细胞因子检测

“细胞因子风暴”一般情况下叫“细胞因子释放综合症（cytokine release syndrome, crs）。细胞因子风暴通常指大量的细胞因子在短时间内释放，造成人体过度的炎症反应，进而引起机体多器官衰竭，造成严重的不良反应。包括car-t在内免疫细胞治疗是近年兴起的肿瘤免疫治疗的重要方法，将病人免疫细胞体外改造活化后，回输人体，利用免疫反应杀伤肿瘤细胞。因为免疫细胞治疗，会将数以亿计的免疫细胞回输机体，活化的免疫细胞短时间内会释放大量细胞因子，如果不能很好监控，并及采取医疗措施平衡细胞因子水平，将会引起极大的副作用。近年出现的免疫细胞治疗病人死亡案例， 多与此有关。监测crs相关细胞因子crs , 比如gm-csf ,ifn-gamma ,il-1b ,il-2ra/cd25 , il-6 ,il-6ra ,il-10 , il-17a ,mcp-1 ,tnf-alpha，vegf-a，是免疫治疗的重要环节。对于crs细胞因子监测，传统方法为elisa法，存在者众多问题，其中最是：灵敏度不够。 例如作为crs核心调控的细胞因子il-6（emerging evidence implicates il-6 as a central mediator of toxicity in crs，blood, 10 july 2014）.传统elisa的灵敏度大概在15pg/ml。cell 2016年发表文章，20岁-60岁 534个健康人 il-6的表达水平主要分布在0.2pg/ml至2pg/ml，远低于elisa检测水平。而使用il-6抑制剂tocilizuma 是目前临床对于crs病人救治的主要办法。measurement of resting levels of low abundance cytokines such as il-1b, il-6,il-18, and vegf are below the lower limit of quantification by standard elisas in a healthy cohort therefore, the ella microfluidic analyzer was used to assess cytokine concentrations in the fg/ml to low pg/ml range.cell 167, 1111–1124, november 3, 2016proteinsimple ella超灵敏全自动elisa系统可以很好解决传统elisa存在的灵敏度和一致性差的问题。 alexion pharmaceuticals 2017年也发表了使用ella检测elisa无法检测的临床试验样品。在28例elisa无法获取理想结果的人血清样本中，ella全部获取理想结果。proteinsimple 针对免疫细胞治疗细胞因子风暴检测灵敏度不足问题，基于ella平台推出全套细胞因子检测产品：crp，gm-csf ,ifn-gamma ,il-1b ,il-2ra/cd25 , il-6 ,il-6ra ,il-10 , il-17a ,mcp-1 ,tnf-alpha，vegf-a。产品有三种规格：单因子x 72样本， 4因子x16样本，4因子x32样本。更多资料请联系proteinsimple中国热线： 4000-863-973

细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。2016年11月份的Cell杂志封面文章，题目为：Host and Environmental Factors Influencing Individual Human Cytokine Response，作者研究个体及环境因素对人体细胞因子表达的影响，以作为功能人类基因组的重要补充。研究者包括多个世界著名大学：荷兰拉德堡德大学医学中心，美国麻省理工学院Broad研究所，美国哈佛大学麻省总医院，美国科罗拉多大学医学院，新加披科技部，挪威奥斯陆大学医院等。研究者观察了534例正常人群，包括不同年龄，性别。被观察者接触了不同细菌，病毒，寄生虫，以及烟雾和维生素等非微生物刺激，检测六个细胞因子的改变，VEGF，IL-6，IL-18，IL-18BP，IL-β，IL-1Rα。 研究者发现正常人群静息水平的细胞因子，低于ELISA的检测下限，无法获的结果，但是Ella微流体全自动免疫学分析系统，可以在低至pg/ml，fg/ml，检测到细胞因子表达水平。原文如下：Measurement of resting levels of low abundance cytokines such as IL-1b, IL-6 IL-18, and VEGF are below the lower limit of quantification by standard ELISAs in a healthy cohort therefore, the Ella microfluidic analyzer was used to assess cytokine concentrations in the fg/mL to low pg/mL range. For instance, the mean level of IL-6 concentrations of the cohort was 1.25 ± 0.06 pg/mL (range 0.15–8.1 pg/mL see the STAR Methods for levels of all circulating mediators). The assessment of these parameters provides a comprehensive view of baseline immune characteristics, most importantly of inflammatory status and humoral immunity.Ella 是美国ProteinSimple 公司（纳斯达克上市公司Bio-Techne重要组成部分）创新研发的新一代微流控全自动免疫学检测系统，只需5分钟手工操作，1小时可以获取72个样本定量检测结果。 因为采用了独创的检测系统，线性区间可以达到5个log，比传统方法高2log，并且在低丰度蛋白检测方面有独到优势，已经被Roche等制药巨头用于药物临床研究中细胞因子变化研究。更多信息可以登录ProteinSimple官网：http://www.proteinsimple.com/ella.html。

细胞因子(cytokine,CK)是y类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。在nmol/L或pmol/L水平即显示生物学作用，可广泛调控机体免疫应答和造血功能，并参与炎症损伤等病理过程。 细胞因子研究具有非常广阔的应用前景，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理；有助于疾病的预防、诊断和治疗；特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子，已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效。为此，百灵威与世界上z大的细胞因子生产商之y的Peprotech强强联手，引进细胞因子系列产品，包括生长因子、白细胞介素、集落刺激因子等，满足广大生物研究l域客户。 权威产品，SCI引用9833篇 承接分装业务，规格多样化，g内现货充足 提供相应的配套产品，例如抗体、试剂盒等 拥有无动物成分的重组蛋白、临床j别的蛋白等特色产品 ■ 生长因子 产品名称 产品编号 产品名称 产品编号 Animal Free Human EGF AF-100-15 Human HGF 100-39 Murine EGF 315-09 Human TGF-α 100-16A Human FGF-acidic 100-17A Human TGF β1 100-21 Murine FGF-acidic 450-33A Human TGF β1 100-21C Human FGF-basic 100-18B Human VEGF 165 100-20 Murine FGF-basic 450-33 Murine VEGF165 450-32 ■ 白细胞介素 产品名称 产品编号 产品名称 产品编号 Human IL-1α 200-01A Human IL-4 200-04 Murine IL-1α 211-11A Human IL-6 200-06 Human IL-1β 200-01B Murine IL-6 216-16 Murine IL-1β 211-11B Human IL-12 200-12 Human IL-2 200-02 Murine IL-12 210-12 Murine IL-2 212-12 ■ 集落刺激因子 产品名称 产品编号 产品名称 产品编号 Human G-CSF 300-23 Human M-CSF 300-25 Murine G-CSF 250-05 Murine M-CSF 315-02 Human GM-CSF 300-03 Human SCF 300-07 Murine GM-CSF 315-03 Murine SCF 250-03 ■ 其它细胞因子 产品名称 产品编号 产品名称 产品编号 Human IFN-γ 300-02 Human TNF-α 300-01A Murine IFN-γ 315-05 Murine TNF-α 315-01A Human sRANKL 310-01 更多产品欢迎致电400-666-7788垂询！

