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平板振捣器

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    出口食品平板菌落计数 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN 0168-92代替 ZB X09 001-86 Plate count for bacterial colonies in food for export 1 主题内容与适用范围  本标准规定了出口食品平板菌落计数的方法。  本标准适用于各种出口食品及其原料,有专门规定检验方法的除外。2 设备和材料2.1 工作台:超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。琼脂平板在工作台上暴露15 min,每平板不得超过15个菌落。2.2 恒温培养箱:36±1℃。2.3 恒温水浴箱:45±1℃。2.4 均质器。 2.5 振荡器。2.6 吸管:1、10和25mL,具0.1mL刻度。2.7 平皿:直径为90 mm。2.8 稀释瓶:广口瓶或三角烧瓶,容量为200 mL和500 mL。2.9 玻璃珠:直径为5mm左右。 2.10 天平:感量0.1g。3 培养基和试剂 3.1 平板计数琼脂。3.2 75%乙醇。3.3 稀释剂:磷酸盐缓冲稀释液。4 操作程序 4.1 样品制备 4.1.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内,如有包装,则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。4.1.2 制备样品匀液4.1.2.1 固体或半固体食品:以无菌操作取25 g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:10的样品匀液。如样品均质时间超过2min,应在均质杯外加冰水冷却。4.1.2.2 干燥或干粉食品:以无菌操作取25 g样品,放入装有225mL稀释剂和适量玻璃珠的500 mL稀释瓶中。迅速振摇,将样品混匀,制成1 : 10的样品匀液。振摇时,幅度为30cm,7s内振摇25次,也可用机械振荡器振荡15s代替手摇。4.1.2.3 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品, 放入装有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中,按4.1.2.2条中所述方法迅速振摇,制成1:10的样品匀液。吸取样品时,吸管插入液面下不要超过2.5cm。吸管内液体要在2~4s内完全排入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。4.2 稀释样品匀液 4.2.1 用10 mL灭菌吸管准确吸取1:10的样品匀液10 mL,放入装有90 mL稀释剂的200mL, 稀释瓶中。按4.1.2.2条中所述的方法,迅速振摇。制成1:100的样品液。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中,吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度,然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。4.2.2 分别用10mL灭菌吸管按4.2.1条所述方法将样品匀液制成10倍递增稀释的样品液,如10**-3、10**-4、10**-5……。4.3 平板接种4.3.1 对于每一个样品,选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。 4.3.2 分别用灭菌吸管吸取1mL样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过3 min,应按4.1.2.2条所述方法再振摇该样品液。4.3.3 分别加12~15mL平板计数琼脂(已放45+1℃的水浴中恒温)到各平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合方法是将平皿倾斜和旋转。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1 mL稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基,每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。4.4 培养   待琼脂凝固后将平皿翻转,立即放进36±1℃的恒温培养箱内培养48±2h。培养箱应 保持一定的湿度,经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15%。4.5 菌落计数和记录4.5.1 培养后,立即计数每个平板上的菌落数。25~250个菌落为合适范围。如果不能立即计数,应将平板存放于0~4℃,但不得超过24 h。 4.5.2 如只有一个稀释度的两个平板上的菌落在合适范围内, 先计算两个平板的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)样品中平板菌落数(下表,样品1)。4.5.3 如有两个稀释度在合适范围内,先计算每个稀释度两个平板的平均值,再计算两个稀释度的平均值,然后计算每克(毫升)样品中平板菌落数(下表,样品2)。4.5.4 当最低稀释度的两个平板上都少于25个菌落时,计数这一稀释度两个平板上的实际菌落数,计算两个平板上的平均菌落数,将平均菌落数乘以稀释倍数,得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号(*), 表明该数系从菌落数在25~250这一范围之外的平板估计所得(下表,样品3)。