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用酶联免疫试剂盒检测黄曲霉毒素时,试剂盒里面的酶标记物有沉淀,是什么原因?
地沟油快速筛查试剂盒亮相 最快10多分钟出结果:这个实验原理是“地沟油”与食用油相比,其经过反复煎炸或高温加热等会产生一些物质,即便精炼也难以被取出,被称为“极性标记物”。通过检测“极性标志物”的多少,可以作为判定是否为“地沟油”的重要指标。该极性标志物可与极性检测试剂反应显红色,该极性标志物含量越高则红色越深,红色深度超过临界值则为阳性
[font=宋体]抗体是生物体内重要的免疫分子,它们能够识别并攻击外部入侵者,如病毒和细菌。在医学、生物学和免疫学等领域,抗体标记与检测技术广泛应用于疾病诊断、治疗监测、药物研发等方面。本文将详细介绍[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation][b]抗体标记[/b][/url]与检测的种类和方法,包括直接标记、间接标记、免疫荧光、酶联免疫吸附试验等。通过对这些技术的了解和应用,我们可以更好地利用抗体进行疾病诊断和治疗监测,提高医疗水平和治疗效果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]抗体与标记物[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体广泛应用于多种免疫分析中,用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗([/font][font=Calibri]primary antibody[/font][font=宋体]),赋予检测的特异性。同时,在检测中还需加入标记物(详见后文“间接标记法 [/font][font=Calibri]Vs.[/font][font=宋体]直接标记法”),标记物的加入赋予可检测性。表[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]中列出了一些常用的免疫分析技术,及可能使用到的标记物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][b][font=微软雅黑]免疫分析方法[/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑]标记物[/font][/b][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]免疫印迹[/font][font=微软雅黑](WB)[/font][/font][/td][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]酶[/font][font=微软雅黑](通常为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP)[/font][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]酶联免疫吸附试验[/font][font=微软雅黑](ELISA)[/font][/font][/td][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]酶、生物素[/font][font=微软雅黑]/链亲和素[/font][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]免疫荧光[/font][font=微软雅黑](Immunofluorescence)[/font][/font][/td][td][font=微软雅黑]荧光染料[/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]免疫组化[/font][font=微软雅黑](Immunohistochemistry)[/font][/font][/td][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]酶、生物素[/font][font=微软雅黑]/链亲和素[/font][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]流式细胞术[/font][font=微软雅黑](Flow Cytometry)[/font][/font][/td][td][font=微软雅黑]荧光蛋白或染料、串联染料[/font][/td][/tr][/table][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]直接检测法 [/font][font=Calibri]Vs.[/font][font=宋体]间接检测法[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]检测技术可分为两大类:直接法和间接法。对于直接检测法,标记物通过共价键连接到一抗上。而对于间接检测法,标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在间接法中,检测由两个部分组成:第一步,用未标记的一抗进行孵育(通常[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]小时),[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]若存在抗原[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]部分抗体与抗原结合,未结合的抗体则通过洗涤去掉,然后加入标记二抗。再次孵育(通常[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]小时),洗涤去掉未结合的二抗。然后对结合在抗体上的标记物进行量化。若有抗原存在时,标记物通常导致有色物质的生成或某一个波长的发射光量增加。当无抗原存在时,则无一抗的结合,也无二抗试剂的结合,因此无信号产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在直接法中,标记物直接与一抗共价结合,因此仅需一轮孵育及洗涤步骤,而间接法则需要两轮孵育及洗涤步骤。直接法简化了试验的流程,但检测的灵活性降低。下表列举出了直接法[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]间接法的主要利弊。