植物源重组蛋白系列产品 “生长因子控制细胞的维持、增殖和分化，是干细胞研究和再生医学的关键工具“内毒素污染的微小差异会对细胞培养产生巨大影响“无动物成分和无内毒素生长因子可提高细胞培养物的一致性，这是获得可重复结果和过渡到临床应用的关键 公司介绍 Core Biogenesis是一家来自法国的以细胞因子产品线闻名业内的厂家，致力于为干细胞研究和细胞制造工业提供下一代重组蛋白。其独家研发的植物来源细胞因子，打破了传统细胞因子局限性，以无动物、无抗生素、无内毒素、无致热性，无细菌、病毒和朊病毒等优势，迅速占领国际细胞因子市场。 植物系统-生产平台 CORE BIOGENSIS研发了专有的植物系统生产平台-亚麻荠，用来进行重组蛋白的表达和生产。其生产的多个物种(如人，牛)的重组生长因子和细胞因子，广泛应用于iPSCs, MSCs，免疫细胞等领域。 FGF-2 STAB® 专为干细胞生产设计 FGF-2 STAB® FGF-2 STAB® 是一种 新型的热稳定生长因 子，可让您以更少的培养基更换更高效地生长FGF-2依赖性细胞培养物。 应用场景 干细胞培养（iPSCs、NSCs、MSC）类器官培养与生产细胞治疗生产 产品特点 “高纯度：均大于95%的纯度“不含动物成分与内毒素：无动物成分和无内毒素生长因子可提高细胞培养物的一致性，这是获得可重复结果和过渡到临床应用的关键。“半衰期长：较传统FGF-2生长因子半衰期延长10倍，长达20天“生物活性高且稳定：全部生物活性保持在稳定的蛋白质构象中“周末无需进行换液操作“降低至少50%培养成本 热稳定性=长达20天半衰期+稳定的蛋白质结果+生物活性 由于FGF-2 STAB中9个氨基酸，FGF-2 STAB® 的热稳定性有所提高。这导致细胞培养条件下的半衰期延长至 37°C，与野生型相比，蛋白质稳定性提高了 10 倍。 50%成本降低+周末无需换液工作 研究人员和制造商在多能干细胞培养过程中必须保持非常严格的每日计划，以避免自发分化会降低培养质量。FGF-2 STAB® 具有增加半衰期和蛋白质稳定性的性质，可将稳定的生长因子持续暴露于细胞中，从而为显影剂提供更简化的喂养计划，并最终在最终干细胞群中实现所需表型的更均匀的组成。实现FGF-2 STAB® 蛋白稳定性的切实好处：显著减少补料细胞所需的培养基量，并减少补料次数，节省人工成本，避免不方便的周末补料。 产品规格 产品规格FGF-2 STAB® （RUO）FGF-2 STAB® （cGMP）身份分子量质谱分析生物 活性EC50系列EC50 + - 国际单位 （IU）纯度SDS-PAGE 的 95%UPLC95-97%无菌无菌过滤 0.2 μm + 生物负荷测试无菌 USP 和欧洲药典 2.6.7内毒素低于检测水平的鲎试剂测定USP 欧洲药典2.6.14支原体不适用阴性宿主细胞DNA/蛋白质含量不适用附件测试自主批次不含动物成分不含不含批次间一致性不适用是的法规遵从性ISO9001ISO9001， USP ， 欧洲药典 5.2.12

结核病问题的解决仍是一个长期的世界性的难题。从20世纪90年代初世界卫生组织宣布全球进入结核病公共卫生紧急状态起,在相当长的一个时期内公众普遍乐观地认为,通过推行直接面视下短程化疗(DOTS)措施就可以有效解决结核病的问题。但是随着全球范围结核病防治工作的普遍开展和实践,到2011年前后,全球逐渐形成解决结核病问题需要将公共卫生管理和技术工具开发相结合的共识。结核病的有效防治需要在诊断、预防、治疗等3个方面(新诊断技术、新疫苗和新药物)下力气。在传染病相关的行政管理中,中国的模式和行政效率在世界上都是领先有效的。在行政手段有效保障的基础上,进一步提高控制能力的任务就需要客观具体的技术产品来实现了。随着我们对结核病、耐药结核病、耐多药结核病、广泛耐药结核病研究的日益深入,对其认识也是逐步提高的。在应用已有手段解决普遍性问题的同时,针对新发现的尚缺乏有效诊治手段的结核病类型,我们就需要研究更多新技术并开发更多的新产品,从技术能力上切实解决这些问题。免疫学诊断方法免疫分子用于结核病诊断新进展：在活动性结核病患者体内结核分枝杆菌特异性单阳性TNF-α+和双阳性IFN-γ+/TNF-a+CD4+T细胞的比例显著高于潜伏性感染者和未感染者。此外，表达IL-17的CD4+T细胞（主要为单阳性IL-17+和双阳性IL-2+/IL-17+表型）的频率在活动性结核病患者中高于其他两种组。分枝杆菌特异性CD4+T细胞的数量和功能特征在结核病感染和未感染结核的儿童之间以及潜伏和活动性结核病之间存在显着差异【1】。细胞因子和可溶性粘附分子谱和生物标志物用于治疗监测再治疗涂阳肺结核患者。复治期间，IFN-γ、IL-2、IL-7和可溶性CD54水平以及IL-2/IL-10和IFN-γ/IL-10比率呈上升趋势，可作为复治是否有效的血清指标【1】。IP-10和RANTES的组合可能被用作诊断和治疗监测肺结核中的生物标志物。肺结核患者血浆IP-10和RANTES水平显着高于健康对照组，IP-10和RANTES的组合在训练组中的AUC为1.0时表现**。响应治疗时，IP-10和RANTES均显着水平在6个月内减少【2】。γ-干扰素释放试验（IGRAs）用于结核病诊断新进展：IGRAs的原理是当机体内被结核菌抗原致敏的效应T细胞，在体外受到相同抗原的刺激（在APC细胞辅助下）后，会分泌大量的γ干扰素。通过IFN-γ的检测来判断结核感染的情况。IGRAs试验灵敏度高，特异性高，快速简便，是一种值得推广的检测方法，为潜伏性感染和活动性结核的辅助诊断，阴性结果对排除结核感染有一定的帮助。IGRAs试验用于筛查潜伏性感染时不受卡介苗接种的影响，但不适用于流行病学筛查。但是IGRAs预测哪些患者将来进展为活动性结核病的方面的应用较少。最近的一个大样本研究评估IGRAs和TSTs显示在低发病率国家，IGRAs和TST的阴性预测值＞99%，但阳性预测值仅为3%-4%【3】。下一代IGRAs发展前瞻需考虑以下几个方面：增加预测潜伏性感染到活动性结核的能力；能够检测结核分枝杆菌感染的临床阶段；监测潜伏感染或结核病的治疗效果；增加新抗原（如Rv3873、Rv3879和Rv3615）及增加更多细胞因子（IP-10，MCP-2，MIG等）来提高IGRA的敏感性。此外，随着结核分枝杆菌的菌量增加，结核特异性的CD8+ T细胞更容易检测到。CD8反应可以初步区别活动性与潜伏感染，与治疗效果相关【4】。双因子检测DeFine.TB 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒结核分枝杆菌特异性细胞因子（IFN-γ和IL-2）检测试剂是 “十三五” 国家科技重大专项传染病防治专项成果转化产品。在检测时，将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ，消除血液本底干扰因素，通过计数单个核细胞数量，排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养，结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子，再利用双抗体夹心酶联免疫法，检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度，来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。用于结核病的辅助诊断，能够及时发现活动性结核患者，同时对于潜伏感染患者能够进行及时、准确的排筛。01 新的检测靶标IL-2特异性高达94.3%研究结果发现IFN-γ的ROC 曲线下面积为0.859，而IL-2 的ROC 曲线面积0.865（详见Fig. 2 ） ，IFN-γ的总体敏感性和特异性分别为83.8% 和81.5%，IL-2的特异性为94.3%，灵敏度为72.6%（详见Table2）。02 新的检测靶标IL-2提高结核病的检出率双因子检测的敏感性为87.9%，单因子检测敏感性为83.8%，敏感性的增加主要是由于引入新的检测靶标IL-2，表明约16%的活动性结核患者中IFN-γ结果为阴性，而这些患者中有1/4的IL-2 结果为阳性。当IFN-γ和IL-2 串联组合时，特异性进一步提高到96.0%，可与分子诊断的培养阳性检测结果相媲美，甚至可以对培养阴性的患者产生可靠的结果。03 并联检测敏感性高达87.9%，串联检测特异性高达96.0%进一步分析IFN-γ和IL-2联合应用对活动性结核病的诊断价值。对IFN-γ和IL-2 进行并联检测时，敏感性升至最高的87.9%，特异性达到79.8%，阳性预测值达93.9%；当IFN-γ和IL-2 进行串联检测时，718 例非结核患者中有689 例检测结果为阴性，特异性为96.0%，敏感性为68.5%，阳性预测值为98.4%。