4.5.5 当所有平板上的菌落都超过250时,则应将最高稀释度的两个平板的平均菌落数乘以稀释倍数,得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号(*) (意义同4.5.4)(下表,样 品4)。4.5.6 如果所有稀释度的平板都没有菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数报告平板菌落数。给这个数注上星号(*) (意义同4.5.4条) (下表,样品5)。4.5.7 同一稀释度的两个平板中,一个有25~250个菌落,另一个的菌落多于250个,两个平板都要计数。计算方法同4.5.2条(下表,样品6)。4.5.8 两个连续稀释度中的每个稀释度都有一个平板的菌落数在25~250个范围内,而另一个的菌落数高于250或低于25,四个平板都要计数。计算方法参照4.5.2条和4.5.3条(下表,样品7)。 4.5.9 某稀释度的两个平板都有25~250个菌落,而另一稀释度的两个平板中只有一个平板的菌落数在 25~250范围内。四个平板都要计数,计算方法参照4.5.2条和4.5.3条 (下表,样品8、9)。4.5.10 蔓延生长菌落 通常有三种不同类型的蔓延生长菌落。第一种类型是链状菌落,菌落之间没有明显界线,这些菌落是当琼脂和试验物混合时,一个细菌块被分散所致;第二种类型是在琼脂和 平皿底之间形成的水膜样菌落;第三种是在平皿边缘或琼脂表面形成的水膜样菌落。如果所选择的平板出现过量的蔓延菌落生长,以致a.被蔓延菌落盖住的地方,包括由于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板面积的50%,或b.由于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板面积的25%,这样的平板报告为“蔓延菌落”,不予计数。计数其他平板上的菌落数,将这些数值的算术平均值报告为平板菌落数(下表,样品10)。  当有必要计数除以上a.和b.外的蔓延生长菌落时,将三种不同类型的蔓延菌落分别计数。对于第一种类型,如果仅有一条链,将它作为一个菌落计。如果有来源不同的几条链, 将每条链作为一个菌落计,不要把链上生长的各个菌落分开来数。第二种和第三种类型的蔓延生长形成易于鉴别的菌落,即按一般菌落计数,把计数的蔓延生长菌落数同一般菌落数加在一起,计算平板菌落数。4.5.11 操作者对同一平板复核自己的计数结果,其差异应在5%之内,而其他人对这一平板重复计数,其差异应在10%之内。否则,应找出原因,加以校正。 4.6 计算和记录数字  适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释倍数计算出每克(毫升)样品中平板菌落数。  记录时,只有在换算到每克(毫升)样品中平板菌落数时,才能定下两位有效数字,第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式(见下表中的例子)。5 结果报告   报告每克(毫升)样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。              平板菌落数计算 样品号 菌 落 数 平板菌落数/g(mL) 1:100 1:1000 1:10000 1 多不可计 175 16 多不可计 208 17 190000(1.9×10**5) 2 多不可计 224 25 多不可计 245 30 250000(2.5×10**5)* 3 18 2 014 0 0 1600(1.6×10**3)* 4 多不可计 多不可计 523多不可计 多不可计 487 5100000(5.1×10**6)* 5 0 0 00 0 0 <100 (<1.0×10**2)* 6 多不可计 245 23 多不可计 278 20 260000(2.6×10**5) 7 多不可计 225 21多不可计 255 40 270000(2.7×10**5) 8 多不可计 210 18多不可计 240 28 230000(2.3×10**5) 9 多不可计 260 30 多不可计 230 28 270000(2.7×10**5) 10 多不可计 245 35多不可计 230 蔓延菌落 290000(2.9×10**5) 注:带星号*者为估计数。附 录 A 培养基制备 (补充件) A1 平板计数琼脂   胰蛋白胨      5.0g   酵母浸膏      2.5g   葡萄糖       1.0g   琼 脂       15.0g   蒸馏水       1000mL   将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装试管或烧瓶,121℃高压灭菌15min。最终pH7.0±0.1。A2 磷酸盐缓冲稀释液 贮存液:     磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g   蒸馏水       500mL   用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2,用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液:用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于合适容器,121℃高压灭菌15min。附加说明:  本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。  本标准由中华人民共和国河南进出口商品检验局、湖南进出口商品检验局负责起草    本标准主要起草人李志培、邓明义。  本标准主要参考美国食品和药物管理局(FDA)《细菌学分析手册》第6版第4章(1984年)。 中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施

