外给定调节仪

捷报：7月26日，中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室与北京朝阳医院、澳大利亚昆士兰大学合作，利用全自动毛细管Western技术，研究调节性T细胞外泌体智能递送VEGF抗体用于眼底新生血管性疾病联合治疗发表在Nature Biomedical Engineering（IF：18.952）。研究背景年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变诱发的新生血管的形成是导致失明的两个主要原因，通常的治疗方案是使用靶向血管内皮生长因子(VEGF)的抗体（anti-VEGF antibodies (aV)）进行治疗。尽管治疗的早期阶段aV具有更高的有效性，但仍有50%–67.4%的aV治疗的老年性黄斑变性患者，在治疗2年后有视力恢复不佳等情况发生。在糖尿病视网膜病变中的患者中，对aV治疗的抵抗率（持续性黄斑增厚）也约为40%。这意味着aV在眼部新生血管病变中的药效不是很理想，或者还有其它致病因素如炎症等因素需要考量。有研究报道，与接受白内障手术的没有其它眼部病变的患者相比，脉络膜新生血管(CNV)或视网膜新生血管（RNV）的患者的房水中炎性细胞因子水平升高，且这些炎症标志物与眼部新生血管疾病中VEGF产生的增加呈正相关。因而，炎症不一定是新血管形成的结果，也有可能是驱动眼部新生血管形成的主要致病因素之一。而原有使用激素疗法来抗炎的案例又有不良反应发生，因此急需一种新型的联合给药方式（抗VEGF+抗炎）出现。研究内容中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室与北京朝阳医院等地的科学家，基于VEGF和炎症的协同活性促进眼部新生血管形成的机制，开发了一种针对抗VEGF和抗炎症的联合疗法。利用体内具有天然抗炎活性的Treg来源的外泌体（rEXS）为载体，通过基质金属蛋白酶（MMP）敏感肽段（cL）连接VEGF抗体（aV），创建了rEXS-cL-aV体系。当玻璃体腔注射后，利用rEXS向炎症部位的趋化性，携带aV富集于眼底新生血管病灶，随后利用病灶部位高表达的MMP酶解敏感肽段cL并释放aV。在上述时空耦合递送的基础上，分别利用rEXS的抑制炎症作用和aV的抑制血管生成作用实现协同增效。全自动毛细管Western技术鉴定调节性T细胞外泌体VEGF抗体递送系统（rEXS-cL-aV）CD9, CD47, ALIX, TSG101: 外泌体marker（鉴定外泌体）CCR6：趋化因子受体（通过炎症趋化因子的梯度增强纳米药物在新生血管病变中的积累）IL-10，CTLA-4：Treg免疫抑制蛋白（鉴定此外泌体是Treg来源）aV：VEGF（鉴定递送药物VEGF抗体）β-Tubulin：内参（蛋白定量归一化）此研究中鉴定调节性T细胞外泌体VEGF抗体递送系统（rEXS-cL-aV），利用了全自动毛细管Western技术。因常规制备方法获取外泌体样本效率不高，因此用传统Western技术会常常面临样本量不足，无蛋白表达的困境。全自动毛细管Western技术，只需3μL样本，不到3小时直接获得24个样本定量结果。且此过程除手动加样+试剂后，无需任何手动操作，数据稳定重现性佳，是微量或珍稀样本蛋白定量的不二之选。

华夏经纬网5月30日讯：据台湾媒体报道，淀粉违“法”添加工业用淀粉让人心不安，“毒淀粉”用语充斥更添民众恐慌 台“卫生署长”邱文达昨天定调，“属违法添加物”但未说明“毒不毒” “食管局长”康照洲也表示，迄今仍无一件被验出会造成人体立即伤害。　　据报道，为安定人心，台“行政院副院长”毛治国昨天接连召开专案会议及食品安全会报，会后毛治国说，将加速推动修正“食管法”，加重罚则及业者责任、刑责 “法务部”则研议，严惩化工原料厂任意将化学原料卖给食品制造厂。　　目前岛内化学物质管理分由“环保署”、“劳委会”等四部门负责，“行政院”表示，相关部门将整合建立登录、追溯系统，以加强管控 另外，“卫生署”应于两周内清除违规产品并严惩违规厂商，还给百姓干净安全的饮食环境。　　在会后，记者询问究竟是否属“毒”淀粉事件?邱文达表示，目前相关研究主要有三，但对猪、鼠都无伤，只有一研究指会伤狗的肾脏。　　康照洲解释，毒有两种定义，一是剧毒、小量就会有让人立即致命危险、具急毒性 工业用淀粉则属“低急毒性物质” 因此才使用欧盟标准计算，岛内民众在此范围之下不会造成立即危害。　　据悉，毒淀粉流窜，关键在暴利。据食品及化工业者指出，目前规定可添加在淀粉中增加口感的21种化学物质价格高，顺丁烯二酸的价格约只有三分之一，制成的毒淀粉售价比“合法”淀粉高。