值得注意的是，串联检测在结核病确诊患者的敏感性（72.1%），高于临床诊断敏感性（65.8%），提示IFN-γ和IL-2串联检测的准确度与结核病的严重程度相关。04 双因子联合检测灵活性高，满足不同的检测场景研究团队根据活动性结核病不同流行模型，分别阐述了IFN-γ和IL-2联合检测在不同模型中诊断价值，并提出了适用于综合性医院和专科医院各自的诊断算法。在综合性医院中，约有10%的结核疑似患者最终确诊为活动性结核，与常规涂片镜检相比，使用具有更高敏感性的双因子并联检测可帮助临床医生发现更多活动性结核病患者（如图B）；在结核病专科医院，结核病疑似患者中活动性结核病的比例达到50%，使用具有高特异性的双因子串联检测可为活动性结核病患者特别是菌阴结核患者提供诊断依据（如图A）。在检测时，将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ，消除血液本底干扰因素，通过计数单个核细胞数量，排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养，结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子，再利用双抗体夹心酶联免疫法，检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度，来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。用于结核病的辅助诊断，能够及时发现活动性结核患者，同时对于潜伏感染患者能够进行及时、准确的排筛。

11月24日，暨南大学医学部生物医学转化研究院教授尹芝南团队与合作者，在《自然》在线发表的研究成果显示，白细胞介素27（IL-27）具有促进脂肪细胞产热和能量消耗的作用，其主要响应细胞是脂肪细胞而非免疫细胞，并且IL-27具有减轻肥胖和提高胰岛素信号敏感性，即改善2型糖尿病的治疗作用。　　“这一工作历时7年才得以完成。”尹芝南对《中国科学报》表示。　　发现减肥新靶点　　近年来，随着富含脂肪和糖等高能量食品的摄入持续增加，以及越来越多的工作为久坐形式，人们罹患超重或肥胖的比率快速上升。世界卫生组织流行病学调查显示，2016年，18岁以上的成年人中有超过19亿人超重（身体质量指数即BMI≥25），其中超过6.5亿人为肥胖（BMI≥30），流行率与1975年相比增长近3倍。　　“肥胖的根本原因是卡路里的摄入超过消耗，引起能量以脂质形式在脂肪细胞中堆积，而免疫细胞深度参与此过程。因而，寻找新的治疗靶点，尤其是直接靶向脂肪细胞而有效减重的分子尤为迫切。”尹芝南说。　　尹芝南长期从事免疫与健康的基础和临床研究，在T细胞领域取得一系列开创性成果，并将研究成果成功应用于临床转化。此次，尹芝南团队通过构建多种基因工程小鼠，进行高脂饮食诱导的肥胖模型，并结合肥胖人群样本发现，肥胖人群血清中IL-27水平下降；突破了传统观念中IL-27专一性靶向免疫细胞的认知，首次发现IL-27通过直接作用于脂肪细胞，导致白色脂肪细胞棕色化，并激活UCP1介导的“脂肪燃烧”；通过将脂肪组织中的脂质转变为热量消耗掉，从而达到降低体重和改善糖尿病等代谢性疾病的目的。　　“体重增加，从表面上来看是脂肪细胞增大，但根本原因是胰岛素抵抗。”尹芝南解释，团队发现的IL-27作用于脂肪细胞燃烧，一方面是减肥，但最主要是改善了胰岛素抵抗。改善胰岛素抵抗，对治疗肥胖及很多疾病都具有重要意义，如脂肪肝、多囊卵巢综合征等。　　尹芝南指出，该研究突破了对IL-27仅专注于调节免疫系统的传统认知，为肥胖及其相关代谢性疾病的治疗提供了新的靶点和潜力药物，而IL-27作为体内正常表达的分子，具有良好的安全性，因而具有巨大的临床应用潜力和市场价值。不过，他也同时强调，从实验室到临床，还有很长的路要走。　　“在肥胖过程中是哪个细胞产生IL-27？IL-27在脂肪细胞的相互作用过程中有没有受到其他细胞的作用，有没有受到情绪的影响？这些都是团队接下来要做的基础研究。”尹芝南说。　　躺平燃烧卡路里？　　传统观点认为，免疫细胞尤其是T细胞、B细胞和巨噬细胞，是IL-27的主要响应细胞，而脂肪组织局部含有大量的巨噬细胞和T细胞。　　为了探究IL-27通过何种细胞发挥改善肥胖的作用，尹芝南团队构建了IL-27Rα的条件性敲除小鼠。他们意外发现，在T/B细胞和巨噬细胞中特异性缺失IL-27Rα，都不影响小鼠对高脂诱导肥胖的易感性。这促使作者猜想，IL-27是否还有其他未被发掘的响应细胞。　　为此，尹芝南团队利用IL-27Rα全身性敲除小鼠开展了骨髓嵌合实验，并进行了高脂饲喂或寒冷刺激。结果发现，IL-27信号主要通过非造血系统来源的细胞影响产热与肥胖进程。一个大胆的想法在尹芝南脑海中产生：IL-27是不是可以直接靶向脂肪细胞来促进产热、改善肥胖进程呢？　　为了验证上述假设，研究人员首先分离了脂肪组织中的脂肪细胞组分，发现上面确实有IL-27Rα的表达；对体外分化的原代脂肪细胞进行免疫荧光染色，也可以观察到IL-27Rα的阳性表达；并且IL-27处理体外分化的脂肪细胞可以上调UCP1的表达。　　于是，他们再次构建了脂肪细胞上特异性缺失IL-27Rα的小鼠和棕色/米色脂肪细胞特异性缺失IL-27Rα的小鼠，这些小鼠也的确表现出对肥胖诱导和寒冷刺激实验的易感性。这些结果表明，IL-27确实可以直接靶向脂肪细胞，以促进产热、减轻肥胖。　　“我们在动物实验中，注射重组IL-27可以显著减轻肥胖小鼠的体重并改善胰岛素信号敏感性，初步验证了IL-27作为治疗药物的潜力。”论文共同第一作者、暨南大学附属珠海市人民医院博士后王倩解释，该研究成果的主要优势是IL-27是在本体表达的蛋白，不是人工合成的外源性化合物。　　“我们可以在不用限制饮食、不用节食的情况下改善2型糖尿病、燃烧脂肪、减轻体重，从机制上改善胰岛素信号的敏感性。”论文共同第一作者、暨南大学附属珠海市人民医院博士后李德海介绍。　　“我们非常期待能够尽快将这一治疗靶点产业化，推动其临床应用，研发出RNA相关药物，为肥胖、糖尿病、脂肪肝等一系列代谢性疾病提供一个全新的治疗方法。”尹芝南还透露了另一研究方向——通过IL-27水平变化，预判身体健康状况。　　相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04127-5

细胞迁移，指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。移动过程中，细胞不断重复着向前方伸出突触/伪足，然后牵拉后方胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白，还有细胞间质是这个过程的物质基础，另外还有多种物质会对之进行精密调节。细胞的运动有很多种，有生理性运动，如发育过程中的细胞运动，生殖细胞、干细胞的成熟过程中的位置变化。也有病理性变化，如肿瘤的迁移和侵袭。从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。癌症细胞增殖失控，短时间内可以繁殖出大量后代，这样首先会造成生长空间的局促和养分，如氧气的紧张。这样恶性肿瘤内会形成一片坏死区，正如上面在组织损伤里面提到的，机体会尝试“修复”这些损伤。坏死组织会释放出一系列促血管生成因子，如血管内皮生长因子以及各种免疫细胞，如巨噬细胞。巨噬细胞也会释放大量促血管生成细胞因子和生长因子。因此肿瘤的研究伴随着复杂的细胞运动，如肿瘤细胞沿着循环系统的运动，血管内皮细胞和免疫细胞进入肿瘤实体的运动。划痕法是经典的细胞行为学检测方法。在平铺的细胞单层上划出一条痕迹，然后清洗更换培养液后，细胞会从原有位置向划痕处迁移。统计划痕宽度和面积的变化就可以监控细胞迁移的速度和细胞迁移的能力。以前在做划痕实验的时候受到诸多限制：首先微孔板的孔不能太小，孔越小，枪头越难伸进去；其次划出的痕迹边缘歪斜，无法形成一条直线；孔与孔之间的划痕宽度也不均一。这给划痕这个时间梯度的实验带来了很大的困扰。在多次的拍照过程中，由于划痕宽度的差异性对于划痕拍照位置的复位要求甚高。然而随着细胞迁移的发生，细胞的原位的形态和分布也发生的动态变化。所以复位划痕的拍照位置成为就成为了一个力气活：既然无法准确找到，那就全部拍下；既然每个位置宽度不一，那就全部统计。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统的划痕套装。轻轻一划，解决全部困扰。借助Scratcher整齐的96针，可以在96孔微孔板底面整齐的划出宽度均一的划痕。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统可以盯住一个视野不停的拍。然后生成无抖动的视频。借助专业的划痕分析软件，对划痕宽度、面积、愈合速度进行分析，可以获取的参数包括：划痕面积划痕的覆盖度划痕的宽度划痕的愈合速度相对划痕密度对于原始细胞区域、原始划痕区域、划痕分界线、迁移后细胞的区域进行精准的划分，保证分析结果的精确。轻松的完成整个实验，再也不用熬夜拍划痕了。MuviCyte™ 已于2020年1月1日全新上线，借助它的多荧光通道和多种物镜选择，可以完成多种复杂的复杂细胞模型的拍摄和观察，在肿瘤免疫、干细胞等多个领域都有重要的应用。扫描下方二维码或点击下载链接，即可下载珀金埃尔默MuviCyte™ 活细胞成像系统相关资料。下载链接: http://hyw3rjq7ezkfsnvu.mikecrm.com/naj9QZD