  • 出口食品平板菌落计数

    出口食品平板菌落计数 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN 0168-92代替 ZB X09 001-86 Plate count for bacterial colonies in food for export 1 主题内容与适用范围  本标准规定了出口食品平板菌落计数的方法。  本标准适用于各种出口食品及其原料,有专门规定检验方法的除外。2 设备和材料2.1 工作台:超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。琼脂平板在工作台上暴露15 min,每平板不得超过15个菌落。2.2 恒温培养箱:36±1℃。2.3 恒温水浴箱:45±1℃。2.4 均质器。 2.5 振荡器。2.6 吸管:1、10和25mL,具0.1mL刻度。2.7 平皿:直径为90 mm。2.8 稀释瓶:广口瓶或三角烧瓶,容量为200 mL和500 mL。2.9 玻璃珠:直径为5mm左右。 2.10 天平:感量0.1g。3 培养基和试剂 3.1 平板计数琼脂。3.2 75%乙醇。3.3 稀释剂:磷酸盐缓冲稀释液。4 操作程序 4.1 样品制备 4.1.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内,如有包装,则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。4.1.2 制备样品匀液4.1.2.1 固体或半固体食品:以无菌操作取25 g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:10的样品匀液。如样品均质时间超过2min,应在均质杯外加冰水冷却。4.1.2.2 干燥或干粉食品:以无菌操作取25 g样品,放入装有225mL稀释剂和适量玻璃珠的500 mL稀释瓶中。迅速振摇,将样品混匀,制成1 : 10的样品匀液。振摇时,幅度为30cm,7s内振摇25次,也可用机械振荡器振荡15s代替手摇。4.1.2.3 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品, 放入装有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中,按4.1.2.2条中所述方法迅速振摇,制成1:10的样品匀液。吸取样品时,吸管插入液面下不要超过2.5cm。吸管内液体要在2~4s内完全排入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。4.2 稀释样品匀液 4.2.1 用10 mL灭菌吸管准确吸取1:10的样品匀液10 mL,放入装有90 mL稀释剂的200mL, 稀释瓶中。按4.1.2.2条中所述的方法,迅速振摇。制成1:100的样品液。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中,吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度,然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。4.2.2 分别用10mL灭菌吸管按4.2.1条所述方法将样品匀液制成10倍递增稀释的样品液,如10**-3、10**-4、10**-5……。4.3 平板接种4.3.1 对于每一个样品,选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。 4.3.2 分别用灭菌吸管吸取1mL样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过3 min,应按4.1.2.2条所述方法再振摇该样品液。4.3.3 分别加12~15mL平板计数琼脂(已放45+1℃的水浴中恒温)到各平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合方法是将平皿倾斜和旋转。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1 mL稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基,每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。4.4 培养   待琼脂凝固后将平皿翻转,立即放进36±1℃的恒温培养箱内培养48±2h。培养箱应 保持一定的湿度,经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15%。4.5 菌落计数和记录4.5.1 培养后,立即计数每个平板上的菌落数。25~250个菌落为合适范围。如果不能立即计数,应将平板存放于0~4℃,但不得超过24 h。 4.5.2 如只有一个稀释度的两个平板上的菌落在合适范围内, 先计算两个平板的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)样品中平板菌落数(下表,样品1)。4.5.3 如有两个稀释度在合适范围内,先计算每个稀释度两个平板的平均值,再计算两个稀释度的平均值,然后计算每克(毫升)样品中平板菌落数(下表,样品2)。4.5.4 当最低稀释度的两个平板上都少于25个菌落时,计数这一稀释度两个平板上的实际菌落数,计算两个平板上的平均菌落数,将平均菌落数乘以稀释倍数,得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号(*), 表明该数系从菌落数在25~250这一范围之外的平板估计所得(下表,样品3)。