自由基测试仪

自由基在化学反应中有着重要的作用，如何测试自由基，是本次培训的主要内容。包括（1）测试自由基需要注意的问题；（2）使用的电子顺磁共振波谱仪测试自由基的八个实验参数；（3）进口和国产电子顺磁共振波谱仪测试

楼主最近刚收到审稿意见，审稿人说：Moreover, the EPR signals should be normalized using an internal standard (e.g. Mn2+).请问各位大佬，测试羟基自由基（目前测试就是50uL待测液体加5uL DMPO）如何加内标法，这种方法科学吗，锰离子在这种测试条件下出峰吗

先说说什么是自旋捕获吧，EPR是一种波谱学仪器，它是检测未成对电子的一种波谱学方法，自由基即是带有未成对电子的体系。但是既然是仪器，就有其特定的检测限，这个限一个限在样品量，另一个就是时间。样品量的限度不同型号有不同的最低检测限，Bruker的通常在10的9次方量级，基本上可达nMol量级吧，但是这个量级是样品中同一时刻（即检测时刻）的未成对电子量。而检测时间，对于扫场实验来说，一般是在分钟量级，即样品中的未成对电子的寿命起码要在分钟量级。问题就来了，很多氧化性很强的自由基，比如羟基、超氧、碳中心自由基等，它们化学性质都非常活泼，所以同一时刻的寿命会非常短，分钟量级的时间检测限，根本测不到它们的信号。为了实现检测，人们找到了一种自旋捕获剂的化学分子，它们会与这些寿命短的自由基结合，生成一种寿命较长的自旋加合物（spin adduct),加合物的寿命通常在10分钟到2小时不等。[img]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/X8l5lSW5ibxauQAJolLvrTHWBPWDdcibFqh1nPPibMGhTeIm9TXLGicLAhRZRYfibBwtlygwEnURNSyqsOMdhLcT16g/640?wx_fmt=png&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1[/img]商用捕获剂通常有几种，最常见的是PBN和DMPO，PBN由于其自旋加合物谱图没有特异性，因此多用来定量，但是其耐高温，可以接受一定程度的光照。与之对应的DMPO，其谱图具有很好的特异性，因此多用来定性和定量，但是DMPO不能承受高温，有个别用户研究发现，其UV光照也易分解。这两种捕获剂呢都可以从很多商业平台购买，但是通常买来的是纯的（DMPO一般在两千多1ml吧），不纯的会便宜很多，但是需要用户自行再提纯一次。通常一个捕获剂分子能捕获一个分子的自由基基团，不能重复利用，因此需要用户自行对自己体系中可能产生的自由基量进行估计，然后DMPO的加入量需要在自由基量的50-100倍的浓度（以防漏掉一些自由基，以及考虑到反应效率的问题）。新购置的DMPO，用户可以根据自己平时需要的浓度进行初步的稀释，稀释之后平均分成10份或20份，然后每一小份进行除氧处理，之后密封好放入-20摄氏度的冰箱中保存。每次实验使用时，拿出一小份，一次用完，如果用不完，没有污染的情况下，可以考虑再次除氧之后密封保存（建议是小份的量可以做到一次用完，接触氧之后，容易变质，不易再长期保存）。然后先把样品反应物中的一样处理好，之后加入DMPO，再然后加入第二反应物。即有一个要点：在反应开始之前把DMPO加入！至于DMPO的浓度，需要根据不同的反应，评估生成自由基的量，再根据这个量评估DMPO需要加入的量。加入第二反应物之后，尽快取样，进行EPR测量！通常用仪器默认的参数即可测到这些捕获后的自旋加合物的信号，如果一时测不到，可以考虑二维时间实验，等待一段时间，即给体系一些反应时间，让DMPO与自由基充分反应，累积一定的加合物的量之后再进行EPR检测。当然，如果不放心就做二维实验，一般都不会有太大的问题。得到初始信号之后，再进行EPR实验参数优化，调整功率及调制幅度，达到最优，不过，一般文献中DMPO-羟基都是用10dB，即20mW.关于参数优化，将会在EPR实验中再详细讲述。