血浆蛋白检测

【作者】 阎雪莹； 高宏伟； 唐晓飞； 刁磊； 匡海学；【机构】 黑龙江中医药大学； 黑龙江省哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心； 吉林农业科技学院；【摘要】 目的:建立大鼠血浆中胡黄连苦苷Ⅱ的HPLC-UV测定方法,研究在大鼠体内的药代动力学特征,同时测定其血浆蛋白结合率。方法:血浆样品经简单的甲醇沉淀蛋白后,上清液直接进样测定。采用Diamonsil(钻石)C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)流动相为甲醇-水-醋酸(38:62:0.2),检测波长267nm,流速1mL.min-1,采用3p97药动学软件对药时数据进行拟合。结果:大鼠尾静脉注射胡黄连苦苷Ⅱ符合二室开放模型。结论:胡黄连苦苷Ⅱ在大鼠体内分布代谢很快,消除较快。 更多还原【关键词】 胡黄连苦苷Ⅱ； 药代动力学； 血浆蛋白结合率； 【基金】 国家自然科学基金项目资助(30600804)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208071031_382128_2352694_3.jpg

今天去给客户安装了液相色谱仪，客户主要用它来检测血浆蛋白粉中免疫球蛋白G的含量，对于液相色谱仪安装已经有一些小小经验，所以仪器送到之后很快的我们就把仪器安装好了，仪器安装好之后呢肯定是要调试和验收的，验收中的安装已经完成，接下来我们运行确认和性能确认，既然要检测血清蛋白，那我们就通过检测它来完成后面的任务吧。首先我们完成运行确认，准备我们实验需要的流动相，流动相A：称取5．6765g磷酸氢二钠和4．6478g磷酸二氢钾至1000mL容量瓶中，加水定容至l000 mL，配制成pH-6.5，浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液。流动相B：称取甘氨酸3．7535g与1000mL容量瓶中，加入800 mL水溶解，再加入4．75 mL6 mol/L的盐酸，用水定容至1000 mL，配制成pH-2.5,浓度为0.05 mol/L的甘氨酸盐酸缓冲液。[img=,255,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060953502175_13_3763765_3.jpg!w690x920.jpg[/img] [img=,248,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060945498254_8247_3763765_3.jpg!w690x945.jpg[/img] 将两种流动相经过过滤和脱气处理后，连接到我们的输液泵上，输液泵在第一次使用时要打开排液阀，将注射器安装到废液口，用注射器进行手动吸液当衍生试剂进入注射器内，观察并确定进液管内无明显气泡后关闭排气阀，换上废液管后开始运行输液泵。此时必须要确定泵腔内有液体且无气泡才可以运行泵，否则运行泵时会损坏泵头。两个泵都要经过此操作后才可以开始运行。打开我们的泵，查看机器是否可以顺利通过自检，检测泵的流速和流动相混合比例的准确度。随后打开检测器和工作站，我们用的色谱柱是HiTrap[sup]TM [/sup] Protein G HP柱，1mL。设置好实验所需参数：流动相梯度洗脱程序[table][tr][td][align=center]时间(min)[/align][/td][td][align=center]流速(mL/min) )[/align][/td][td][align=center]流动相A(%)[/align][/td][td][align=center]流动相B(%)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4.5[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5.5[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]15.0[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]15.5[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]22.0[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]100 0[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][/table]检测波 长280nm。让流动相冲洗整个系统，查看基线，等待基线平稳。[img=,306,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060949079532_4842_3763765_3.jpg!w690x765.jpg[/img] [img=,316,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060949585645_8170_3763765_3.jpg!w690x742.jpg[/img] [img=,268,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060957536288_7365_3763765_3.jpg!w690x874.jpg[/img][img=,321,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060944094564_753_3763765_3.jpg!w690x730.jpg[/img] [img=,285,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060944599785_6578_3763765_3.jpg!w690x822.jpg[/img] 在这该阶段我们可以把标准品配制出来，首先我们来了解一下免疫球蛋白G，它是血清主要的抗体成分，占血清免疫球蛋白的百分比较多，大约占75%，但它只有40%-50%在血清中，其余在组织当中。它的主要功能是在机体免疫中起到保护作用，它也是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白。通过胎盘获取的母体免疫球蛋白G在出生后数月对防御白喉、[url=https://baike.baidu.com/item/%E9%BA%BB%E7%96%B9][color=#000000]麻疹[/color][/url]、脊髓灰质炎等感染起着重要作用。它的结构想一个“Y”字型，如图：[img=,357,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060948093745_2090_3763765_3.jpg!w440x418.jpg[/img] [img=,255,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908060953036898_4160_3763765_3.jpg!w690x920.jpg[/img] [img=,190,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908061003393034_7645_3763765_3.jpg!w690x1230.jpg[/img] 称取免疫球蛋白G标准品0.0102g（纯度=97%）置于10mL容量瓶，并用流动相A定容到10mL，摇匀，脱气。