4.5.5 当所有平板上的菌落都超过250时,则应将最高稀释度的两个平板的平均菌落数乘以稀释倍数,得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号(*) (意义同4.5.4)(下表,样 品4)。4.5.6 如果所有稀释度的平板都没有菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数报告平板菌落数。给这个数注上星号(*) (意义同4.5.4条) (下表,样品5)。4.5.7 同一稀释度的两个平板中,一个有25~250个菌落,另一个的菌落多于250个,两个平板都要计数。计算方法同4.5.2条(下表,样品6)。4.5.8 两个连续稀释度中的每个稀释度都有一个平板的菌落数在25~250个范围内,而另一个的菌落数高于250或低于25,四个平板都要计数。计算方法参照4.5.2条和4.5.3条(下表,样品7)。 4.5.9 某稀释度的两个平板都有25~250个菌落,而另一稀释度的两个平板中只有一个平板的菌落数在 25~250范围内。四个平板都要计数,计算方法参照4.5.2条和4.5.3条 (下表,样品8、9)。4.5.10 蔓延生长菌落 通常有三种不同类型的蔓延生长菌落。第一种类型是链状菌落,菌落之间没有明显界线,这些菌落是当琼脂和试验物混合时,一个细菌块被分散所致;第二种类型是在琼脂和 平皿底之间形成的水膜样菌落;第三种是在平皿边缘或琼脂表面形成的水膜样菌落。如果所选择的平板出现过量的蔓延菌落生长,以致a.被蔓延菌落盖住的地方,包括由于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板面积的50%,或b.由于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板面积的25%,这样的平板报告为“蔓延菌落”,不予计数。计数其他平板上的菌落数,将这些数值的算术平均值报告为平板菌落数(下表,样品10)。  当有必要计数除以上a.和b.外的蔓延生长菌落时,将三种不同类型的蔓延菌落分别计数。对于第一种类型,如果仅有一条链,将它作为一个菌落计。如果有来源不同的几条链, 将每条链作为一个菌落计,不要把链上生长的各个菌落分开来数。第二种和第三种类型的蔓延生长形成易于鉴别的菌落,即按一般菌落计数,把计数的蔓延生长菌落数同一般菌落数加在一起,计算平板菌落数。4.5.11 操作者对同一平板复核自己的计数结果,其差异应在5%之内,而其他人对这一平板重复计数,其差异应在10%之内。否则,应找出原因,加以校正。 4.6 计算和记录数字  适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释倍数计算出每克(毫升)样品中平板菌落数。  记录时,只有在换算到每克(毫升)样品中平板菌落数时,才能定下两位有效数字,第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式(见下表中的例子)。5 结果报告   报告每克(毫升)样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。              平板菌落数计算 样品号 菌 落 数 平板菌落数/g(mL) 1:100 1:1000 1:10000 1 多不可计 175 16 多不可计 208 17 190000(1.9×10**5) 2 多不可计 224 25 多不可计 245 30 250000(2.5×10**5)* 3 18 2 014 0 0 1600(1.6×10**3)* 4 多不可计 多不可计 523多不可计 多不可计 487 5100000(5.1×10**6)* 5 0 0 00 0 0 <100 (<1.0×10**2)* 6 多不可计 245 23 多不可计 278 20 260000(2.6×10**5) 7 多不可计 225 21多不可计 255 40 270000(2.7×10**5) 8 多不可计 210 18多不可计 240 28 230000(2.3×10**5) 9 多不可计 260 30 多不可计 230 28 270000(2.7×10**5) 10 多不可计 245 35多不可计 230 蔓延菌落 290000(2.9×10**5) 注:带星号*者为估计数。附 录 A 培养基制备 (补充件) A1 平板计数琼脂   胰蛋白胨      5.0g   酵母浸膏      2.5g   葡萄糖       1.0g   琼 脂       15.0g   蒸馏水       1000mL   将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装试管或烧瓶,121℃高压灭菌15min。最终pH7.0±0.1。A2 磷酸盐缓冲稀释液 贮存液:     磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g   蒸馏水       500mL   用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2,用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液:用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于合适容器,121℃高压灭菌15min。附加说明:  本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。  本标准由中华人民共和国河南进出口商品检验局、湖南进出口商品检验局负责起草    本标准主要起草人李志培、邓明义。  本标准主要参考美国食品和药物管理局(FDA)《细菌学分析手册》第6版第4章(1984年)。 中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施

