深层活化仪

如今研究人员正越来越多的应用3D 细胞培养、微组织和类器官技术来填补2D 细胞培养与体内动物模型之间的差距。这是因为3D 模型能够更好地模拟微环境、细胞间相互作用和体内生物过程，因此相较于生化检测和2D 模型，3D 模型可提供更具生理相关性的条件。此外，其形态学和功能分化程度更高，这也赋予了它们更接近体内细胞的特征，并且从比体内动物模型具有更高的稳定性和可操作性，易于自动化，提高评估效率和准确性。然而，3D 类器官模型面临着诸多挑战，您需要合适的工具才能克服它们。比如在细胞显微成像分析环节，大而厚的细胞样品成像难度极高；同时处理3D 细胞实验产生的海量数据则是最为严峻的挑战——而3D 类器官深层智能高内涵成像分析系统结合近红外荧光探针整合方案，助您看的更深、更准、更快。国内外一线科学家团队典型案例多伦多大学David Andrews 教授团队利用患者活检肿瘤样本，建立PDC 模型，并通过高内涵Opera Phenix 对进行高通量图像采集。除分析常见的细胞活力指标，如细胞核形态、线粒体膜电位和凋亡之外，David Andrews 团队进一步利用机器自学习的优势来深度挖掘药物处理后的表型变化，利用对照药物，研究通过多指标分析定义多种表型，并以此为基础进行临床抗肿瘤药物的药效预测。通过分析药物处理后的PDC 细胞表型，不仅能预测针对特定病人的药物治疗有效性，还能挖掘药物对应的细胞表型，做到了细胞表型-药物相互作用的深度分析。图源：多伦多大学David Andrew 教授中国军事科学院王韫芳课题组，建立微肝球模型 (Liver biomatrices scaffolds, LBSs)，结合高内涵筛选系统Operetta CLS 和多功能酶标仪Ensight，从细胞活力、分化、代谢功能、环境相互作用和药效预测等多个指标上预测药物肝毒性机及其毒理机制研究。图源：中国军事科学院王韫芳教授高分辨率成像设计，助您看清三维每一处细节高内涵成像分析系统专为3D 类器官模型研究而设计，可协助您快速方便地从3D 样品中获取信息量丰富、更具生理相关性的数据：转盘共聚焦成像可快速采集光学切片图像，而且具有优异的信噪比和X-Y-Z 高分辨率。共聚焦转盘上的针孔只允许来自焦平面的光通过，而非焦平面的光信号被阻挡在针孔外，大大提升了获取图像的信噪比。在最小激发光强度下，以极高的帧速进行图像采集，因此转盘共聚焦成像是3D 球状细胞团和活样品成像的理想之选，不仅采集速度快，且光漂白效应极低。水浸式物镜的数值孔径比空气物镜更高，可捕捉到比空气物镜多高4 倍的光信号，因此可在X-Y-Z 方向都提供更高的分辨率。这意味着可以更快地捕捉到更多细节，并能对3D 深层结构进行成像，此外，对脆弱的活细胞样品进行成像时，可将光损伤将至最低。人肝脏微组织图像，类器官以 Hoechst（核，蓝色）和 CellMask™ Deep Red 质膜染料（红，细胞膜）3D 检测方法比传统的2D 检测方法更具挑战性，但这也正是研发过程中至关重要的一部分。其中一个挑战是如何从3D 细胞模型获取高质量图像。因为，诸如细胞核这类对象通常会沿着Z 轴变形，无法被正确分割。如本技术说明所述，当使用相同对象进行测试时，水浸式物镜能够显著改善3D 图像质量并检测到两倍于空气物镜的细胞核。红外荧光试剂，实时监测3D 肿瘤微环境红外 (NIR) 荧光试剂专为体内临床前成像设计。NIR 解决方案对于肿瘤学研究极有应用价值，同一肿瘤模型既可进行体外研究，也可通过异种移植物进行体内研究。靶向和可活化的NIR 试剂，最大激发波长低于700 nm，适用于多种基于高内涵类器官成像为基础的体外肿瘤模型。 为分析肿瘤相关生物标志物组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的活性并使低氧区可视化 ，分别使用 100 μM NIR 试剂ProSense® 680 (NEV10003)、MMPSense® 680 (NEV10126)和HypoxiSense® 680 (NEV11070) 对3D 肿瘤组织染色。