蛋白纯度检测

摘要：介绍了玉米种子盐溶蛋白电泳鉴定真伪及纯度的操作技术, 并对该方法在实际应用中应参照的国标及存在的问题进行了分析和探讨。关键词玉米 电泳 品种纯度 操作技术

重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白，是由人干扰素α2b和人血清白蛋白2种编码基因通过基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌，通过诱导表达产生的胞外分泌蛋白。干扰素类重组蛋白药品是目前临床上广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等顽症的有效药物。2015年版《中华人民共和国药典》对重组蛋白制品的纯度要求为不低于95.0%。本篇应用中，作者采用了离子交换色谱柱TSKgel Q-STAT建立了测定重组人血清白蛋白干扰素α2b 融合蛋白药物纯度的方法，经验证该方法适合 rIFNα2b-HSA纯度检测。

促胰岛素分泌肽( Exendin-4) 是一种来源于美洲希拉毒蜥唾液中的含39个氨基酸的多肽，其作用机制与GLP-1类似，能够促进胰岛素的分泌、增加胰岛素敏感性、改善胰岛细胞功能。促胰岛素分泌肽融合蛋白( Exendin-4-Fc fusion protein，简称E4F4) 是将促胰岛素分泌肽( Exendin-4)与人IgG的Fc片段相连重新构建的结构蛋白，可在不影响药效的同时延长了药物的体内半衰期，有效改善Exendin-4 在机体内的药物代谢动力学特性。文献中采用了尺寸排阻色谱柱TSKgel G2000SWXL色谱柱（I.D. 7.8 mm× 30 cm）建立了促胰岛素分泌肽融合蛋白纯度测定方法，经验证该方法适合E4F4纯度检测。

尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。 完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS) 技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱 (SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

免疫球蛋白G，即抗体，是免疫系统用来识别和中和病原菌和病毒等异物的Y型大蛋白，在生物学上十分重要。Protein G可以结合哺乳动物IgG，与其蛋白结构上的Fc片段进行特异性识别。因此可以选用月旭Welchrom? Protein G Tanrose 4FF(5mL，00081-12012)来分离纯化牛初乳粉中的IgG蛋白、Welchrom? BC-10重力柱(8.3mL，00051-32022)提高纯度，并采用月旭Xtimate? SEC-300（7.8*300mm，5um）进行色谱检测分析实验结果。

本应用简报介绍了如何像生物分析科学家在典型生物药理学环境下进行纯度分析那样，使用 Agilent Easy Access 软件来分析模式治疗性蛋白的批次间纯度。分析模式治疗性蛋白的批次间纯度时，将 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统与 Agilent 6530 精确质量Q-TOF LC/MS 联用，并通过 Agilent Easy Access 软件进行数据分析。LC/MS 平台拥有卓越的色谱分离度和质量精度，结合强大的数据处理能力，可简便、快速地分析批次间的蛋白纯度。本应用简化了工作流程，使用者可以快速做出决策，以作进一步的下游处理。该软件可用于比较蛋白谱图，从而确保监管机构要求的批次一致性。此外，该软件还有助于了解工艺放大或生产过程中纯化后蛋白的杂质谱图。该数据可帮助开发生物仿制药的公司在产品上市前评估其产品与原始药物的相似度，重要性不言而喻。

静态光散射与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体（mAbs）的纯度检验或下游纯化的快速检测方面来说是一项重要手段。光散射也是在荧光检测之外蛋白多聚体的最敏感检测方法之一。

为了确定蛋白质样品的纯度和均一性，提出了两种基于毛细管的方法-毛细管凝胶电泳（CGE）和毛细管等电聚焦（CIEF）。前者在分子量不同的蛋白质被分解时应用。后者适用于几乎相同的分子量，但不同的净电荷的蛋白质异构体。

人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)抗原、生物素化的人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)检测试剂盒人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)抗原、生物素化的人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)检测试剂盒人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)抗原、生物素化的人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人低密度脂蛋白(LDL)检测试剂盒人低密度脂蛋白(LDL)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人低密度脂蛋白(LDL)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人低密度脂蛋白(LDL)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人低密度脂蛋白(LDL)抗原、生物素化的人低密度脂蛋白(LDL)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人低密度脂蛋白(LDL)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

乙醇梭菌蛋白是用乙醇梭菌作为发酵菌种，利用含有一氧化碳的工业尾气和氨水为主要原料进行液态发酵、离心分离浓缩、喷雾干燥，人工合成的一种新型单细胞蛋白产品。乙醇梭菌蛋白饲料不仅蛋白质含量高，营养丰富，并且氨基酸结构平衡，易于动物消化，同时还具有优异的饲料蛋白质原料加工特性，富含核苷酸等功能性物质，有利于动物肠道与肝脏的健康。本实验参照《GB/T 24318 杜马斯燃烧法测定饲料原料中总氮含量及粗蛋白质的计算》使用杜马斯定氮仪对乙醇梭菌蛋白的粗蛋白含量进行测定。