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    [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333](1)菌落长在一起有三种情况:[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]①平板上存在杂菌,杂菌污染造成菌落集中在一起;[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]②配制培养基时没有将样品混匀,使营养物质分布不均匀,导致菌落长在一块;[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]③稀释涂布平板法:在稀释涂布时,未能均匀涂布;平板划线法:划线太重,接种针的原菌种未能分散开来。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333](2)菌落和菌苔有什么区别?[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]①菌落:是由单个细菌细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度,形成肉眼可见的子细胞群落。菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]②菌苔:是细菌在固体培养基接种线上由母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的细菌群落,一般为大批菌落聚集而成。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]③菌落与菌台的区别:[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]菌落:圆形边缘整齐,表面光滑,半透明,小凸起;在伊红美蓝琼脂平板上:深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]菌苔:边缘光滑整齐;表面较透明;显出鲜艳的颜色;显得湿润,易被接种环挑起。[/color][/size][/font]

  • 细菌的转化与平板计数

    感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性]培养基[/url]中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp[sup]r[/sup]等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性[://]培养基[/url]上。重组质粒转化宿主细胞后,还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列,此结构称为[i]lac[/i]Z'基因。[i]lac[/i]Z'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。任何携带着[i]lac[/i]Z'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后,便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶,在IPTG(异丙基β—D—硫代半乳糖苷)诱导后,在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落(半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝)。而当有外源DNA片段插入到位于[i]lac[/i]Z'中的多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽,而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶,也就不能分解Xgal而显蓝色,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。[仪器、材料与试剂](一) 仪器和材料 超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴、离心管、试管、培养皿、锥形瓶、接种针、玻璃涂棒、酒精灯、镊子、牙签、大肠杆菌DH5a 、质粒(二) 试剂0.1mol/L CaCl2溶液 LB液体培养基 LB固体培养基 氨苄青霉素(Amp):用无菌水配制成100mg/mL溶液,置—20℃冰箱保存。Xgal:将Xgal溶于二甲基甲酰胺,配成20mg/mL,不需过滤灭菌,分装小包装,避光贮存于-20℃。IPTG:取2g IPTG溶于8mL双蒸水中,再用双蒸水补至10mL,用0.22um滤膜过滤除菌,每份1mL,贮存于-20℃。[实验步骤](一) 制备感受态细胞1、吸取15µl E.coil菌液,接种于20ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,待OD600=0.5左右将该菌悬液以1:50接种量转于50ml LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20-30min测一次OD600,至OD600=0.6左右,停止培养。2、培养液转入离心管中,在冰浴10min,4℃下5000rpm离心10min。3、弃上清液,用4ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀,冰上放置30min。4、4℃下5000rpm离心6min。5、弃上清液,用2ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀,冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。6、以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24小时内直接用于转化实验,也可加入15%高压灭菌过的甘油,混匀后,分装于1.5ml离心管中,每管100µ l感受态细胞悬液,置-70℃条件下保存。.(二) 质粒DNA转化大肠杆菌1、取100µl摇匀后的感受态细胞悬浮液(如是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面的操作),加入5µl连接产物,轻轻摇匀,冰上放置30min后,于42 IPTG水浴中保温90s,然后迅速在冰上冷却2min。2、加入900µl LB液体培养基,则总体积约1ml,混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Amp[sup]r[/sup]。3、在预制的LB琼脂平板上,加40uL 20mg/mL的Xgal和4uL 200mg/mL的IPTG溶液,并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却),均匀涂布于琼脂凝胶表面,37℃倒置吸收。4、将恢复培养的菌体4000rpm离心5min,移去上层900µl LB培养基,用余下的100µl重悬菌体至均匀。(四) α互补现象的检查将重悬菌体均匀涂布于含X-gal+IPTG+氨苄青霉素的LB平板上,37℃倒置培养12—24h,出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。如果进一步验证,可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养6-8h,然后提取质粒酶切验证,或进行菌落PCR扩增鉴定。

  • 稀释平板计数

    一、实验目的了解稀释平板计数的原理,掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法,认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。二、实验原理 稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落,即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法,即一个菌落代表一个单细胞。计数时,首先将待测样品制成均匀的系列稀释液,尽量使样品中的微生物细胞分散开,使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞),再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数,故又称活菌计数。一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。三、实验器材 1.活材料:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌剂。2.培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(附录三、1)3.器材:90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。四、实验方法 1.样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20 min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液;再用1ml无菌吸管,吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液(图22-1)。图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度。2.平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。 (1)混合平板培养法 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9[fo

