数显微熔定仪

2014年诺贝尔化学奖授予了荧光超分辨显微技术，利用荧光分子的化学开关特性（PALM/FPALM/STORM）或者物理的直接受激辐射现象（STED），实现超越衍射极限的超分辨成像。尽管如此，活细胞中的超分辨率成像仍然存在两个主要瓶颈：（1）超分辨率的光毒性限制了观察活细胞中精细生理过程；（2）受限于荧光分子单位时间内发出的光子数，时间和空间分辨率不可兼得。受限于这个瓶颈，为了在活细胞上达到60 nm空间分辨率极限，现有超分辨率成像手段需要强照明功率（kW~MW/mm2）、特殊荧光探针和长曝光时间（ 2 s）。强照明功率引起的强漂白会破坏真实荧光结构的完整性，长曝光时间在图像重构时导致运动伪影，降低有效分辨率。迄今为止，基于光学硬件或者荧光探针的改进无法进一步提升活细胞超分辨率的时空分辨率，实现毫秒尺度60 nm的时空分辨率成像。2021年11月16日，哈尔滨工业大学李浩宇教授团队与北京大学陈良怡教授团队合作在Nature Biotechnology上发表论文Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy【1】。他们另辟蹊径，发明基于新计算原理的荧光超分辨率显微成像，进一步拓展荧光显微镜的分辨率极限。通过提出“荧光图像的分辨率提高等价于图像的相对稀疏性增加”这个通用先验知识，结合之前提出的信号空时连续性先验知识【2】，他们发明了两步迭代解卷积算法，即稀疏解卷积（Sparse deconvolution）方法，突破现有荧光显微系统的光学硬件限制，首次实现通用计算荧光超分辨率成像。结合自主研发的超分辨率结构光（SIM）系统，实现目前活细胞光学成像中最高空间分辨率（60nm）下，速度最快（564Hz）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨成像。结合商业的转盘共聚焦结构光显微镜，实现四色、三维、长时间的活细胞超分辨成像。1、应用举例：DNA折纸标准样本验证为了在已知结构样本中验证分辨率的提升，研究者设计并合成了两个荧光标记位点的DNA折纸样本，每个位点用4~5个Cy5标记。当这些分子间距为60 nm、80 nm和100 nm时，它们在TIRF-SIM下几乎无法区分，但在经过稀疏解卷积重建后（Sparse-SIM，图1）可以很好地区分它们中间的距离。整体结果可以用单分子定位显微镜ROSE【3】交叉验证，与Sparse-SIM得到的DNA折纸的荧光对间距以及不同间距荧光对在玻片上的分布一致。图1：Sparse-SIM解析不同距离DNA折纸样本。（a）在相同视场下，用配对Cy5标记不同距离（60 nm, 80 nm, 100 nm, 120 nm）的DNA折纸样品，用TIRF（左）、TIRF-SIM（中）和Sparse-SIM（右）成像。（b）在TIRF、TIRF-SIM和Sparse-SIM下，黄色（60 nm）、蓝色（80 nm）(80 nm)、绿色（100 nm）和红色（120 nm）框包围的放大区域。比例尺：（a）2 μm；（b）100 nm。2、应用举例：Sparse-SIM超快活细胞成像揭示核孔结构和胰岛素囊泡早期融合孔道在活细胞成像中，稀疏结构光显微镜（Sparse-SIM）可以解析标记不同核孔蛋白（Nup35, Nup93, Nup98，或Nup107）的环状核孔结构，而它们在传统结构光显微镜（2D-SIM）下形状大小与100 nm荧光珠类似（图2c, 2d）。由于相机像素尺寸与孔径直径类似，测量的核孔拟合直径与Sparse-SIM的分辨率相当。校正后Nup35和Nup107孔的直径分别为~66 ± 3 nm和~97 ± 5 nm，而Nup98和Nup93直径大小处于这个范围中（图2e, 2f），结果与以前用其他超分辨成像方法在固定细胞中获得的直径相符【4】。