[/font][/font][table][tr][td][b][font=微软雅黑]方法[/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑]优点[/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑]缺点[/font][/b][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑]直接法[/font][/td][td][font=微软雅黑]仅需使用一抗,检测快速[/font][font=微软雅黑][/font][font=微软雅黑]无二抗的非特异性结合[/font][/td][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]由于标记可能导致一抗的免疫反应性降低[/font][font=微软雅黑] [/font][/font][font=微软雅黑][/font][font=微软雅黑]信号放大作用较弱[/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑]间接法[/font][/td][td][font=微软雅黑]一抗含有多个标记,二抗可结合的表位,因而灵敏度升高,信号放大作用较强。[/font][/td][td][font=微软雅黑][font=微软雅黑]二抗可能发生非特异性结合[/font][font=微软雅黑] [/font][/font][font=微软雅黑][/font][font=微软雅黑]孵育及洗涤步骤增多[/font][/td][/tr][/table][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]尽管直接标记法具有诸多潜在的优点,但为何如今众多的免疫分析仍采用间接法原理呢[/font][font=Calibri]?[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]无疑,最主要的原因就是直接标记一抗相对较复杂,确实从历来经验看,抗体标记都是由那些具有化学修饰技术的专业人员来完成的。在间接法中二抗试剂所起的信号放大效应究竟如何呢?是否直接标记法所产生的信号就很弱?其实在很多情况下,间接法的放大效应是让人产生错觉的。在与二抗试剂的孵育过程及洗涤过程中,一些一抗会与抗原发生解离,因此真正被放大的只是逐渐减少的一抗的量。其实在很多情况下,直接法也可获得与间接法相同甚至更好的结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]常见的抗体标记方法[/font][/b][/font][font=宋体]和所有蛋白质一样,抗体也是由氨基酸组成的。理论上,通过大多数氨基酸可以实现生物偶联。以下内容介绍了几种基于赖氨酸残基的抗体偶联和标记技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体](琥珀酰亚胺)酯法[/font][/font][font=宋体]应用广泛的荧光染料(如罗丹明衍生物)是采用这种方法对抗体进行偶联。通常在磷酸盐缓冲液中进行,随后与未标记的染料在柱上进行分离。该方法的主要缺点是,由于酯类对水分敏感,酯类的稳定性差。因此,反应结束后,标记抗体应立即使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]吉妥珠单抗([/font][font=Calibri]Gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg[/font][font=宋体])是全球范围内首个获批上市的抗体偶联药物([/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体])。半合成的卡奇霉素衍生物具有[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]酯,以便将卡奇霉素与人源化[/font][font=Calibri]IgG4[/font][font=宋体]的赖氨酸残基偶联。然而,由于患者的临床获益不足,[/font][font=Calibri]Mylotarg[/font][font=宋体]已于[/font][font=Calibri]2010[/font][font=宋体]年退市。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②异硫氰酸盐法[/font][font=宋体][font=宋体]这种方法主要用于异硫氰酸荧光素([/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体])染料的偶联,广泛用于荧光标记蛋白和抗体的制备。异硫氰酸盐比[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]更稳定,但也更难制备,而且利用该方法,标记的反应效率可能会降低。与[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]法一样,应在反应结束后通过层析法去除多余染料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③碳二亚胺法[/font][font=宋体][font=宋体]碳二亚胺衍生化合物将蛋白质上的羧基转换为反应中间体,可与赖氨酸发生反应。碳二亚胺的高反应性意味着它们可用于使用相对惰性的材料(如磁性或金颗粒)标记抗体。最常用的碳二亚胺为[/font][font=Calibri]EDC[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]有时可被添加至反应中,以辅助产生相对稳定的中间体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]该方法操作简单,但与[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]一样,[/font][font=Calibri]EDS[/font][font=宋体]具有吸水性,因此,标记后抗体需立即使用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④高碘酸盐法[/font][font=宋体][font=宋体]这种方法可用于制备特异性的[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]标记抗体。高碘酸盐通过产生与赖氨酸残基相互作用的醛分子来激活[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]本身只有少量的赖氨酸残基,因此酶聚合的影响不大。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]和抗体之间的键是可逆的,可通过添加氰基硼氢化钠使其保持稳定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation[/font][/font]