ProSense 680 试剂（左）显示出对整个微组织的均匀染色。MMPSense 680 试剂（中）在单独的细胞中被强烈活化，并在3D 组织内显示出微弱的荧光信号。HypoxiSense 680 试剂（右）对微组织染色后，核心区域显示出最强荧光，指示肿瘤组织的缺氧状态。NIR探针染色人肿瘤类器官的明场和荧光图像叠加，生成特征性染色图样低氧在恶性肿瘤以及快速发展的肿瘤中是一种普遍的现象，肿瘤内部血液供应不足产生的低氧环境与肿瘤的生理过程息息相关，包括基因调控、血管形成、信号通路的转导等。对于低氧相关通路的研究也是肿瘤治疗的新方向。为了研究低氧条件，在球体形成过程中接种不同数量的细胞，从而产生不同大小的微组织，HypoxiSense 680 荧光探针可指示肿瘤微环境内的低氧状态。扫描下方二维码，即可购买珀金埃尔默荧光探针智能化图像分析，从3D到切片一网打尽Harmony 软件已开发出针对大型3D 高内涵数据集的3D 可视化和分析工具，能够对诸如囊肿、微组织或球状细胞团块等3D 对象进行容量分析。除了此处所示的形态和位置属性， Harmony 还可以计算其他的3D 形态、3D 强度和3D 纹理属性，以对3D 细胞模型进行详细的表型鉴定。此外，为了避免空图像等无用数据，Harmony 的 PreciScan 提供了低倍率的预扫描和高倍率的再扫描自动化工作流程，用于球状细胞团块的目标成像或其他小概率事件。配置Harmony 高内涵软件以及Preci-scan 智能目标扫描模块，该系统可以轻松获取低倍镜扫描结果，自动化智能识别微组织所在位置, 进行居中位置优化后，在高倍镜进行高分辨率X-Y-Z 成像数据采集。智能排除空白区域或不符合采集条件的破损组织区域。这一功极大的节约了采集和分析的效率，让您在单次扫描就可以自由获取不同倍数的多倍率数据信息，是类器官成像分析，稀有细胞事件采集分析的理想解决方案。到目前为止，由于仍无适用于3D 高内涵数据分析的软件，即使是高质量的3D 图像也很难从中提取信息。由于3D 图像分析软件包是为在传统显微镜上采集单个样品而开发，因此通常以单个分析包的形式提供。用这样的软件包处理这种基于微孔板的高内涵数据费时费力，需要大量的用户交互和额外的数据转换步骤。Harmony 软件是一款集3D 图像采集、3D 可视化和3D 分析为一体的单一软件包，省去了采集和分析之间的数据转换。总而言之，配备了水浸式物镜和Harmony 软件的Operetta CLS 高内涵分析系统能够克服3D 分析中最关键的挑战，并为更多生理相关细胞培养模型的3D 成像和3D 表型鉴定提供了理想的一体化软件包。另外高内涵都成像分析系统可兼容组织切片，获得多色全视野组织切片影像数据。凭借其强大的自动化成像光路设计和智能化的Harmony 分析软件，能在快速准确评估多色标记的免疫荧光组织切片，不仅提高了成像效率，同时也可对批量图像数据进行全自动智能化定量分析。图源：多伦多大学David Andrew 教授以上案例进一步证明，无论是针对患者来源的细胞、微器官和组织切片模型，高内涵成像分析系统都凭借其强大的人工智能分析能力，可更快速适应用户自定义的自动化智能化细胞/微器官/组织成像及全方位分析需求，以加速临床前基础研究，促进科研转化和精准用药指导。

双光子显微镜是对深层散射组织进行活体观测不可或缺的仪器，以其远超单光子显微成像的穿透深度而受到生命科学和医学研究的广泛关注。然而，传统双光子显微成像的点扫描成像模式从根本上限制了其成像通量与三维感知速度，极易受复杂活体成像环境干扰，同时激发点巨大的瞬时光强会对活体生物样本造成持续性的非线性光损伤，导致高速三维成像时长严重受限，极大地制约了病理学、免疫学和脑科学的发展。2023年5月12日，清华大学戴琼海、吴嘉敏、祁海作为共同通讯作者在 Cell 期刊发表了题为：Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue 的研究论文。