为了进入有丝分裂，大多数粘附的动物细胞减少粘附，随后细胞变圆。有丝分裂细胞如何调节与邻近细胞和细胞外基质(ECM)蛋白的粘附目前学界尚不清楚。尽管在有丝分裂之前、之中和之后的粘附调节的重要性已经被很好地证明，但是对于有丝分裂细胞如何调节细胞ECM和细胞-细胞粘附的启动的见解还是有限的。此外，整合素和钙粘蛋白介导的粘附在有丝分裂进入和进展过程中的相互作用还不清楚。 为此苏黎世联邦理工学院生物系和德国马汀里德马克斯普朗克生物化学研究所分子医学部的研究人员在基因工程细胞系中使用基于原子力显微镜(AFM)的单细胞力谱(SCFS)方法来定量测量细胞-ECM和细胞-细胞间粘附力的大小，以了解细胞与ECM和邻近细胞的粘附力的启动和加强是如何被不同地调节的。实验显示，在有丝分裂细胞中，整合素没有通过踝蛋白和纽蛋白与细胞骨架连接，导致了细胞与ECM粘附增强作用减弱，而β1整合素和不同的粘附蛋白，包括纽蛋白、黏着斑蛋白和踝蛋白，增加了有丝分裂钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附。研究人员结合单细胞力谱和荧光显微镜来定量HeLa细胞的细胞周期依赖性粘附力。将表达MYH9-GFP和H2B-mCherry的单个圆形间期或有丝分裂HeLa细胞连接到伴刀豆球蛋白A (ConA)包被的AFM的悬臂上，使它们接近基质胶或牛血清白蛋白(BSA)包被的底物，并允许它们启动和加强粘附5-360秒的时间，然后将它们从基底上脱离以定量测量粘附力的大小(补充图1a)。作者通过共聚焦的方法观察到间期HeLa细胞使粘附位点成熟并稳定增加其铺展面积（图1b-e）。图1. 有丝分裂细胞显著降低了对ECM的粘附增强，并增加了对邻近细胞的粘附。a在给定的接触时间后，间期(左)或有丝分裂(右)HeLa细胞与基质或牛血清白蛋白的粘附力。点表示单个细胞的粘附力，红条表示中位数，n(细胞)表示至少三次独立实验中测试的独立细胞的数量。as值将附着力增强率表示为所有接触时间内通过附着力线性拟合的斜率(±SE)，并将as值与参考数据集进行比较的p值(补充图2a)。间期HeLa细胞对Matrigel的粘附力以灰色表示，与有丝分裂细胞比较。b,c在SCFS期间，表达paxillin- gfp的间期(b)或有丝分裂的stc (c) HeLa细胞(n = 7)粘附在Matrigel上的共聚焦显微镜图像的代表性时间序列。箭头显示paxillin-GFP簇。比例尺，20µ m。d表达paxillin- gfp的间期和有丝分裂stc HeLa细胞的接触时间依赖性和归一化扩散面积(±SEM) (n = 7个独立实验)。灰色区域表示间期和有丝分裂的stc HeLa细胞扩散面积有显著差异(P值补充表1)。e有丝分裂的stc HeLa细胞60min后对Matrigel的粘附力，360s后对Matrigel的粘附力作为灰色参考。描述的数据表示。 f接触时间120s时，间期(左)或有丝分裂stc(右)HeLa细胞与纯化ECM蛋白的粘附力。数据表示如a.间期HeLa细胞对各自ECM蛋白的粘附力以灰色参考给出。g在给定接触时间，两个间期(左)、间期和有丝分裂stc(中)或两个有丝分裂stc(右)HeLa细胞之间的粘附力。P值比较显示数据集和参考数据集的as值(补充图4a)。两个间期HeLa细胞之间的粘附力以灰色表示。数据表示如a.“MitoticSTC”所示，表明有丝分裂细胞通过STC富集(“方法”)。采用双尾Mann-Whitney检验计算给定数据与参考数据(a, d-g)比较的P值，采用双尾额外平方和f检验计算比较as值的P值。接下来为了测试有丝分裂HeLa细胞对ECM的粘附增强是否是由整合素细胞表面表达量的变化引起的，研究人员通过流式细胞术比较了间期和有丝分裂HeLa细胞表面的阿尔法V、贝塔1、阿尔法6和贝塔4整合素含量水平，有丝分裂的HeLa细胞显示出所有整合素的较高表达水平（图2a）。