浓度为1mg/mL。取配置好的标准溶液母液，用流动相A稀释成浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL的标准工作液。检测进样阀的精密度：将标准溶液母液取20μL在检测波 长280nm条件下进样，连续进样6次，计算其相对标准偏差RSD=0.94%。依次进样标注品工作液20μL，由时间进行定性，峰面积进行定量。得出其平均相关系数r=0.9999。免疫球蛋白G检出质量浓度以3倍信噪比(s/N=3)计算，最低检出质量浓度为0．1 mg/mL。原本还有一步已知浓度样品的检测，前处理方法如下：称取0.1g精确至0.0001曲血浆蛋白粉于15mL的塑料离心管中，准确加入10mL流动相A，涡旋振荡10min，4 000 r/min离心5 min，取上清液经微孔膜(0．22μm)过滤，滤液待测。但是由于今天已知浓度的样品没有到，所以我们无法进行样品进样，但是建议大家在安装仪器时最好用已知浓度的样品进样验证仪器的准确性。好了，今天就到这里啦！

[b]中文摘要：目的[/b] 确立因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果的影响，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。[b]方法 [/b]选取不同蛋白质浓度梯度的稀释液对同一供试品进行稀释来确定蛋白质影响的规律。 [b]结果 [/b]建立起人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物的全自动血凝仪因子效价检测方法，根据效价检测反应体系中蛋白浓度对检测结果的影响,建立因子类血液制品效价全自动血凝仪检测的方法。[b]结论 [/b]建立的两种稀释方法均消除了样品中蛋白质含量的不同对检测结果的影响，提高了检测的准确性，不但可以适用于现在产品的效价检测，而且适用于随着生产工艺的提升生产的更高纯度、低蛋白含量的FⅧ和PCC，同时也是对中国药典标准的补充。[b]关键词[/b]：人凝血因子Ⅷ；人凝血酶原复合物；效价；蛋白含量 人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人凝血因子Ⅸ等因子类血液制品，是以健康人血浆为原料，经分离纯化和病毒灭活制成，在临床上主要用于各种凝血因子缺乏的治疗，这些因子类血液制品的凝血因子效价是药品有效性的指标，凝血因子效价的测定也是药品质量检测中的关键检测项目。血液制品生产企业及各级检测机构一般采用全自动血凝仪并按照仪器使用说明来进行因子效价的检测，然而在不同检测方法结果比对中，发现全自动血凝仪检测结果与中国药典中一期法的检测结果在部分因子效价检测中存在检测差异，差异可能是样品稀释中使用的稀释液的蛋白含量不同引起的，故本课题主要研究因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果影响。通过蛋白含量对因子效价检测影响的研究建立起的全自动血凝仪因子效价检测方法，消除了产品本身性质的影响，可以准确进行因子效价的测定，方法的建立不但可以准确控制因子类血液制品的质量，保证生产企业持续稳定生产出质量均一的药品，而且可以减少因子类产品在临床使用中的风险。[b]1 实验仪器与试剂[b]1.1 仪器[/b][/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。[b][b]1.2 试剂[/b][/b]人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。[b][b]2 方法2.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 不同蛋白质浓度梯度稀释液制备：选取全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液分别定义为稀释液1、稀释液2、稀释液3。向3种稀释液中分别加入人血白蛋白，使其中人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%。 人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定[/b] [/b]人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.3 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 不同蛋白质浓度梯度稀释液制备同2.1。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]2.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]3 结果3.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果[/b][/b] 选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表1、2、3，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表1 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果[/align][align=center][img=,590,266]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142017_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表2 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果 [/align][align=center][img=,586,260]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表3 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果 [/align][align=center][img=,585,261]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_02_1626619_3.png[/img][/align]人凝血因子Ⅷ质控品2015ZK0801批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释效价检测结果平均值用折线图表示，如图1：[align=center]图1 FⅧ质控品不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][align=center][img=,548,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_03_1626619_3.png[/img][/align] 选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果见表4、5，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表4 