炎症因子是炎症反应及其介导的疾病中参与免疫调控的一类重要细胞因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）、转化生长因子（TGF）等。目前已经证实炎症因子与多种临床疾病的发展密切相关，包括细菌感染、新生儿败血症、心血管疾病、类风湿性关节炎等各种急性和慢性炎症疾病，甚至在肿瘤的发生发展中也起到了重要作用。因此，血清炎症因子是监控疾病进程的核心指标，通过对炎症因子的检测可以更好的评估患者免疫状态，为临床管理提供重要参考。然而，这些炎症因子在血清中的含量极低，现有的一些常规技术由于受到灵敏度的限制无法达到检测需求，难以及时预测疾病的转归。 图1 基于ZIF-8@Ag NWs 复合纳米材料的电化学传感芯片结构图以及免疫传感策略验证结果近期，上海大学的张源课题组提出了一种合理有效的电化学免疫传感器件设计策略。该团队以ZIF-8@Ag NWs为电极材料，结合3D 打印（NanoArch S140，摩方精密）和丝网印刷技术，开发了一种多通道的电化学免疫传感芯片，用于血清中炎症因子IL-6和IL-8的联合检测。该传感芯片可同时检测pg/mL至ng/mL浓度范围内的IL-6和IL-8，即使在复杂的BSA环境中也可达到10 pg/mL的检测限。临床血清样本分析表明该传感检测方法对18例炎症疾病患者组和18例对照组表现出良好的区分结果。相关成果以In-situ formation of “electron conductive wires” threaded ZIF-8 membrane for multiplexed immunoassay of human interleukins为题发表在《Nano Research》期刊上。图2 临床血清样本的检测分析结果。(a) 固定有Anti-IL-6的工作电极对血清的检测结果 (b) 固定有Anti-IL-8的工作电极对血清的检测结果 蓝色柱为健康对照组，橙色柱为患者 (c) 基于IL-6、IL-8检测结果的主成分分析数据。

文章来源：中华检验医学杂志, 2022,45(8) : 790-801作者：中国中西医结合学会检验医学专业委员会摘要嵌合抗原受体（CAR）-T细胞免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域一个举世瞩目的重大成果。流式细胞术（FCM）在CAR-T细胞免疫治疗相关检验的每一个步骤中都起到非常重要的作用，包括靶点筛查、CAR-T细胞产品成分鉴定、毒性预估、微小残留病（MRD）检测、免疫功能评价、免疫微环境研究等。为了深刻认识FCM在CAR-T细胞免疫治疗这一新兴领域的作用，规范每一项应用中的操作，进一步促进其在CAR-T细胞免疫治疗中的应用，中国中西医结合学会检验医学专业委员会制定了此专家共识。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域一个举世瞩目的重大成果［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］，尤其是CD19-CAR-T细胞免疫治疗难治复发B细胞急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）获得了90%左右的缓解率［1, 2, 3］，单独使用或者桥接异基因造血干细胞移植均极大程度地提高了患者的完全缓解率和生存率；CAR-T细胞免疫治疗其他类型白血病、淋巴瘤、骨髓瘤以及实体瘤也在不断探索并取得巨大进步［4, 5, 6, 7］。流式细胞术（flow cytometry，FCM）在CAR-T细胞免疫治疗相关检验的每个步骤中都起到非常重要的作用 ［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］。作为一项免疫治疗，CAR-T细胞免疫治疗相关检验中涉及的FCM与临床常规不同，体现在靶点评估需要精确设门并且同时关注正常细胞的表达，CAR-T细胞免疫治疗后微小残留病（minimal/measurable residual disease，MRD）需要考虑靶点丢失以及输入的CAR-T细胞影响，而CAR表达细胞比例和数量的检测以及免疫相关检测均缺乏规范化，给临床工作带来不确定性等。为了能使更多相关领域的科研、临床和实验室检测人员认识FCM在CAR-T细胞免疫治疗中的作用和注意事项，规范在每项检验中的实验方案和技术操作，进一步促进其在CAR-T细胞免疫治疗中的应用，中国中西医结合学会检验医学专业委员会组织专家结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。适用范围、术语和定义一、适用范围各类医疗机构临床实验室、商业化实验室和科研单位在使用FCM进行CAR-T细胞免疫治疗相关临床检验时，均可采用或参照使用本专家共识。鉴于CAR-T细胞生产过程中的创新性和复杂性，并且该步骤极少在临床诊断实验室中进行，本共识不涉及此研发过程。二、术语和定义1.多参数流式细胞术（multiparametric flow cytometry，MFC）：虽然MFC的术语出现于20世纪80年代，当初指代两色以上FCM，后期对此也没有明确定义，但是现在普遍建议采用三激光八色或者以上机型。2.CAR-T细胞免疫治疗：人体免疫细胞（来自自体或异体均可），在体外经过基因修饰后具备了特异性识别和杀伤表达特定抗原的肿瘤细胞的能力，输入患者体内以实现清除肿瘤细胞或者其他病态细胞的免疫治疗方法［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］。CAR-T细胞免疫治疗技术包括几个步骤：（1）从患者或者供者血液中分离出自体或者异体T淋巴细胞；（2）用CAR编码的病毒载体进行体外修饰、培养；（3）最后输入患者体内。近年来为了增强治疗效果降低副作用，已发展到第4代CAR-T细胞免疫治疗技术。3.细胞因子：细胞因子是由多种免疫细胞分泌的一类小分子蛋白质，具有介导和调节免疫过程等作用。目前已经发现的人类细胞因子有200多种。根据结构和功能一般可分为白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、集落刺激因子、趋化因子和生长因子等。4.细胞因子释放综合征：细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）是一种发生在任何免疫治疗后，由于内源性或者输注的T细胞和/或其他免疫效应细胞活化或者聚集导致的超生理反应。症状多样，但是必须包括初发时发热，可能伴有低血压、毛细管渗漏（低氧）和终末器官衰竭。尽管没有将细胞因子检测纳入定义，而CRS分级也主要是根据临床表现，但是鼓励进行C反应蛋白、细胞因子、铁蛋白等相关检测，便于为将来的研究提供依据［8］。5.趋化因子及其配体：趋化因子是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，其配体很多是免疫功能检测中区分淋巴细胞亚群的重要标志物，例如半胱氨酸-半胱氨酸基序趋化因子受体（cysteine-cysteine motif chemokine receptor，CCR）系列，半胱氨酸-氨基酸-半胱氨酸基序趋化因子受体（cysteine-X-cysteine motif chemokine receptor，CXCR）系列［9］。6.抗原表达率：精确设门后，特定细胞上抗原表达的百分比。临床工作中由于受到抗体和荧光素选择、抗原抗体结合过程、温度光照和放置时间导致荧光信号改变、仪器设置、设门精确度、个体差异、细胞异质性、对照细胞群、检测目的等多种因素影响，以诊断为目标的临床实验室，一般由流式操作人员排除各种影响因素后，按照表达、部分表达、不表达进行定性描述［10］，以方便临床和实验室对目的细胞群进行简单直观的性质判断。7.抗原表达强度：与某种抗原分子在细胞上表达量的多少有关，FCM的直观体现为荧光强度。根据抗原表达强度将阳性细胞表达分为强表达（bright，bri）、中等强度表达、弱表达（dim）和异质性表达［10］，可能会随着治疗和疾病或者活化状态发生改变。8.单链可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）：构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒载体或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。CAR基因正常表达时，形成跨膜的CAR结构，细胞外域的重链可变区和轻链可变区通过15~20个氨基酸短肽连接而成的部分即为scFv。编码的scFv元件既是CAR-T细胞识别肿瘤抗原的重要成分，也可作为FCM评价CAR表达情况的检测靶点之一。9.同型阴性对照：用于检测抗体与细胞表面可结晶段受体非特异性结合导致背景信号的阴性对照。应该用与检测抗体相同标记、同种属来源、相同亚型、相同浓度的免疫球蛋白进行染色，如果是间接标记抗体，还需要做二抗的荧光素背景对照，其作用是设置仪器条件，消除背景染色。