%醋酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱。结果表明，醋酸浓度对苏丹红的分离没有影响，但低浓度醋酸对色谱柱的损害相对较小以及在此条件下待测样品的杂峰对苏丹红的测定也无影响，整个分析时间只需32 min。 　　2.LC/MS法对食品中苏丹红的测定 　　色谱-质谱联用技术结合了色谱、质谱两者的优点，故成为仪器分析进展的热点。LC可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肤、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤[16]。MS作为理想的色谱检侧器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度[17]。因此，色谱-质谱联用长期为人们所关注。随着各种离子化技术的不断出现，液质联用在生物、医学等领域的地位越来越重要[18]。 　　对于复杂食品基质本底或一种新的基质本底，HPLC检测后，通过LC/MS确证苏丹红的存在是必要的。此外，如果光谱分析结果不令人满意(如待分析物浓度较低或可能存在结构类似物时)也可用LC/MS技术进行确证。质谱法比高效液相法灵敏20倍[19]。可检出ppb数量级。由于涉及样品大多是辣椒和番茄制品，样品本身的复杂基质直接干扰仪器检测，且苏丹红具有非离子性脂溶物的特点，导致样品提取、纯化、富集非常困难，采用好的提取溶剂往往造成提取液中混入大量的干扰成分，若考虑低残留量进行富集往往首先浓缩的是样品的内源性物质，结果使得干扰更为严重[20]。由于这类染料的特点，先进国家普遍采用的研究方法是液相色谱-质谱联用技术。欧盟标准方法《辣椒粉及以辣椒为主要成分的产品中苏丹红和胭脂树橙的含量分析》中也使用大型液质联用仪。质谱检测仪具有定性优势，是我国标准发布前检测苏丹红常用的办法。有毛细管液相-电喷雾-飞行质谱法[21]，液相色谱-大气压化学电离-多极质谱法[22]和液相色谱-电喷雾质谱法[23]，均属于液相色谱-质谱联用检测法。该方法经过液相分离、光谱定量、质谱定性而最终实现对食品中苏丹红的检测。 　　用LC-ESI/MS法可以分析食品中4种苏丹红色素[10]。样品中的苏丹红用乙睛提取，需纯化。色谱柱为Agilnet C18，流动相为乙睛-0.5%乙酸溶液(体积比72:28)。采用正离子电离方式，每种化合物选择3个碎片离子为定性离子以获得高选择性，选取每个化合物丰度最高的碎片为定量离子以获得高灵敏度。4种苏丹红色素的检出限(LOD)和检量(LQO)均为ng/g水平。标准加入量为0.2&mu g/g水平时的回收率为86%～98%，且重现性良好。仪器分析时间仅需8min，适合于大量样品快速分析。 　　&ldquo 染红食品&rdquo 中苏丹红I、II、III和IV残留量的高效液相色谱(HPLC)初筛、质谱分析方法已经报道[4]。以MerckRP-18柱为分析柱，流动相：乙睛：水=90：10，二极管矩阵检测器(PDA)和MAX质谱仪为检测器。平均回收率(%)：87.3、83.0、86.7和90.0。 　　3.GC/MS法对食品中苏丹红的测定 　　用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法(gas chromatography，GC)。它是由惰性气体将气化后的试样带入加热的色谱柱，并携带分子渗透通过固定相，达到分离的目的。气相色谱法具有分离效率高、灵敏度高及速度快的特点。气质联用系统中，质谱仪相当于色谱的定性检测器[16]。 　　气相色谱-质谱(GC-MS)选择离子检测法(SIM)，同时测定了食品中苏丹红I～IV[25]。色谱柱为PR-SR石英毛细管柱载气He: EI离子源，选择m/z77，105，115，143，176，247，248，261，352，380用于SMI检测，并按不同的采样时间分成4组，每组4个离子，分别对应于每种苏丹红进行定性分析确证 选择苏丹红I～IV各自的分子离子峰m/z248，276，352，380作抽出离子图进行定量分析。苏丹红I、II的线性范围为0.01～10.0mg/L，苏丹红III、IV的线性范围为0.1～10.0mg/L 检出限：苏丹红I、II为1&mu g/kg，苏丹红III为5&mu g/kg，苏丹红IV为10&mu g/kg 回收率86%～95%。