该研究首次提出了基于空间约束的多角度衍射编码，实现非相干光孔径合成；建立了双光子合成孔径显微术（Two-photon synthetic aperture microscopy，2pSAM），“化点为针”，通过多角度针状光束的扫描在实现高速三维感知的同时，将双光子成像光毒性降低了1000倍以上；融合了戴琼海院士团队2021年同样在 Cell 上所提出的数字自适应光学架构，具备高速多区域像差矫正能力，即使在恶劣复杂活体环境下依然保持近衍射极限的空间分辨率，并进一步提升了传统双光子成像的穿透深度。基于此，2pSAM能够在哺乳动物深层散射组织中非侵入式地观测大范围亚细胞级动态变化，将毫秒级三维连续观测时长从数分钟提高到数十小时，为系统性地研究大规模细胞在不同生理与病理状态下的交互作用打开了大门。交叉研究团队利用2pSAM在小鼠活体观测到了一系列新现象，包括急性脑损伤后脑组织内周的多细胞互作，神经元在超长时程连续观测下展现出对视觉刺激的表征稳定性与功能多样性，以及首次完整高速记录下了小鼠免疫反应过程中淋巴结生发中心的形成过程，为病理学、脑科学和免疫学的研究打开了新窗口。传统双光子显微镜使用“点扫描”的方案对三维样本进行扫描，类似于共聚焦荧光显微镜，由于双光子成像的非线性效应使其能够获得数倍于单光子成像的穿透深度。例如，双光子显微镜在小鼠大脑皮层的最大穿透深度可以达到1 mm。然而，这种点扫描方式严重限制了双光子显微镜的三维成像速度与数据通量，并且由于在聚焦点位置极大的瞬时光强带来了非常严重的非线性光损伤隐患。2pSAM采用了轴向景深拓展的“针扫描”方案，通过改变针状光束的不同倾角实现样本三维信息的多角度投影，类似CT一样实现快速三维成像；同时，受到雷达成像中合成孔径方法的启发，通过在像面处引入针孔所带来的空间衍射编码约束，实现了非相干光的孔径合成，将多角度信息融合为大数值孔径对应的高空间分辨率；进一步利用样本的时空连续性先验，有效避免了视角扫描带来的时间分辨率损失。这样一种全新的计算双光子成像架构，在保留双光子本身深层组织穿透能力的同时，将有效成像通量提升了三个数量级以上。图1. 双光子合成孔径显微术（2pSAM）系统图除此之外，样本引起的光学像差给显微成像带来的分辨率与信噪比损失十分严重，随着成像深度的增加这种降质尤为明显。目前双光子成像中的硬件自适应光学技术主要面临着以下一些问题：1、成像系统复杂、成本高昂；2、有效校正视场有限，大视场多区域校正速度缓慢。2pSAM通过激发光编码获得了超精细的四维空间角度光场数据，能够使用数字自适应光学架构（DAO），无需在光学系统中增加额外的波前传感器或者空间调制器，就能实现信号采集与自适应像差校正的解耦，在后处理端完成大范围多区域自适应光学，显著提升在复杂成像环境中的空间分辨率与信噪比。图2. 双光子合成孔径显微术（2pSAM）结合数字自适应光学（DAO）与传统双光子显微镜（TPM）面对复杂成像条件下的结果对比。从左至右依次为：正常条件下拍摄，物镜校正环不匹配情况下拍摄，物镜为水镜且缺乏浸润水的情况下拍摄，物镜与样本之间增加散射胶带后进行拍摄长时间的激光照射会对活体样本产生严重的光毒性。研究团队发现，传统双光子显微成像由于使用飞秒激光激发与高NA会聚，在样本局部会产生巨大的瞬时光强，由此所产生的非线性光毒性在以往被极大地低估了，而一旦在长时程成像过程中，就会不断积累损伤从而影响细胞正常状态。与之对比，2pSAM化点为针，通过轴向景深拓展，在保持同样荧光激发效率的前提下，将瞬时峰值功率降低了1000倍，从而有效解决了非线性光损伤的问题。一方面能显著减少荧光探针的光漂白，对于同一类易淬灭染料，在同样激发光强下，传统双光子仅能拍摄几十个三维体，而2pSAM能够连续拍摄几十万个三维体而没有明显的信号衰减。除此之外，团队还对小鼠脑皮层中的小胶质细胞与脑损伤过程中的中性粒细胞进行了连续成像测试，发现即使使用较弱的光强，传统双光子显微成像在连续拍摄半小时以上时仍会导致大量细胞凋亡，而在2pSAM成像过程中细胞保持了正常的表型，并且相比于对照组结果无明显差异。