对于正常标本中不存在的未知标志或者与阴性细胞界限不清的标志，或者标本中比例极低需要精确检测的标志，同型阴性对照是普遍采用的对照。CAR-T细胞免疫治疗相关检验中的FCM项目CAR-T细胞的生产研发、临床治疗每个环节都与FCM检测密不可分，包括靶点筛查、患者选择、CAR-T细胞成分鉴定、毒性预估、MRD检测、回输物和患者标本免疫功能评价、免疫微环境和复发机制研究等。鉴于CAR-T细胞治疗这一全新领域集合了肿瘤细胞和正常细胞免疫表型、肿瘤干细胞免疫表型、免疫细胞亚群、细胞因子检测、CAR-T细胞检测、因部分病例靶点丢失甚至系别转变导致需要调整方案的FCM MRD检测、肿瘤异质性和免疫微环境检测等（表1），以及CAR-T细胞治疗设计的多样性和复杂性、临床工作中使用不同靶点或者联合靶点CAR-T细胞治疗、使用其他细胞因子或者信号分子靶向药物控制副作用等，这些都对FCM检测提出更高的要求。因此深入了解每个环节需要使用的标本类型、检测方案以及最低检测要求，将有助于进一步规范检测流程，提高检测水平，保证检测质量。FCM在CAR-T细胞免疫治疗靶点筛查中的应用随着CAR-T细胞治疗技术的不断完善，CAR-T细胞的功能和治疗的安全性都有了很大提升，并有CAR-自然杀伤（natural killer，NK）细胞、双特异性靶点CAR-T细胞等类似靶向细胞免疫治疗产品出现。但是作为特异性免疫治疗，胞外抗原识别区的设计，尤其是有效靶点的选择始终是每一种CAR-T细胞治疗相关产品的关键环节。理想的靶点应该满足下述要求：高覆盖率（某种疾病的群体中，肿瘤细胞表达该抗原的患者比例高）、高表达率（阳性个体中几乎所有肿瘤细胞都表达）、高表达强度（在肿瘤细胞表面抗原分子数量多，表现为同一种荧光标记时，荧光强度高）、高特异性（在正常细胞中不表达或者少表达，对患者不会造成严重影响）［11］。FCM作为一项快速、简便、直观、定性定量的技术，是目前实现这一目的的重要检测手段，而CAR-T细胞治疗靶点的选择虽然都是在免疫分型或者MRD的基础上进行，但是比常规临床诊断有更严格的特殊注意事项［12, 13］。共识2：为了尽可能给CAR-T细胞免疫治疗提供客观评价，建议一项研究或治疗过程中尽量采用相同的方案，至少是关键抗体和组合相似的方案。同一患者的随访监测尽量在同一台仪器上进行，且尽量仪器条件（包括补偿）相同，或者进行仪器间条件比对。推荐强度：建议执行。）专家组成员（按姓名字母顺序排列

2023年11月22-23日，第六届（2023）中国医疗器械创新创业大赛人体精密测量专场赛暨2023人体精密测量创新创业大赛决赛在南通海门举行。本届大赛自启动以来，报名参赛项目达百余项，最终，安珀生物的“基于人工智能的流式细胞仪监测平台”项目经过激烈角逐，荣获大赛决赛三等奖。流式细胞术创新安珀“基于人工智能的流式细胞仪监测平台”主要是利用流式细胞术，实现细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选。在“前处理模块”、“鞘液系统的流体控制系统”、“光学聚焦系统及荧光检测系统”、“FPGA芯片高频信号处理及采集系统“核心技术方面做出了创新突破，同时搭载”AI诊断辅助“系统，可快速提高医生工作效率，将精准检测发挥到最大作用。这一系统填补了国内领域的AI检测和处理系统的技术空白。多维安珀 OIR AMBER 流式细胞仪检测平台DWAP-300相较于传统流式受可行性和可重复检测性能的限制，光谱流式细胞术可高灵敏地收集荧光染料的全部光谱信息，然后通过先进的光谱解析算法完成超多色免疫分型。将在肿瘤免疫标志物探索、多细胞因子检测（24甚至更多）、疫苗研发（例如慢性肝病的主要病因丙肝病毒较弱的疫苗应答）、免疫新药研发（检测外周免疫细胞表现出与健康个体不同的细胞亚群分布和活化谱）等医学方面发挥重要作用，为医学检测及研究贡献力量。这一项目不仅彰显了我们在医疗研发领域的专业水平，更将人工智能技术与流式细胞仪相结合，为精准医学的未来奠定了坚实基础。探索前行不止此次获奖，是对我们不懈努力和持续创新的高度认可，也是对安珀生物在生物科技领域研发实力的证明。未来，我们将继续秉承“让健康变简单”的使命，以“科技创新、服务卓越”为发展理念，不断推动生物科技行业的进步。安珀生物将继续积极投入研发领域，不断探索前沿技术，为客户提供更加优质的产品和服务，为生物健康行业的蓬勃发展做出贡献，为全人类的健康生活而努力。山东安珀生物科技有限公司山东安珀生物科技有限公司成立于2015年1月，秉承“爱与科技服务健康生活” 的理念，专注于体外诊断试剂(IVD)、医疗诊断仪器设备的研发、生产和销售，先后取得了“国家高新技术企业”、“山东省‘专精特新’中小企业”、“济南市‘专精特新’中小企业”、“济南市瞪羚企业”、“山东省瞪羚企业”等荣誉称号。已经取得拥有自主知识产权的专利31项，软件著作权13项。公司建有省内最大的体外诊断试剂专用生产场所，经营面积约5000㎡，其中净化生产车间面积约4000㎡、研发实验室面积约1000㎡。公司致力于流式检测技术平台、质谱检测技术平台、分子诊断技术平台、化学发光技术平台、免疫层析技术平台和生化免疫技术平台等六大技术领域，产品涉及病原微生物核酸检测、生化检测、免疫诊断、营养及代谢检测等多项领域。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其变异株Omicron由于高传播率目前已取代其它毒株成为全球新冠的主要流行毒株。各国已采取大规模疫苗接种，通过其产生的中和抗体和抗病毒T细胞来缓解和对抗新冠肺炎。有研究报道，病毒特异性T细胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗体滴度减弱的COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞会持续很长时间。因此需要充分了解新冠肺炎中T细胞免疫过程，对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。COVID-19患者中的T细胞免疫反应T细胞免疫反应是高度特异性的，在引发有效的抗病毒反应方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，树突状细胞(DC)和巨噬细胞可以吞噬病毒感染的细胞，通过抗原呈递启动T细胞反应。随后，CD4+T细胞刺激B细胞产生病毒特异性抗体，细胞毒性CD8+T细胞靶向病毒感染的细胞。有研究报道，SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞在COVID-19症状发作后的前2周内的外周血中很明显。大多数SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞表现出中枢记忆表型，主要产生Th1细胞因子，而CD8+T细胞具有更高水平的穿孔素表达的效应表型。另外有研究报道COVID-19患者T细胞活化的异质性，并提供证据表明CD4+和CD8+T细胞都能够产生有效的免疫反应，并出现受损或过度的T细胞反应。轻度COVID-19患者的T细胞升高，产生强大的抗病毒免疫反应。特别是CD8+T细胞表达更高水平的细胞毒性分子，例如颗粒酶A和FAS配体，它们有利于消除病毒感染的细胞。然而，在严重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，细胞毒性T细胞）比例减少，同时幼稚和中枢记忆CD8+T细胞的百分比也均较低。此外，与健康对照组相比，COVID-19患者的终末分化效应CD4+和CD8+T细胞的百分比更高。且重症COVID-19患者的调节性T细胞(Tregs)水平低于轻症患者。总之，T细胞亚群（包括Treg、Th1、幼稚和记忆T细胞）平衡中的这些失调可能导致严重的炎症状况，并可能导致COVID-19复发。尽管由CD4+和CD8+T细胞介导的早期抗病毒反应最有可能具有保护作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T细胞难以通过限制I型和III型干扰素反应来产生有效的抗病毒反应。COVID-19恢复期患者和健康人中的T细胞免疫反应恢复康复患者的T细胞计数可以为T细胞在抗病毒反应中的作用提供重要参考。有研究报道，超过70%的COVID-19恢复期患者存在SARS-CoV-2特异性T细胞。100% CD4+T细胞和70% CD8+T细胞在康复患者中具有SARS-CoV-2 Spike特异性反应。功能测定证实CD4+T细胞表现为Th1表型并产生大量IFN-γ，和针对S蛋白较低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同样，大多数SARS-CoV-2刺突特异性CD8+T细胞产生IFN-γ，绝大多数IFN-γ+CD8+T细胞也共表达颗粒酶B和肿瘤坏死因子α (TNFα)。这些数据表明，康复患者中的大多数CD4+和CD8+T细胞产生了针对S蛋白的大量抗病毒免疫反应，说明功能性T细胞在病毒清除和恢复中的重要性。此外，这些数据也说明利用SARS-CoV-2的S蛋白作为疫苗生产关键候选者的重要性。T细胞反应在无症状和未接触过的个体中观察到的T细胞反应最低。