人胆固醇酯转移蛋白(CETP)检测试剂盒人胆固醇酯转移蛋白(CETP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人胆固醇酯转移蛋白(CETP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人胆固醇酯转移蛋白(CETP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人胆固醇酯转移蛋白(CETP)抗原、生物素化的人胆固醇酯转移蛋白(CETP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胆固醇酯转移蛋白(CETP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂盒人视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人视黄醇结合蛋白(RBP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人视黄醇结合蛋白(RBP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人视黄醇结合蛋白(RBP)抗原、生物素化的人视黄醇结合蛋白(RBP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人视黄醇结合蛋白(RBP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人细胞毒素相关蛋白A(CagA)检测试剂盒人细胞毒素相关蛋白A(CagA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人细胞毒素相关蛋白A(CagA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人细胞毒素相关蛋白A(CagA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人细胞毒素相关蛋白A(CagA)抗原、生物素化的人细胞毒素相关蛋白A(CagA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人细胞毒素相关蛋白A(CagA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人低密度脂蛋白受体(LDLR)检测试剂盒人低密度脂蛋白受体(LDLR)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人低密度脂蛋白受体(LDLR)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人低密度脂蛋白受体(LDLR)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人低密度脂蛋白受体(LDLR)抗原、生物素化的人低密度脂蛋白受体(LDLR)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人低密度脂蛋白受体(LDLR)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人高密度脂蛋白(HDL)检测试剂盒人高密度脂蛋白(HDL)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人高密度脂蛋白(HDL)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人高密度脂蛋白(HDL)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人高密度脂蛋白(HDL)抗原、生物素化的人高密度脂蛋白(HDL)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人高密度脂蛋白(HDL)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

大豆有很高的营养价值，其中含有丰富的蛋白质。豆油是一种最重要的食油，榨出油后剩下的豆饼或豆粉就是生产大豆蛋白的原料。从植物中制成的蛋白质可以补充动物性蛋白质的不足。大豆、花生、向日葵的籽和叶、饲料作物、土豆块径等能加工为蛋白质粉，加工时涉及到的主要过程是萃取和喷雾干燥。根据加工方法不同，从大豆粉中可以制造离析蛋白质（蛋白质含量高达92%）和浓缩蛋白质（蛋白质含量为60%~70%）两种产品。

使用MST技术检测跨膜蛋白TRKB与脑胆固醇和抗抑郁药物的结合。其中跨膜蛋白TRKB并未纯化，直接将过表达GFP-TRKB的HEK293T细胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作为荧光信号源，进行MST检测。

人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)检测试剂盒人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)抗原、生物素化的人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)检测试剂盒人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)抗原、生物素化的人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAb)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

门冬酰胺（C4H8N2O3）属于一种水合物，属于氨基酸类药物，在临床上主要应用门冬酰胺治疗肝脏疾病，比如肝硬化、肝硬化腹水、肝性脑病、血氨升高、胆红素升高、血清蛋白降低、血清丙氨酸氨基转移酶升高等病症，或者是进行保肝治疗。本实验参照《中国药典》使用凯氏定氮法对门冬酰胺中的氮含量进行测定，从而计算其纯度。

人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)检测试剂盒人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)抗原、生物素化的人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

蛋白质的产率和纯度是衡量纯化是否成功的重要指标。除有效的色谱分离外，配置良好、可靠的仪器也能影响纯化的成功。制备型反相(RP)液相色谱由于具有高分离能力，经常被用做多肽和小分子亲水蛋白纯化流程的最后一步。虽然大家都知道反相液相色谱所用的溶剂条件会使蛋白结构变性，但也能通过调节适当的条件再使其复性，特别是小分子蛋白。Agilent 1100系列纯化系统是设计良好、合适的反相色谱的系统。

涉及聚集的蛋白质变性过程是阻碍稳定蛋白质药物制剂开发的因素之一。使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定这些蛋白质的纯度和聚集体是一种相对简单的技术。定期校准 SEC 方法可确保更好的重现性，从而提高准确性，还可及早发现样品及批次中的潜在问题。本简报将 Agilent AdvanceBio SEC 120 Å 1.9 μ m 色谱柱与其他供应商的亚 2 μ m 填料色谱柱进行了比较。对重组人生长激素 (hGH)、人粒细胞集落刺激因子 (hG-CSF) 以及干扰素 α -2b (INF α -2b) 蛋白的分析结果表明，AdvanceBio 色谱柱在小分子蛋白质治疗药物应用方面具有卓越性能。

1 前言乳清蛋白质粉是以乳清为原料，不经脱盐，经干燥制成的粉末状产品，它以其纯度高、吸收率高、氨基酸组成最合理等诸多优势被推为“蛋白之王”。能够为人体提供必需的蛋白质营养；维持皮肤和组织器官的正常；避免一些摄入动物蛋白引起的危害。参照《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》标准方法测定乳清蛋白粉中的粗蛋白含量。

人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)检测试剂盒人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)抗原、生物素化的人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)检测试剂盒人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)抗原、生物素化的人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人血白蛋白是由健康人血浆，经过低温乙醇蛋白质分离法或经批准的其他分离法分离纯化，并经60℃10小时加温灭活病毒后制成。其中蛋白质含量是其需要检定的指标之一。本实验参照《GB 5009.5 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》使用杜马斯定氮仪对人血白蛋白中的蛋白含量进行测定。