乳抗生定仪

在人类征服病菌的道路上，可以说有2个转折点：６０多年前，当世界上第一个抗菌药物青霉素面市后，曾被誉为细菌的克星，当时正值二次世界大战，多少人的性命因此而被挽救。 但人类陶醉于对自然界的胜利没多久，就发现道高一尺，魔高一丈，细菌耐药产生的速度远远快于人类新药的开发速度，世界卫生组织的专家甚至担心：新生的、能抵抗所有药物的超级细菌，将把人类带回感染性疾病肆虐的年代。 细菌种类多、繁殖快、适应环境能力强，广泛分布于自然界，在水、土壤、空气、食物、人体和动物的体表、以及与外界相通的腔道中，都有各种细菌的存在。细菌在自然界的物质循环中起重要作用，不少细菌对人类有益，使人致病的细菌只是少数。 细菌为什么会耐药？其原因主要有三个：（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。如生物膜的形成。（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。 而其中β-内酰胺酶为耐药性的罪魁祸首，是80%耐药性产生的原因。β-内酰胺酶在上世纪五、六十年代被国外，特别是美国科学家广泛研究，直到1984年美国乳品科学协会第79届年会，威斯康辛大学研究人员报道了β-内酰胺酶分解牛奶中抗生素残留的研究，β-内酰胺酶开始被用于添加在牛奶中，以分解残留的青霉素。然而，由于各种超广谱β-内酰胺酶的发现，以及其对细菌耐药性造成的严重影响，很快这种添加在国外被禁止了。 我国对β-内酰胺酶的研究也很早就开始了，学者们也注意到了其导致耐药性的机理，但是同时由于国家政策要求牛乳中抗生素要求限量，各个乳制品厂商便顺水推舟，大打“无抗”牌，声称其乳制品中无抗生素残留，而造成“无抗”的原因便是“解抗剂”——β-内酰胺酶。 因青霉素超标而在牛乳中添加β-内酰胺酶分解残留的青霉素以通过残留检测，于是青霉素的使用则更肆无忌惮，而乳牛因大量接受青霉素治疗而耐药性进一步严重。如此的恶性循环，造成了各种耐药菌株的肆意传播，同时，由于β-内酰胺酶的超量添加，更有可能诱导了本无耐药机制的菌株产生耐药性。 耐药性已经对人们的生命安全造成了重大的影响，尤其是对于那些抵抗力较差的新生儿。根据1994～2004年对505例新生儿死因回顾分析，发现由于肺部感染而导致窒息或者并发症而死亡的新生儿占70%之多，而又有临床数据表明12年间新生儿致病菌株对青霉素的耐药率高达83.1％，也就是说平均每2个死亡的新生儿中便有1个是由于细菌耐药，无法治愈而亡，这是多么恐怖的数字啊。 基于上述事实，国家已经明令禁止销售各类“无抗奶”，一来是为了抵制虚假广告，二来也是为了防止各类β-内酰胺酶的传播以及扩散所造成的影响。因此，对于β-内酰胺酶的检测以及监控也将是近年来的热点话题之一。

一。 乳品中抗生素的检测中，需要检测的抗生素种类有哪些？二。 试剂盒法：试剂盒法基本上都是针对某一特定类型的抗生素筛选，是否需要几种试剂盒一起使用？三。 仪器检测法：现在有哪些检测方法？检测的品种都有哪些，是否可以满足国标的要求？期待坛友们的帮助，谢谢！！！

一、实验目的 掌握氯化三苯四氮唑(TTC)法测定牛乳中抗生素残留的原理和方法。 二、实验原理 本法以氯化三苯四氮唑(TTC)作为抗生素残留量测定的指示剂。当乳中加入嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)后，如果乳中不含抗生素，则嗜热链球菌生长繁殖，可将无色的氧化型TTC变为红色的还原型TTC，所以乳变红色。相反，如果乳中有抗生素存在，则嗜热链球菌不能生长繁殖或生长繁殖受到抑制，无色氧化型的1vrC不能转化成红色还原型的TTC，乳不变色。 三、仪器与试材 1．仪器与器材 恒温培养箱、恒温水浴锅等。 2．菌种 嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)。 3．试剂与溶液 TTC溶液(4％)：称取1g TTC，溶于5mL灭菌蒸馏水中，装入褐色无菌瓶内于4℃避光保存，临用时用无菌蒸馏水稀释5倍。如遇溶液变为黄色或淡褐色，则不能再用，需重新配制。 4．实验材料 2～3种鲜乳，各50mL。 四、实验步骤 1．菌液的制备 将菌种接种于灭菌脱脂乳(113℃无菌20rain)中，于(36±1)℃培养15h后，以灭菌脱脂乳1：1稀释，待用。 2．样品测定 (1)取鲜乳液样品9mL置于试管(18mm×180mm)中，80℃水浴加热5min，取出冷却至36℃。 (2)加入菌液1mL于乳液中，于(36±1)℃水浴培养2h后，再加0.3mL TTC溶液，(36±1)℃水浴培养30min后，观察颜色变化。 (3)如果样品变为红色，则表明抗生素残留为阴性；如果样品颜色不变，则应于水浴中保温继续培养30min后，观察，仍不变色者，则为阳性。 (4)在实验过程中，可以做阴性和阳性对照各一份。阳性对照管以8mL无抗生素的乳，添加1mL一定浓度的抗生素(如青霉素、庆大霉素)溶液、菌液和TTC溶液；阴性对照管为9mL无抗生素乳、菌液和TTC溶液。 3．结果报告 综合上述测定结果，并与对照管进行比较，分析样品中抗生素是否超标。 五、注意事项 1．嗜热乳酸链球菌菌种在脱脂乳培养基或在10％脱脂乳粉培养基中保存，并且不得含抗生素，每次转接间隔时间不能超过20d，否则可能会绝种。 2．在观察结果时，应该迅速并避免长时间光照。 3．TTC法对几种抗生素的检出限见表1。 表1 TTC法对几种卢一内酰胺类抗生素残留的检出限┏━━━━━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━━┓┃ 抗生素名称 ┃ 最低检出量／U ┃ 抗生素名称 ┃ 最低检出量／u ┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━━┫┃ 青霉素 ┃ 0．004 ┃ 庆大霉素 ┃ O．4 ┃┃ 链霉素 ┃ 0．5 ┃ 卡那霉素 ┃ 3 ┃┗━━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━━┛