但是即使没有并发的体液反应，无症状/轻度恢复期的COVID-19患者也可以产生强大而持久的记忆T细胞反应来预防复发性感染。有研究报道，与有症状的个体相比，无症状患者的免疫反应较弱，并且相当一部分有症状的患者在恢复期早期表现出中和抗体量减少。COVID-19恢复期患者在出院后2周内也显示出与针对人ACE2的中和抗体滴度和病毒特异性T细胞计数的强相关性。细胞因子风暴细胞因子风暴是指在各种病理条件下检测到的大量促炎细胞因子和趋化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中观察到的关键病理特征之一。在重症COVID-19患者中记录到高细胞因子水平。各种免疫细胞类型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、DC，以及NK、B和T细胞，可导致COVID-19患者的细胞因子风暴和炎症反应的过度激活状态。由先天免疫细胞释放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者发生细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动力之一，其中一些可能是导致这些患者淋巴细胞减少或Th1反应不足的潜在机制之一。另据报道，在COVID-19重症病例中，血清TNFα和IL-6水平升高与总T细胞计数呈负相关，表明这些细胞因子可能参与淋巴细胞减少和T细胞丢失。相反，处于恢复期的患者上述细胞因子的血清水平显著降低，并显示T细胞计数恢复。鉴于这些发现，有人提出IL-6阻滞剂，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受体阻滞剂用于治疗重症COVID-19患者以解决过度炎症和控制炎症的传播。趋化因子和细胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板衍生生长因子亚基B（PDGFB），促进其它白细胞向组织的募集，导致组织损伤。基于T细胞反应的疫苗研究SARS-CoV-2完整基因组的快速可用性可用于开发多种疫苗，使其在刺激幼稚T细胞后产生效应和记忆T细胞，发挥免疫保护。成功的SARS-CoV-2疫苗应该产生对有效免疫反应具有高度特异性的SARS-CoV-2反应性T细胞，而不会产生炎症或疾病开始的不良影响。SARS-CoV-2的蛋白被确定为最适合疫苗开发的靶标，以触发病毒特异性T细胞反应和体液免疫反应。表达S蛋白的腺病毒病毒载体疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康个体(NCT04313127)中检测其疫苗的安全性和耐受性，观察到2周后成功产生特异性抗病毒T细胞和体液免疫反应。Moderna开发了基于mRNA的疫苗，编码SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通过脂质体递送系统给药。因mRNA疫苗可以模拟天然病毒感染，并仅编码抗原蛋白并且不能整合到宿主染色体中。因此，基于mRNA的疫苗更能发挥细胞免疫和体液免疫。T细胞免疫检测---细胞因子释放检测（CRA）疫苗中的抗体测试是常规进行的，但因为特异性病原体的T细胞在血液中存在的总T细胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在从全血中纯化的细胞中进行。而这些检测都需要复杂的设备和高度专业化的人员，这可能不是每个常规实验室都可以使用的。杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队采用了一种快速和简单的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定(Cytokine release assay, CRA)实验：直接将刺激性抗原或肽添加到全血中，导致血浆中细胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后进行定量。该检测方法通过简单地将Spike肽库添加到全血中，可以轻松快速地检测和相对定量接种疫苗个体中的Spike特异性T细胞反应。此方法检测时间比常规方法缩减了7个小时，总时间缩短了12个小时。总结因T细胞免疫反应在疾病的早期阶段表现出保护作用，也可能导致致命症的发生，因此COVID-19的治疗和预防中需要深入地了解疾病过程中的免疫反应。特别是在症状轻微的患者中阻断促炎细胞因子的早期治疗干预可能会产生有害影响，并导致免疫反应不足和病毒清除受损。在危重COVID-19患者中恢复T细胞耗竭和改善过度炎症反应的晚期治疗干预可能具有更好的临床结果。在疫苗开发中，也要充分考虑其是否可以增强抗病毒免疫和特定T细胞反应从而加强疫苗保护的持久性。参考文献Robust T Cell Immunity in ConvalescentIndividuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.Rapid determination of the wide dynamicrange of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated andnaturally infected.T cell immunity to SARS-CoV-2 followingnatural infection and vaccination.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，其发病机制复杂，环境因素、遗传因素、免疫因素等都被认为与疾病的发生、进展密切相关。淋巴细胞亚群中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤淋巴细胞及淋巴细胞功能亚群调节性T细胞是细胞免疫检测的常用指标，广泛用于血液肿瘤患者的免疫状态评估、疾病复发或转移风险预测及治疗指导等。为了更加深刻认识淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的作用，加强其检测过程的质量管理，促进其规范地应用于临床，由中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会牵头组织国内血液肿瘤和临床检验领域多位专家，制定了该专家共识。该共识介绍了淋巴细胞亚群的检测方法，归纳总结了其对血液肿瘤筛查、复发转移预警及预后评估、合并感染风险预警、造血干细胞移植后免疫重建监测与移植物抗宿主病预防、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗后监测、用药指导与疗效监测等方面的应用，并对血液肿瘤患者的监测方案与随访时机选择做出了推荐。淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会通信作者：杨再林，E-mail:804728092@qq.com武坤, E-mail:wukun@ydyy.cn 刘耀, E-mail:liuyao77@cqu.edu.cn本文已被本刊录用并于5月9日在中国知网发表，转载、引用请注明出处。知网首发网址：https://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20230508.1716.002.html原文阅读：淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，具有高度异质性。2022版《造血与淋巴组织肿瘤WHO分类》根据肿瘤细胞的来源，将血液肿瘤主要分为髓系增殖和肿瘤、髓系/淋系肿瘤和其他谱系未定白血病、组织细胞/树突状细胞肿瘤、B淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、T淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、NK细胞肿瘤、淋巴组织间质源性肿瘤、遗传性肿瘤综合征8个大类。血液肿瘤的发生、发展和转归与其患者机体的免疫功能，尤其是细胞免疫功能密切相关[1-2]。随着疾病的发生发展，免疫微环境也随之发生相应变化，进而引起外周血中各种免疫细胞亚群的改变。淋巴细胞是构成人体免疫系统的主要细胞，根据淋巴细胞表面的标记物和功能，淋巴细胞可以分为许多不同的群体。临床上常用流式细胞术（FCM）对外周血中的不同群体的淋巴细胞进行鉴别和计数，包括CD3+T淋巴细胞，CD3+CD4+辅助/诱导T淋巴细胞，CD3+CD8+抑制/杀伤T淋巴细胞，CD3-CD19+B淋巴细胞，CD3-（CD16+CD56）+NK淋巴细胞，简称为TBNK，及CD3+CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞（Treg）[3]等。本共识中将TBNK和Treg统称为淋巴细胞亚群。血液肿瘤作为造血干细胞异常的恶性肿瘤，疾病的多种因素会影响免疫细胞的产生、增殖及分化，使外周血的淋巴细胞数量与功能产生异常[4]，导致免疫功能失调[5-6]，因此对血液肿瘤患者进行规范的淋巴细胞亚群检测十分必要。