有趣的是，12分钟超分辨成像可以显示活细胞中核孔形状变化，这可能反映了核膜上的单个核孔复合物动态重新定向到焦平面或远离焦平面（图2g），这是其他超分辨方法难以观察到的。图2：Sparse-SIM解析核孔蛋白动态过程。（c）用Sparse-SIM观察活COS-7细胞中以Nup98-GFP标记的动态环状核孔的典型例子，持续时间超过10分钟。上下区域分别显示2D-SIM和Sparse-SIM下的图像。（d）比较（c）中青色框中的核孔结构快照与100 nm荧光珠在不同重建方法（2D-SIM、20次RL解卷积后、50次RL解卷积后、Sparse-SIM）下的结果。（e）由于核孔的大小与Sparse-SIM的分辨率和像素大小相当，按照Supplementary Note 9.1的协议（详情请见文章），分别推导出Nup35-GFP（红色）、Nup98-GFP（黄色）、Nup93-GFP（绿色）和Nup107-GFP（青色）标记的核孔结构的实际直径。（f）Nup35（66 ± 3 nm, n=30）、Nup98（75 ± 6 nm, n=40）、Nup93（79 ± 4 nm, n = 40）、Nup107（97 ± 5nm ,n = 40）的平均直径环。左右两幅蒙太奇分别为传统Wiener重构或稀疏解卷积后的结果。（g）在6个时间点对 （c）中的品红色方框放大并显示。比例尺：（c）500 nm；（d, g, f）100 nm。通过滚动重建，Sparse-SIM的时间分辨率可达564 Hz，识别出来INS-1细胞中VAMP2-pHluorin标记的、更小的胰岛素囊泡融合孔道（如~61 nm孔径）。它们在囊泡融合的早期出现，孔径小（平均直径~87 nm），持续时间短（9.5 ms），不能被之前传统的TIRF-SIM所识别【2】。另一方面，鉴别出来的稳定融合孔在囊泡融合的后期出现，孔径大（平均直径~116 nm），持续时间长（47 ms），是之前看到的结构【2】。值得一提的是，虽然这里发现的囊泡早期融合孔状态很难被其他的超分辨率成像手段所直接验证，但是它们的发生频率与30多年前用快速冷冻蚀刻电子显微镜所观察到的“小的融合孔发生概率远低于大的融合孔”现象相吻合【6】。3、应用举例：稀疏解卷积是提升荧光显微镜分辨率的通用方法与当下热门的深度学习超分辨率显微重建不同，信号的空时连续性、高空间分辨率导致的荧光图像相对稀疏性这两个先验知识，是荧光显微成像的通用先验知识，不依赖于样本的形态以及特定的荧光显微镜种类。因此，稀疏解卷积是通用荧光显微计算超分辨率成像算法，可被广泛应用于提升其他荧光显微模态分辨率，观察不同种类细胞器的精细结构及动态（图3）。图3 | 稀疏解卷积广泛应用于提升不同显微成像模态空间分辨率，揭示各类细胞器精细结构动态。比如稀疏解卷积增强的商业超分辨转盘共焦结构光显微镜（SD-SIM）【7】，可以实现XY方向90纳米，Z方向250 纳米的空间分辨率，清晰记录分裂期7 μm深度内的全细胞内所有线粒体外膜网络（图4）。同样，若稀疏解卷积增强与商业SD-SIM结合，可以很容易实现活细胞上的三维、四色超分辨率成像。稀疏解卷积可以与膨胀显微镜（ExM）【8】结合，解析细胞膨胀后的复杂结构；也可以与宽场、点扫描的共聚焦、受激辐射损耗显微镜（STED）【9】以及微型化双光子显微镜（FHIRM-TPM 2.0）【10】结合，实现近两倍的空间分辨率提升。因此，稀疏解卷积的提出，将帮助使用各种各样荧光显微镜的生物医学研究者更好地分辨细胞中的精细动态结构。图4 | Sparse SD-SIM解析活细胞三维线粒体外膜网络。（k）活体COS-7细胞的线粒体外膜（Tom20-mCherry标记）的三维分布，颜色表征深度。（l）SD-SIM原始数据与Sparse SD-SIM的水平（左）和垂直（右）的白色框区域放大展示。比例尺：（k）5 μm；（l）1 μm。总之，通过稀疏解卷积算法（Sparse deconvolution）来实现计算荧光超分辨率成像，与目前基于特定物理原理或者特殊荧光探针的超分辨率方法都不相同。与超快结构光超分辨显微镜结合形成的Sparse-SIM是目前活细胞光学成像中，分辨率最高（60纳米）、速度最快（564帧/秒）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨光学显微成像手段。它也可以与现有的多数商业荧光显微镜结合，有效提升它们的空间分辨率，看到更清楚的精细结构动态。