然后，研究人员还研究了钙粘蛋白表面表达的特征，发现与间期细胞相比，有丝分裂的HeLa细胞也表现出表面N-钙粘蛋白水平升高(图2d).接下来为了测试有丝分裂HeLa细胞对ECM的粘附增强是否是由整合素细胞表面表达量的变化引起的，研究人员通过流式细胞术比较了间期和有丝分裂HeLa细胞表面的阿尔法V、贝塔1、阿尔法6和贝塔4整合素含量水平，有丝分裂的HeLa细胞显示出所有整合素的较高表达水平（图2a）。然后，研究人员还研究了钙粘蛋白表面表达的特征，发现与间期细胞相比，有丝分裂的HeLa细胞也表现出表面N-钙粘蛋白水平升高(图2d).图2：a对间期和有丝分裂stc HeLa细胞进行整合素亚基荧光标记，并用流式细胞术进行分析。点表示每个样品分析的2万个细胞的中位荧光强度归一化到间期HeLa细胞样品中位荧光强度的平均值，条表示所有中位的平均值，误差条表示扫描电镜。N(样本)表示测试的生物独立样本的数量。b间期和有丝分裂stc HeLa细胞的流式细胞术，标记了扩展构象的整合素(克隆9EG7)。间期和有丝分裂stc HeLa细胞与Matrigel结合概率的数据表示。圆点表示单个HeLa细胞的结合概率，红条表示所有被测细胞的中位数结合概率，误差条表示扫描电镜。n(cells)表示探测HeLa细胞的数量，并采样每种情况下记录的力-距离的数量。d对间期和有丝分裂的stc HeLa细胞进行n -钙粘蛋白标记，并用流式细胞术进行分析。数据表示如a. e所述，间期或有丝分裂stc HeLa细胞与散布在底物上的单个间期细胞的结合概率。整个的研究实验数据揭示了整合素在有丝分裂细胞中的双重作用:刚结合配体的整合素不与肌动蛋白偶联，因此很难增强与ECM的粘附，而贝塔1整合素增强了有丝分裂细胞与邻近细胞的粘附，间期细胞利用黏着斑蛋白、踝蛋白和纽蛋白快速启动和加强整合素介导的细胞-ECM粘附。有丝分裂细胞增加了它们对邻近细胞的粘附力。这部分是由于钙粘蛋白的细胞表面含量水平增加了约20%以及钙粘蛋白结合率增加了两倍。有趣的是，我们还发现贝塔1整合素促进了与相邻间期或有丝分裂细胞的粘附的启动和加强。在实验中，没有在间期细胞或有丝分裂细胞的细胞表面检测到胶原、层粘连蛋白或纤连蛋白，这表明参与有丝分裂细胞的细胞间粘附的整合素不太可能与其他间期细胞或有丝分裂细胞的细胞表面上的ECM蛋白结合。然而，不能完全排除ECM蛋白参与有丝分裂细胞-细胞粘附实验。是否贝塔1整合素的贡献是通过直接结合E-和/或N-钙粘蛋白来实现的，如报道的胶原结合整合素，还有待探索。Mn2+或抗体对贝塔1整合素的外源性激活不会增加有丝分裂细胞间的粘附，这可能表明贝塔1整合素的功能与构象无关，或者整合素的激活不会增加其结合动力学。尽管在最初的360秒内，贝塔1整合素并不促进两个间期细胞间的粘附形成，但在融合的MDCK细胞单层中，无论细胞周期状态如何，贝塔1整合素都定位于细胞间的接触。总之，细胞在有丝分裂开始时减少细胞ECM粘附，导致细胞变圆，对整合素和粘附素蛋白的需求有限。与此同时，有丝分裂细胞通过激活钙粘蛋白和利用细胞间粘附位点增强与邻近细胞的粘附。这种细胞ECM和细胞-细胞粘附位点的复杂重塑确保了有丝分裂细胞的圆形化和组织完整性的维持。 该工作使用了Bruker旗下的JPK Nanowizard4三轴分立的闭环、全针尖扫描的生物型原子力显微镜。最新的JPK Nanowizard V系统还配备了Bruker专利技术的PeakForce Tapping可以不用考虑针尖的动力学而非常轻易的成像。且还有专门针尖细胞成像的定量成像模式（QI）可以同时得到样品的表面形貌和机械性能的Mapping图。文章信息如下，感兴趣的朋友可以自行下载阅读。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37760-x Bruker NanoWizardV 简介：https://www.bruker.com/de/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-nanowizard-v-bioscience.html