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我现在需要用电泳来测定大豆蛋白及其酶解物的分子量分布,可是从来没有作过电泳实验,也没有参考方法,只好在这里求助了:我的样品是大豆分离蛋白酶解物干粉,有蛋白、小分子肽、氨基酸,还有一些其他极低含量的糖、盐等杂质,不能全溶于水。不过可以溶于ph在8左右的碱溶液里。不晓得我该怎么处理样品才能点样:遍查方法,只是说样品蛋白要和样品溶解液或稀释液混合后点样电泳,可没说之前怎么处理此类样品,请高手指教,不胜感激
上样电泳 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X,混匀 Loading buffer浓度不宜过低,点样时样品不能很好的沉在胶孔里;不宜过高,电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡,拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完,吸取buffer洗枪头,避免样品混杂。如果是有特殊要求,例如回收,强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好,注意保证质量。点样的量不要太大,一方面是体积不要太大,溢出污染邻位样品;一方面两不要太大,容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源,选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态,防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看,防止样品跑出胶等意外发生。
电泳基本原理 迁移率(或泳动度)是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度,可用下列公式计算: U =υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt U为迁移率(cm2•V-1•min-1);υ为颗粒泳动速度(cm•s-1);E 为电场强度( V•cm-1);d为颗粒泳动的距离(cm);l为滤纸有效长度(cm);V为实际电压(V);t为通电时间(s或min)。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。 1迁移率单位= 10-5 cm2•V-1•min-1在确定的条件下,某物质的迁移率为常数,是该物质的化学特征常数。 颗粒带净电荷多,直径小而接近于球形,则在电场中泳动速度快,反之则泳动速度慢。 迁移率还与分子的形状,介质粘度,颗粒所带电荷有关,迁移率与颗表面电荷成正比,与介质粘度及颗粒半径成反比。 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 温度的影响 支持物的影响 按分离原理分类: 1.区带电泳 2.移界电泳 3.等速电泳 4.聚焦电泳 按有无固体支持物分类 1. 纸上电泳 2. 醋酸纤维素膜电泳 3. 薄层电泳 4. 非凝胶性支持物区带电泳(支持物有:淀粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶) 5. 凝胶支持区带电泳(淀粉凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、琼脂糖凝胶) 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 DNA的大小 DNA的构象 琼脂糖浓度 缓冲液 不同构像质粒 缓冲液 TAE:乙酸盐缓冲液 TBE:硼酸盐缓冲液 TPE:磷酸盐缓冲液 实验操作 1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住,形成一个胶模并水平放置。 2. 按水平板的长×宽×0.5cm胶厚,量取0.5×TBE,并按0.7%的浓度称取agarose琼脂糖,在微波炉或电炉上加热至全熔(清澈透明)。 3. 等凝胶温度降至大约50-60以下时,加入1 mg/L溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5ug/mL ;摇匀并轻快地倒入水平板中,除掉气泡,插入梳子。 4. 凝固后,将梳子轻轻拔出。 5.去掉胶带,将水平板放入加有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中,并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。 6.在parafilm膜上依次加: ddH2O 6ul,上样Buffer 2ul ,DNA 4ul 分别混匀后点样,记录点样次序。 7. 在水平板两边的点样孔中分别加入6 μ l的λΔΝΑ/EcoRI+HindIII marker。 8. 盖好电泳槽盖子,选择适当的电泳电压(≤5V/cm)及电泳方向(DNA阴极阳极),开始电泳。 9. 当色素接近胶的先端,停止电泳,样品在紫外灯下观察、成像℃