为了规范淋巴细胞亚群检测中的实验方案、技术操作，使更多相关领域的临床、科研和实验室技术人员认识到淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者诊断、预后评估、治疗指导中的作用及注意事项，进一步促进其在血液肿瘤中的应用，中国医药质量管理协会医学检验质量管理专委会结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。 1淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的意义 1.1 血液肿瘤的发生、进展、预后与免疫功能的关系正常情况下，免疫系统对肿瘤细胞有监视和清除作用，维持机体内环境的稳定。免疫功能异常可能会导致细胞免疫和体液免疫失调，从而为肿瘤的发生和发展提供条件[7-9]；在病原体感染时免疫系统也会受到影响，当免疫功能下降时，肿瘤发生的风险增加[10-11]。文献报道急性白血病、B细胞淋巴瘤等患者常见外周血T细胞数量及CD4+/CD8+比值下降，并伴免疫功能紊乱[12-13]。Treg的主要功能是抑制自身免疫应答，维持免疫平衡，避免过度的炎症反应和自身免疫性疾病的发生，在免疫系统中发挥重要的负向调控作用。在血液肿瘤中，Treg一方面可以通过抑制对肿瘤细胞的免疫反应来促进肿瘤生长；另一方面也可通过抑制炎症和防止可能导致肿瘤发展的自身免疫反应而发挥保护作用。研究发现，多种类型的血液肿瘤患者Treg数量呈现上升趋势，可能会导致肿瘤免疫逃逸的发生[14-15]。此外，一些淋巴细胞产生的细胞因子，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等，在血液肿瘤患者中异常表达，进一步说明了机体免疫功能异常和血液肿瘤之间关系密切[16-18]。近年来，一些新型的免疫治疗策略也在血液肿瘤的诊疗中发挥日益重要的作用，例如采用免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗、双重特异性抗体治疗等[19-22]，这些治疗手段主要是通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，来达到治疗目的。1.2 淋巴细胞亚群在血液肿瘤中的临床意义淋巴细胞亚群在血液肿瘤中的临床应用主要包括以下方面。（1）部分血液肿瘤的筛查。血液肿瘤包括多种类型，其中一些类型可表现为特定淋巴细胞亚群的增殖和分化异常，通过淋巴细胞亚群检测可以对这些类型的血液肿瘤进行初筛。如急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞增殖性疾病（CLPD）等[23]。（2）肿瘤复发及转移预警及预后评估。Treg在多种血液肿瘤中比例增加，可以通过抑制免疫细胞杀伤作用来帮助肿瘤细胞逃脱免疫监视，并且与恶性程度、转移倾向、复发率等预后指标密切相关[24-26]。（3）合并感染风险预警。（4）造血干细胞移植治疗患者的免疫重建评估与移植物抗宿主病（GVHD）预防。Treg可以作为急性和慢性GVHD的生物标志物[27-29]。（5）CAR-T治疗患者的规范化管理和评估。（6）靶向药物、免疫抑制剂和化疗药物的疗效监测，治疗指导[30-31]。 2 淋巴细胞亚群检测的主要方法和结果报告 2.1 外周血淋巴细胞亚群检测的主要方法淋巴细胞亚群主要通过FCM进行检测。根据中华人民共和国卫生行业标准（WS/T 360-2011）《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[32]，FCM检测淋巴细胞亚群时，可以采用双平台法或单平台法。首选乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝真空管进行外周静脉血标本采集，并在24 h内进行检测。送检时间超过30 h应该采用肝素钠或枸橼酸钠抗凝，可在室温下稳定保存至48 h，若用双平台法，应采用同一标本进行白细胞计数和分类，则应该选择EDTA-K2作为抗凝剂。若送检时间超过48 h，应该使用流式细胞检测专用的样本保存液或样本保存管，可稳定保存至14 d。TBNK检测推荐的单抗为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56，Treg检测的单抗为CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T细胞标记为CD3+，CD4+T细胞标记为CD3+CD4+，CD8+T细胞标记为 CD3+CD8+，B细胞标记为CD3-CD19+，NK细胞标记为CD3-（CD16+CD56）+，Treg细胞的标记为CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127low/-。T细胞表面CD127的低表达与T细胞质内FoxP3的高表达具有良好的相关性[33-35]，且以CD127为标志进行检测方法明显优于以细胞质内FoxP3为标志的检测方法[36-38]，因此也可以使用CD127替代FoxP3进行Treg细胞的分析。上机检测前应采用配套的标准微球对仪器进行全程质控。推荐每管获取淋巴细胞数应不小于10 000个，得到的检测数据可通过调整荧光补偿、圈门等将各种不同表型的淋巴细胞亚群区分开[39-41]，进而得到各群细胞的相对比例及计算绝对数。推荐同时报告淋巴细胞亚群的百分比和绝对计数结果。2.2 外周血淋巴细胞亚群检测的结果报告通常应报告以下内容：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞的相对计数（百分比）和绝对计数（绝对值）、CD4+/CD8+比值、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。2.2.1 外周血淋巴细胞亚群检测的参考区间近年来已有多篇文献发布了我国不同地区、年龄、民族健康人群的TBNK、Treg细胞参考区间[42-46]。在2023年2月中华医学会健康管理学分会发表的《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》中公布了一项对我国九省（湖北、河南、广东、吉林、山东、山西、江苏、浙江、四川）20~60岁健康成人TBNK淋巴细胞参考区间的研究结果[45- 47]，可供参考，见表1。在2017年一项研究中发布了健康成年人外周血Treg细胞参考区间[48]，可供参考，见表2。由于Treg在多种疾病的临床治疗与疗效观察方面具有重要探讨价值，近年来许多国内实验室均报告了疾病观察组与健康对照组中外周血Treg细胞占CD4+T细胞的参考区间，如张宁等[49]报道了健康对照组参考区间为（4.52 ± 0.50）%，陈赛英等[50]报道了健康对照组参考区间为（6.85 ± 1.86）%，XU等[51]报道了健康成人的参考区间为（5.52 ~ 7.70）%，QIU等[52]报道了健康对照组参考区间为（5.70 ± 1.43）%。淋巴细胞亚群参考区间的建立受年龄、性别、种族、地域及仪器试剂等众多因素影响[47]，建议有条件的实验室可以针对本地区、本实验室检测体系等建立自己的参考区间及评价体系。调查健康人群淋巴细胞亚群的参考范围，建立95%可信区间的参考值区间，应满足每组至少120例健康样本数量[53]。此外，鉴于人员、仪器、试剂、方法、环境等诸多变化因素，实验室应对已建立的参考区间定期进行验证，每次验证应不少于20例健康样本，分布在参考区间外的测定值应不超过10%[32, 53]。若分布在参考区间外的测定值超过10%，则需要重新验证或考虑实验室分析程序、人群差异等其他因素。2.2.2 外周血淋巴细胞亚群检测报告的审核和发布进行淋巴细胞亚群检测的实验室都应该参加国家卫生健康委员会或省市级临检中心组织的室间质评，从而保证本室检测结果的准确性。在检测患者样品前，实验室人员应确认仪器状态正常和室内质控在控。在报告结果时，实验室人员要审核数据采集阈值的设置、抗体的组合方案、与实验结果相关的所有设门等，以排除样本异常和实验操作导致的检测结果异常。实验室人员还应根据检测结果的内部关系初步判断结果的可靠性。例如，数据应满足：CD3+% + CD19+% + （CD16+CD56）+% ≈（100 ± 5）%；CD4+% +CD8+% ≈ CD3+% （变化范围为5%~10%）[32]。若不满足，则需充分检查，必要时重复实验，在排除仪器、样品、操作等问题后如实报告检测结果，并需要重点分析该样本中是否存在异常表型的淋巴细胞，并用该样本制作血涂片镜检及进一步进行免疫分型对异常细胞进行鉴定，并及时与临床进行沟通。目前，由于国内没有针对Treg细胞检测项目的室间质评，因此应进行实验室间比对。 3 淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者中的应用 3.1 血液肿瘤的筛查当出现以下情况：（1）B或NK淋巴细胞显著增高；（2）CD3+CD4+CD8+T淋巴细胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴细胞明显增高；（3）CD4/CD8比值大于10:1或小于1:10；（4）CD3+%+CD19+% +（CD16+CD56）+%明显大于或小于（100 ± 5）%、CD4+%+CD8+%明显大于或小于CD3+%（变化范围为5%~10%），在排除标本、仪器、设门、试剂及反应性改变等因素后，需要考虑标本中存在异常淋巴细胞，并结合临床进行血液肿瘤的筛查。