该法与欧洲健康与消费者保护委员会的方法(HPLC法)相比，灵敏度高1～2个数量级，分析时间缩短，用色谱保留时间，质谱同时定性，消除了食品中杂质的干扰，结果准确可靠，选择性和重复性好，适用于所有食品成品及原料的检验。 　　固相萃取-气质联用被用于测定辣椒油中苏丹红I和苏丹红II[26]。用Strata-X小柱进行辣椒油样品的前处理，用气质联用法对苏丹红I和苏丹红II进行定性和定量分析。对苏丹红I和苏丹红II方法的检出限分别为0.5&mu g/L和0.7&mu g/L，平均回收率分别为93.8%和95.9%，RSD分别为2.7%～6.9%和1.1%～4.4%。 　　气相色谱-质谱(GC-MS)选择离子检测法(SIM)，测定了食品中苏丹红I号[25]。用石英毛细管柱，He载气 EI离子源，选择m/z277、115、143、248离子用于SIM检测，并根据这4个抽出离子的峰面积比进行确证。苏丹红I号的线性范围为0.01～10.0mg/L，相对标准偏差小于6.1%，回收率85%～90%，检出限为0.001mg/kg，每个样品分析时间为5min。该法与欧洲健康与消费者保护委员会发布的方法(HPLC法)相比灵敏度高两个数量级，分析时间缩短，用色谱保留时间，质谱同时定性，消除了食品中杂质的干扰，避免了只用色谱保留时间定性可能产生的错误，结果准确可靠，选择性和重现性好，适用于所有食品成品及原料的检验。 　　4.薄层色谱法对食品中苏丹红的测定 　　薄板和展开剂的选择在薄层色谱法测定中均起着关键作用，也是食品中苏丹红薄层色谱法测定的研究重点。 　　薄板和展开剂对分开样品中苏丹红有重要影响。王鲜俊等[27]比较了同一展开剂甲醇-丙酮-醋酸在硅胶G薄层板、聚酰胺薄层板、硝酸盐-硅胶G板上对苏丹红Ⅰ～Ⅳ的展开效果，发现在聚酰胺薄层板上，苏丹红Ⅰ～Ⅳ快速展开，且斑点集中 而硅胶G薄层板对苏丹红Ⅰ、Ⅱ分不开，硝酸盐-硅胶G板对苏丹红Ⅲ、Ⅳ分不开。张杨[28]采用展开剂正丁醇-无水乙醇-氨水，在聚酰胺薄层板上可将苏丹红Ⅰ～Ⅳ分开，但有拖尾现象。庞艳玲[29]通过对比研究，发现在硅胶G板上，展开剂正己烷-二氯甲烷-氨水可迅速、稳定地分开样液和标液中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ 而展开剂三氯甲烷-正己烷、三氯甲烷-石油醚、三氯甲烷-石油醚-醋酸不能将苏丹红Ⅰ、Ⅱ分开 展开剂甲醇- 丙酮- 醋酸对苏丹红Ⅰ～Ⅳ均不能分开。 　　5.结束语 　　国内外食品质量安全事件之所以接连发生，除了有关食品质量安全的法规不健全外，食品检测技术不过关、检测仪器使用不方便也是重要的原因。为保护人类健康，对食品中苏丹红染料的测定需要进一步深入研究，尽快建立一种实用、快捷、准确可靠的检测技术。 　　参考文献 　　[1] 李军, 雍炜, 李刚, 等. 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苏丹红事件是目前的热点问题，因为苏丹红是一种强致癌性合成偶氮染料，在我国属于在食品中绝对禁用的色素，因此在我国相关的食品标准，部颁标准，或者地方性法规中，并没有列入苏丹红的检验方法，所以，这次的事件将我们检验界的同仁打了个措手不及。 目前厦门，重庆，辽宁的相关单位如检验检疫局均纷纷发表，开发出了自己的方法，基本方法均采用是HPLC法，因为苏丹红具有1，2，3，4等多种异构体（或者同系物），HPLC是基于完全预先分离，然后再以适当的检测器检测标定的方法，测定的结果也最可靠，相互干扰最小，所以，与各国药典委员会指导的检测方法的趋势相一致，是优先采用的方法。 最近，国家质检总局公布了欧盟认可的检测方法，作为我国苏丹红的暂行检验标准（规程）。 东南科仪已将译文转载，请到技术文章中去下载。 联络东南科技技术部亦可获得完整而详细的资料： 东南科仪 dongnan@sinoinstrument.com CDMA：13380008114（技术服务） 8119（销售） 广州：东风中路268号广州交易广场1706室(510030) 电话：020-83510088（十线） 83510550 83510358 传真：020-8351038 北京：海淀区交大东路60号舒至嘉园3座 (100044) 电话：010-62268660 62260833 62238029 传真：010-62238297