658668A批制剂FⅧ检测结果[/align][align=center][img=,585,99]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142020_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表5 A3B1814批制剂FⅧ检测结果[/align][align=center][img=,577,97]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142021_01_1626619_3.png[/img][/align]FⅧ效价检测结果用折线图表示，如图2、3：[align=center][img=,563,299]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142029_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图2 658668A批不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][align=center][img=,567,287]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142030_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图3 A3B1814批不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][b][b]3.2 人凝血酶原复合物不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果[/b][/b] 选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了不同蛋白质浓度梯度稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表6、7、8，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表6 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果[/align][align=center][img=,583,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142031_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表7 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果[/align][align=center][img=,586,260]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142031_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表8 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果[/align][align=center][img=,593,263]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142043_01_1626619_3.png[/img][/align]人凝血酶原复合物质控品2015ZK0901批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释FⅨ效价检测结果平均值用折线图表示，如图4：[align=center][img=,556,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142032_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 PCC质控品不同蛋白质浓度FⅨ检测结果对比[/align][b][b]3.3 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果[/b][/b]选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定，共测定10次。效价检测结果见表9，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表9 FⅧ质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,579,74]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142032_02_1626619_3.png[/img][/align]选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定。效价检测结果见表10，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表10 国外产品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,578,77]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142036_01_1626619_3.png[/img][/align][b][b]3.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果[/b][/b]选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，共测定10次。效价检测结果见表11，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表11 PCC质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,582,89]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142047_01_1626619_3.png[/img][/align][b][b]4 讨论[/b][/b] 本实验中对人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物分别用不同蛋白浓度梯度的稀释液进行了效价测定，另外用人凝血因子缺乏血浆稀释后进行了效价测定。因子效价测定中，稀释液1、稀释液2、稀释液3中加入相同浓度的人血白蛋白后，得到的因子效价检测结果没有差异，说明全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液作为稀释液时没有区别。 人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物不同蛋白浓度梯度效价测定时，随着稀释液中蛋白质含量的增高，效价检测结果也不断升高，但在人凝血因子Ⅷ效价测定中，采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别，在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定中，采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别。