近日，特殊光成像公司济南显微智能科技有限公司（以下简称显微智能）宣布完成数千万元人民币的Pre-A+轮融资，领投方为玲珑基金，十月资本跟投，本轮融资将继续用于公司新产品的研发注册及市场学术推广。显微智能成立于2017年，管理中心位于上海，并分别于杭州、长沙、济南设立了分管研发、生产和销售的职能中心，期间还获得山东省高新技术企业、山东省“专精特新”及湖南省高新技术企业认定。显微智能拥有全球领先的特殊光成像技术平台，其原研首创的皮摩尔级超高灵敏度图像探测器全球领先。目前，显微智能获得相关专利三十余项，其特殊光成像领域的相关专利检索量全球前三，并已形成两腺外科荧光导航设备、微创外科荧光导航设备和一次性手术耗材的产品布局，构造了“设备+耗材”的商业闭环。其中，甲状旁腺成像系统、三示踪荧光内窥镜系统等产品均为国内首创。显微智能也是国际范围内极少数可以掌握自体荧光成像技术并成功完成商业化的公司。2020年，显微智能曾获得鲁信创投的天使轮投资。2021年初，显微智能获得创投领投，正海投资等跟投的数千万元Pre-A轮融资。据悉，显微智能计划在今年7月启动A轮融资。显微智能创始人杨聪表示：“上半年公司在全国新冠疫情严峻复杂的形势下砥砺前行，如期获批三张二类注册证、实现了预期的经营目标并最终完成本轮融资，这离不开新老投资人对公司的鼎力支持与公司团队专业务实的工作态度，也离不开包括园区领导、医院专家在内的社会各界朋友对公司的关怀和帮助。随着国内疫情管控形势逐渐明朗，公司下半年也一定可以赓续前行，厚积薄发，逆风而上。”玲珑基金董事长张军表示：“特殊光成像技术是近年来医疗器械领域最具发展潜力的赛道之一，也是公司的重点关注方向。显微智能立足于特殊光成像技术的底层突破，目前已成功实现多款国内乃至国际领先产品的商业化，完成了甲乳外科、肝胆外科、胸外科等多科室产品布局，与逾百家三甲医院完成了学术及市场合作。疫情期间，公司依然如期完成多张核心产品的注册工作，并取得了符合预期的销售成果，这充分反映了公司团队不惧挑战的创业精神和优秀的业务能力。很荣幸能参与显微智能本轮融资，也希望能与公司携手共进，共同打造特殊光成像领域的领先品牌。”十月资本合伙人龚寒汀表示：“显微智能是国内特殊光成像领域尤其是自体荧光领域的优秀研发企业，基于在该领域深厚的技术积淀，公司已经形成了特点鲜明的产品管线，解决了相关手术操作过程中的痛点，提高了患者的术后生存质量。我们非常有幸能够参与显微智能本次融资，未来我们将一如既往的支持企业利用核心技术开发出更多满足临床需求的创新产品。”

佳航仪器东北负责人刘经理于2019年12月20日参加“2019东北仪器信息港年终峰会”，并将佳航显微熔点仪捐赠给主办方用于义拍，义拍所得善款全部捐赠给贫困小学。最终显微熔点仪为东北师范大学所得。此款显微熔点仪外形小巧精致，且拥有一次测试三个样品，升温速率可任意设定等优点，为用户提供准确、稳定、可靠的测试结果，还为用户带来高效便捷的测试感受。固广泛应用于教学和日常分析等领域。佳航仪器始终致力于食品，药品分析测试领域的创新，推动"绿色食品"和"健康药品"，研发生产分析和测量类仪器，旨在为用户提供高质量仪器的同时，还用户提供通俗易懂的实验室解决方案。佳航仪器还坚持为学校培养人才提供大力度的优惠。感谢主办方的邀请，由于疫情原因，公司停产停工将近3个月，显微熔点仪于2020年4月才发出，我们深表歉意。佳航将保持初心继续努力研发出更好更优的仪器回馈社会,并将与同行们共同努力让国产仪器走出国门，走向世界。