团队通过一系列在体与离体实验充分证明了2pSAM能够将传统双光子成像的光毒性下降三个数量级以上，为长时程高速活体组织成像打开了新窗口。图3. 小鼠大脑急性开窗损伤后的皮层免疫细胞成像，TPM（左）与2pSAM（右）光漂白对比（GIF图)图4. 离体B细胞（GFP，蓝色通道）连续拍摄实验：使用PI标记细胞凋亡（红色通道），对比TPM（左）与2pSAM（右）的光毒性（GIF图）生发中心（Germinal center，GC）是次级淋巴器官中的动态组织区域，是被抗原激活后的B细胞在趋化作用引导下聚集形成的结构，也是产生高亲和力抗体及形成长期免疫记忆关键场所。但是由于GC形成的随机性和免疫细胞本身对光损伤的敏感性，完整的GC形成过程从未被高速长时间的清晰记录过。借助2pSAM，得以首次完整清晰地观测到了免疫反应下GC形成的全部过程。研究人员将带有荧光标记的抗原特异性B细胞回输到小鼠体内，随后将抗原接种到腹股沟附近以诱导引流淋巴结中生发中心的形成，并于免疫后90到110个小时内（生发中心未形成期），在大视场下持续地对淋巴结中抗原特异性B细胞的动态行为进行追踪，成功揭示了GC形成过程中B细胞的分裂增殖是GC形成的主因，辅助以周围活化B细胞的聚集。由于拍摄时长达十余小时，淋巴结本身会产生剧烈的形变，2pSAM通过多视角信息能够进行实时轴向聚焦位置反馈，实现自动对焦，有效避免了长时程拍摄过程中的样本漂移。 图5. 小鼠腹股沟淋巴结免疫反应后生发中心形成过程的完整观测和记录（GIF图）研究人员进一步借助2pSAM在患有创伤性大脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）的小鼠和正在接受视觉条纹刺激的GCaMP转基因小鼠进行脑皮层组织的细胞动态观测。在TBI小鼠受伤区域磨薄颅骨后观测到了外周免疫细胞中性粒细胞在浸润后与内周星形胶质细胞的相互作用，如通过直接接触定向产生迁移体（migrasome）来传递物质和信息。对GCaMP转基因小鼠开颅恢复2周后进行视觉上的条纹刺激，进一步证实了长达数小时内小鼠视觉皮层神经元钙信号对不同方向条纹选择性表达的持续性和稳定性，同时也通过长时程功能数据挖掘出了多种单细胞水平的神经响应类型，体现了神经元的功能多样性。这些现象对于传统双光子显微镜而言都极具挑战，特别是会由于光毒性本身导致会导致细胞异常表现，比如会导致神经元在长时程拍摄过程中响应强度不断下降。

p 　　国土资源部近日发布的一组数据显示，2015年全国202个地市级行政区的5118个地下水监测点中，较差级和极差级的水质监测点占比超过60%。这引发了民众对自来水质量安全的广泛担忧。 /p p 　　对此，专家在接受《经济日报》记者采访时表示，这些监测数据主要是指浅层地下水，而浅层地下水并非地下水饮用水的主要水源。目前，饮用水大多取自深层地下水，也即地表下1000米的地下水，水质整体良好，不易受到污染。 /p p 　　据了解，地下水占我国水资源总量的三分之一，全国657个城市中，400个以地下水为饮用水源。水利部今年1月《地下水动态月报》显示，浅层地下水中可直接饮用的仅占19.8%，其余80.2%都不适合人类饮用。为保证安全，目前地下水饮用水源主要取自深层地下水，而不是浅层地下水。 /p p 　　国土资源部发布的《国土资源公报》显示，2015年全国202个地市级行政区开展了地下水水质监测，监测点数为5118个。国土资源部部长姜大明此前也表示，我国地下水和氮污染和重金属污染较为严重，有机污染开始凸显。地下水污染呈现由浅向深、由点向面的发展趋势。 /p p 　　有关专家表示，为切实保护地下水水质，要进一步完善法律法规，对开发利用地下水采取更加谨慎的态度和更为严格的保护，严控各种污染源，并努力做到地下水“工业限用、农业慎用、主要饮用”，特别是深层承压地下水，原则上只作为应急和战略储备水源。 /p p br/ /p