  • 【分享】铸铁平板平台的修复之压砂

    【分享】铸铁平板平台的修复之压砂

    铸铁平板平台压砂前的预备工作:研磨方法 铸铁平板平台的研磨方法一般有两种:一种是三板互研法,这种方法压砂的结果是,三块平板平面度都很好,三块平板的压砂效果基本一样,并且三块平板都可以使用,不用常常压砂,但对修理技术要求较高。所谓三板互研法是指三块平板相互之间依次互研,并且每块平板只能当下板两遍,实际共研磨6遍。 另一种方法是两块板互研法,也叫子母板压法。这种方法是只用两块平板一上一下互研,用这种方法压砂结果是,两块平板的平面度基本吻合,上面平板的平面度凹,下板的平面度凸,并且下板的压砂效果要比上板的好。因为上板中间凹,不轻易修理量块,一般不用上板,只用下板。缺点是下板的突出程度不易把握,只能用一块平板。每次压砂时需要研磨3~4遍才可以完成,每遍6分钟左右。两种方法比拟较,本人经验觉得仍是前者较好。平板的选用 压砂前的预备工作很重要。首先选用什麽样的铸铁平板平台?采用那种压砂方法?选用什麽规格的砂子?心里应该清晰。修理量块的平板一般有灰铸铁、高磷球墨铸铁、高磷低金属球墨铸铁等三种。平板的硬度在HB (130~250)之间。采用硬度较低的平板压砂,嵌粗砂轻易,适合于粗研,修出的量块表面粗拙度比较低,表面发白。采用硬度较高的平板,嵌粗砂难题,轻易嵌入细砂,耐磨性不理想,修出量块的表面粗拙度高,光彩青亮。从我二十来年的工作经验看,采用硬度在HB(180~210)的平板,既压砂轻易,耐用,又合用于高精度的精密研磨,特别合用于量块修理。 金刚砂规格的选用 平板的压砂有两种方法:(1)从开始到结束只用一种规格的砂子,修理量块一般用M2.5规格的砂子.(2)压砂从开始到结束,砂子从粗到细循序渐进地压砂,一般选取M4,M3,M2.5规格的砂子。 研磨平板需要的辅料 (1)混合油:煤油和变压器油的比例3:1。 (2)硬脂。 (3)用汽油泡好的砂子即金刚砂。 平板恒温 修理室的温度很重要,太高或太低都不轻易嵌砂,一般温度在(20±5)°C。有的单位压砂房间恒温前提比较差,当平板从一温度拿到另一温度的房间研磨时,平板受热涨冷缩现象的影响,表面产生变形,故等温一段时间,一般平板在压砂前等温数小时或更长时间,待平板变形不乱后,再开始研磨。 平板的修整 对于新铸铁平板平台和表面划痕、碰伤较重的平板,先用油石打磨一下,打磨后,我们先用M4的砂子修一下板面,三块平板互相研磨,待推拉费力的时候,卸下平板,直到平板的平面度较好时,休止修理平板,做到冷暖自知。 对于使用中划痕、碰伤较轻的平板,只用油石把突起的部门打磨下去就行,不用修理平板,直接压砂就可以了铸铁平板平台的压砂 从我们多年来的工作经验看,选用(300×300)mm的平板,采用三板互研法压出来的平板修理量块最为相宜,由于它简朴易操纵,只用一种规格的砂子,不用多次换砂,并且压一次砂三块平板都可以使用。 首先我们把第一块平板放在工作台上,用汽油把平板擦干净。在铸铁平板平台上涂上少许硬脂,然后倒上用汽油泡好的M2.5的金刚砂(一吸管的量),等汽油挥发后,滴入 10滴混合油,把下板涂匀,再在上板的四角及中央处涂些,这样可以防止在压砂开始时,因为油膜厚度不均两板之间形成一个楔角,会泛起“啃”板现象。 前两次压砂所达到的推拉力和所用油量一样,后四次压砂滴入7~8滴混合油,推拉力达到750N左右,这时的推拉速度达每行程10秒左右。 每遍压砂大约需要20分钟左右。把握了以上压砂要领,就可以达到预期的效果。我们用这种方法得到的研磨平板用试块试,手感:⑴很柔和;⑵切削力很快。目测试块:切削痕迹平均即粗拙度好。这样的平板经久耐用,可以修理量块250~300块,我们一年只需要压砂3~4次,就可以保证全市各大企事业单位、计量站的量块修理量。

  • 【讨论】关于传统PZT和平板扫描器的讨论

    相信做AFM的都知道,传统的AFM都是用管状压电陶瓷做扫描器,有许多无法克服的缺点;但近些年有些厂家开始使用平板扫描器,在XY扫描上大大改观,希望大家使用过两种扫描器的多多讨论,各谈优点缺点,以长见识!

  • 清洗分流平板

    发现分流平板肉眼可见脏了,打算清洗下。按照步骤拿走衬管、拆调色谱柱头、保温套,1/2扳手拧螺丝——拧不动,换大哥拧——依然不动。有点慌,可以暴力拧吗?搜索有拧断的,请问怎么办?PS:感谢楼下各位,换了位大哥拧开了。中心有深色斑点,倒是倒不出来的,擦也擦不掉。超声能变浅一点

  • 分流平板螺母拧不动

    安捷伦8860[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]分流平板太脏,用1/2扳手拧不动。进样口加热到70度也拧不动。还有其他的办法吗?官方说,不行就上门服务。

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