另外，人凝血因子Ⅷ进行人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定效价检测结果与采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液得到的检测结果也无显著差异，人凝血酶原复合物人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价检测结果与采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液得到的检测结果也无显著差异。另外，国外生产的人凝血因子Ⅷ和VWF的混合制剂FⅧ效价的检测结果及血浆、稀释液的影响同泰邦公司产品一致。[b]参考文献[/b][align=left] 邬杨斌, 余蓉. 凝血因子Ⅸ复合物的研制 . 华西药学杂志, 2000, 15(3):177-179. Pabinger I, Brenner B, Kalina U, et al. Prothrombin complex concentrate（Beriplexw P/N）for emergency anticoagulation reversal: A prospective multinational clinical trial . J Thromb Haemost, 2008, 6(4):622-631. Kiman E, Elela AA, Ｒamsis N, et al. Evaluation of the coagulation factors activity of Cryosupernatant . Suez Canal Univ Med J, 2003, 6(2):247-258.Tullis JL, Melin M, Jurigian P. Clinical use of human Prothrombin complexes . N Engl J Med, 1965, 73(13):667-674.马莉, 孙盼, 李长清, 等. 去冷沉淀血浆的质量分析 . 中国生物制品学杂志, 2013, 26(1):81-83.魏舒, 时凯, 刘国荣, 等. 冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究 . 中国输血杂志, 2008, 21(10):282-284.Samama CM. Prothrombin complex concentrates: a brief review . Eur J Anaesthesiol, 2008, 25(10):784-789.焦丽华, 代旭兰, 刘文芳. 凝血酶原复合物的制备及其临床应用进展 .中国输血杂志, 2008, 21(9):737-741.[/align][b] [/b]

http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09511.gif一种新型的重组蛋白A柱 洗脱条件温和，充分防止蛋白变性蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将蛋白A与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。早期的蛋白A柱结合的都是天然蛋白A。天然蛋白A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图一所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然蛋白A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出蛋白A的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组蛋白A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组蛋白A柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。 这种洗脱条件剧烈的柱子结合的重组蛋白A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。虽然每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。GE的重组蛋白A柱即为这种类型，如图二所示。考虑到减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异从而使洗脱条件温和而均一，Putus研制出了含有三个串联B结合域的重组蛋白A，如图二所示。同时，我们用Putus重组蛋白A柱和GE重组蛋白A柱纯化人血浆，纯化的结果用于比较两种纯化柱的纯化效果，结果如图三所示。GE Putus 图二、重组蛋白A结构示意图待纯化样品：人血浆实验材料：GE公司的重组蛋白A柱（E、D、A、B、C结构域串联，见图二）Putus公司的重组蛋白A柱（3个B结构域串联，见图二）实验方法：分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5， SDS-PAGE检测结果如下： 上图从左边起，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为经过GE填料洗脱后抗体，泳道3为经过Putus填料洗脱抗体，泳道4为人血浆。从图中，我们可以看出，与GE 重组蛋白A填料从人血浆纯化抗体纯度比较，拥有3个同型结构域的Putus填料可以获得同样纯度的抗体。但是，后者的洗脱条件仅为4.5，高于前者的洗脱条件3.0。由此可见，使用具备较少B结构域的重组蛋白A柱也能获得高纯度的IgG，并且洗脱条件温和，能防止蛋白质聚集，保护蛋白质活性。http://cp00a3cee71b5f96adf6e669b5d7f56a9f11.jpg/http://C:\Documents and Settings\adim\桌面\001.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191653_632703_1672347_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/12/200912021052_187444_1672347_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/12/200912021052_187445_1672347_3.jpg

[b]使用声力研究蛋白去折叠[/b]单分子力谱(SMFS)技术是研究蛋白结构与蛋白去折叠中的生物力学性质的有力工具。SMFS能够为研究和药物开发提供有价值的信息。SMFS有助于揭示人类疾病病理的分子机制，而机制往往被认为与错误折叠的蛋白的形成和积聚有关，如阿茲海默症和帕金森氏症。然而现有的SMFS仪器缺少同时并行研究多个蛋白去折叠的功能，使得研究过程耗时很长。使用声波来对数以百计的生物分子施力并操控是非常理想的高通量研究方法。此案例中，声力谱学(AFS)是最新的用于研究蛋白去折叠的单分子操控方法。[img=,500,145]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021031435408_23_981_3.png!w690x201.jpg[/img]1 AFS检测蛋白去折叠的图解。蛋白一端栓住玻璃表面，另一端拴住聚苯乙烯微球。[img=,400,238]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021032257008_8827_981_3.png!w421x251.jpg[/img]2 对视野范围内被蛋白分子拴在玻璃表面的4.5 μm聚苯乙烯微球同时成像。物镜放大倍数为20x。AFS设备使用压电元件共振激发平面声阱穿过微流控芯片。共振波对与周围介质密度不同的微球施力，每个生物分子被单独地由微球拉伸(图1)。仪器可以实时并行操控视野范围内数以百计的微球，获得大量的数据以研究每个生物分子的随机与异质行为(图2)。在Yan Jie(NUS)的实验室的这项试点研究中，我们首次展示了AFS如何对蛋白施力并操控。实验对踝蛋白施力引发(去)折叠同时以高精确度记录蛋白的拉伸。踝蛋白属于机械敏感性大分子，在调控蛋白粘附于胞外基质中起作用。踝蛋白是细胞代谢过程和信号通路中的关键，并能够在力的作用下改变构象，在单分子生物物理学中备受关注。[img=,500,156]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021033524578_3892_981_3.png!w679x212.jpg[/img]3 使用AFS得到的单个踝蛋白分子的去折叠曲线，力变化速率为1 pN/s。轨迹在500 Hz下获得(彩色点)，并平衡至50 Hz(黑色线)。3a 单个踝蛋白多次拉伸的力-距离曲线。3b 单个拉伸循环的力-距离曲线。3c 图3b中分子的时间-距离曲线。在这项研究中，连接了DNA的踝蛋白拴在聚苯乙烯微球和玻璃表面。启动声波后形成平面声阱，连接了踝蛋白的微球受到朝向声阱的力。实验中通过调节声波的振幅来改变力的大小。逐渐增加力的大小使得蛋白的结构域按顺序去折叠。实验循环进行拉伸与收缩的过程(力变化速率为1 pN/s)并同时以nm级的分辨率检测每个蛋白的拉伸长度(图3)。通过力-距离曲线(图3a)可以观察到单个踝蛋白的去折叠循环。将单个蛋白的去折叠轨迹叠加即可检测到单个结构域去折叠的发生，研究人员可以得到蛋白结构和蛋白去折叠自由能图谱信息。AFS仪器产生的超声并不会损害生物分子的结构完整性，因此蛋白可以连续去折叠和再折叠长达数小时，并能够得到单个蛋白多次去折叠和再折叠的曲线。相比于其他SMFS方法经过多次拉伸和收缩之后对蛋白造成光学损伤或力学损伤使得实验被迫终止，AFS能够获得更多的信息。图3b: 单个力-距离曲线中截取一小段，表示一个拉伸过程。将力从15 pN增加至19 pN，可以观察到4个去折叠过程，与蛋白的4个结构域相符合，拉伸长度为30 nm至100 nm。AFS的高分辨率检测功能可以很清晰地区分去折叠过程。AFS在x,y方向精度为2 nm，在z方向精度为4 nm(频率为25 Hz)，可以大幅提高(去)折叠研究的精密程度。图3c: 图3b中分子的18秒范围内的时间-距离曲线。AFS可以检测短至毫秒级至长达10小时以上的事件，用于研究蛋白的热力学和动力学。通过检测踝蛋白的去折叠步骤并记录连续的高分辨率的去折叠轨迹，可以得出AFS如何用于研究蛋白去折叠。研究蛋白(去)折叠的详细机制能够在生物物理和生物医药领域产生突破性发现。今后的蛋白折叠以及蛋白相互作用的研究中，AFS的多分子并行操控功能将发挥重要作用，用户可以同时并行检测大量的蛋白分子。用户可以获得大量的实验数据，在不影响分辨率的同时对蛋白的机械性质数据作出分析。

[em09511]一种新型的重组蛋白A柱 洗脱条件温和，充分防止蛋白变性蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将蛋白A与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。早期的蛋白A柱结合的都是天然蛋白A。天然蛋白A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图一所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然蛋白A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出蛋白A的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组蛋白A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组蛋白A柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。 这种洗脱条件剧烈的柱子结合的重组蛋白A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。虽然每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。GE的重组蛋白A柱即为这种类型，如图二所示。考虑到减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异从而使洗脱条件温和而均一，Putus研制出了含有三个串联B结合域的重组蛋白A，如图二所示。同时，我们用Putus重组蛋白A柱和GE重组蛋白A柱纯化人血浆，纯化的结果用于比较两种纯化柱的纯化效果，结果如图三所示。GE Putus 图二、重组蛋白A结构示意图待纯化样品：人血浆实验材料：GE公司的重组蛋白A柱（E、D、A、B、C结构域串联，见图二）Putus公司的重组蛋白A柱（3个B结构域串联，见图二）实验方法：分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5， SDS-PAGE检测结果如下： 上图从左边起，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为经过GE填料洗脱后抗体，泳道3为经过Putus填料洗脱抗体，泳道4为人血浆。从图中，我们可以看出，与GE 重组蛋白A填料从人血浆纯化抗体纯度比较，拥有3个同型结构域的Putus填料可以获得同样纯度的抗体。但是，后者的洗脱条件仅为4.5，高于前者的洗脱条件3.0。由此可见，使用具备较少B结构域的重组蛋白A柱也能获得高纯度的IgG，并且洗脱条件温和，能防止蛋白质聚集，保护蛋白质活性。[IMG]http://CP00A3CEE71B5F96ADF6E669B5D7F56A9F11.jpg[/IMG][URL=http://C:\Documents and Settings\adim\桌面\001.jpg]http://C:\Documents and Settings\adim\桌面\001.jpg[/URL][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/12/200912021052_187443_1672347_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/12/200912021052_187444_1672347_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/12/200912021052_187445_1672347_3.jpg[/img]