血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变见图1，血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径见图2。注：A表示T淋巴细胞群比例增高；B表示B淋巴细胞群比例增高；C表示NK细胞群比例增高；D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴细胞比例之和小于95%，存在不表达CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴细胞；F表示CD4+T、CD8+T淋巴细胞群比例大致正常；G表示CD4+T淋巴细胞群比例降低，CD8+T淋巴细胞群比例增高；H表示CD4+T淋巴细胞群比例增高，CD8+T淋巴细胞群比例降低；I表示中CD4+CD8+T淋巴细胞群比例增高；J表示CD4-CD8-T淋巴细胞群比例增高。图1 血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变注：A表示T淋巴细胞群比例增高；B表示B淋巴细胞群比例增高；C表示NK细胞群比例增高；D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴细胞比例之和小于95%，存在不表达CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴细胞；F表示CD4+T、CD8+T淋巴细胞群比例大致正常；G表示CD4+T淋巴细胞群比例降低，CD8+T淋巴细胞群比例增高；H表示CD4+T淋巴细胞群比例增高，CD8+T淋巴细胞群比例降低；I表示中CD4+CD8+T淋巴细胞群比例增高；J表示CD4-CD8-T淋巴细胞群比例增高。注：MICM表示形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学分型。图2 血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径3.2 血液肿瘤的复发、转移风险预警及预后评估当血液肿瘤患者外周血中出现CD4+和CD8T细胞减少，CD4+/CD8+比值降低，而Treg细胞明显增加时，提示肿瘤复发和转移的风险增加；CD3+、CD4+、CD8+T细胞的数量和比例与患者的完全缓解（CR）率、无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）呈正相关，而Treg的数量和比例与CR率、RFS和OS呈负相关[54-58]。在急性髓系白血病（AML）患者中，NK细胞数量和比例与CR率、RFS、OS呈正相关[59]，NK细胞数量减少的AML和多发性骨髓瘤（MM）可能有更差的预后[60-61]3.3 血液肿瘤合并感染风险预警感染是血液肿瘤患者的常见并发症[62]，CD4+T淋巴细胞在免疫防御中发挥关键作用。当CD4+T淋巴细胞绝对计数＜500个/μL时，血液肿瘤患者机会性感染风险会大幅升高[63]。CD4＋T、CD8＋T淋巴细胞数量低下的淋巴瘤患者，化疗后感染风险明显升高[64]。初诊时Treg细胞比例升高的血液肿瘤患者，其住院期间感染率明显增加[65]。3.4 造血干细胞移植后免疫重建监测及GVHD预防3.4.1 移植患者免疫重建监测造血干细胞移植（HSCT）后造血能力持久恢复与免疫系统功能调节密切相关，主要表现为免疫细胞数量的增加和细胞功能状态的恢复[66-67]。免疫重建受移植物来源、移植物数量与组分、预处理方案、胸腺功能等众多因素影响，但自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者外周血中TBNK、Treg细胞的重建规律基本相似。NK细胞恢复较快，一般移植后2~3周可恢复。CD3+CD8+T淋巴细胞一般移植后1~3月逐渐恢复，CD3+CD4+T淋巴细胞恢复通常需1年以上。CD3-CD19+B淋巴细胞移植后恢复时间不定，短至3个月，长至1年半以上。Treg细胞在移植早期通常比例非常低，移植晚期逐渐增多。3.4.2 移植患者GVHD预防GVHD是allo-HSCT患者需要面临的重要挑战。发生GVHD的患者，其疾病及移植相关死亡率大幅上升，尽早判断是否发生排异反应及抢先治疗是决定移植成败的关键。高炎症状态是GVHD的主要特点[68-69]。具有负调控炎症反应功能的Treg细胞随GVHD等级的增加呈下降趋势，有望成为预测急性GVHD（发生于移植后100 d内）和慢性GVHD（发生于移植100 d后）的特异性指标[70-71]。同时，植移后NK细胞迅速增加会促使炎症因子的大量分泌，从而促进急性GVHD发生[72-73]。因此allo-HSCT患者在早期植入阶段（输注后2~4周）、移植后早期阶段（输注后1~3月）、移植后晚期阶段（输注后3月以后）都建议行淋巴细胞亚群检测。3.5 CAR-T治疗患者的规范化管理和评估3.5.1 CAR-T细胞增殖监测CAR-T细胞免疫治疗目前已被用于治疗复发/难治性的血液肿瘤。定期监测CAR-T治疗患者体内的CAR-T细胞水平、肿瘤负荷、免疫功能（主要包括淋巴细胞亚群的比例和数量）和相关不良反应（细胞因子释放综合征、神经毒性等），是治疗后病情评估的重要手段[74-75]。患者回输CAR-T细胞后，可通过FCM监测外周血中CAR-T细胞的比例和数量，结果报告中一般包括总CAR-T细胞（占淋巴细胞）、CD4+CAR-T细胞（占T淋巴细胞）和CD8+CAR-T细胞（占T淋巴细胞）的比例和数量。有条件的实验室还可开展荧光定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）监测CAR-T细胞增殖水平。多项临床试验数据显示，体内CAR‑T细胞增殖水平与疗效显著正相关[76-78]。3.5.2 淋巴细胞亚群监测淋巴亚群检测也被推荐与CAR-T细胞监测同时进行[75]。有研究通过检测患者CAR‑T细胞回输后第15天的外周血淋巴细胞水平，发现低水平的淋巴细胞数（血液肿瘤患者常伴有免疫功能失衡，细胞免疫功能往往处于免疫抑制状态，对突变细胞的识别和杀伤能力下降[94-95]。检测初诊时患者的淋巴细胞亚群，能有效判断患者免疫功能的初始状态。3.7.3 放化疗、免疫治疗及靶向治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访放化疗、免疫治疗及靶向治疗期间患者可呈周期性改变[96]，可通过检测患者每个周期治疗前后的淋巴细胞亚群变化，来评估患者治疗期间免疫功能恢复情况及肿瘤复发和转移的风险。建议有条件的情况下，可在治疗结束后半年内每3个月跟踪检测，半年后每6个月进行随访。3.7.4 造血干细胞移植患者的淋巴细胞亚群监测与随访建议造血干细胞移植后患者的淋巴细胞亚群检测时间可在移植后第14天、第21天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年随访[97-101]。3.7.5 CAR-T治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访建议连续监测患者CAR-T细胞回输前1天、回输后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴细胞亚群变化情况，及治疗后2个月、3个月、6个月随访。见图3。图3 血液肿瘤淋巴细胞亚群检测与随访路径图 4 结语随着流式细胞术的广泛应用，用于免疫功能评价的淋巴细胞亚群检测在临床已广泛开展，通过TBNK、Treg这些指标，可以评估血液肿瘤患者免疫状况，为疾病诊断、分型，治疗方案的选择、化疗后感染预防，疾病转归等提供实验室依据，以及为血液肿瘤患者的个性化治疗提供参考。机体免疫功能是动态变化的，由于受年龄、药物、感染、营养、生理等众多因素的影响，存在较大的个体差异。不同疾病状态下淋巴细胞亚群检测结果也可能呈现出较大的差异，因此在参考范围的建立、报告结果解读等方面依然存在挑战。针对血液肿瘤患者，临床工作中需要建立患者个体化的淋巴细胞亚群基线水平，动态监测淋巴细胞亚群结果的变化趋势，并结合多种免疫功能检测指标，综合分析患者的免疫状态，为临床决策提供更加全面的参考。淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中具有重要的临床意义和广泛的应用前景，本共识的发布将有助于推动淋巴细胞亚群检测临床实践中的应用，促进血液肿瘤的诊断、治疗和预后评估水平的提高，期望能够为我国血液肿瘤的精准诊疗做出贡献。专家组组长：杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）执笔人（按姓氏汉语拼音排列）：陈双（重庆大学附属肿瘤医院）、程沈菊（昆明医科大学第一附属医院）、蒋亭亭（重庆大学附属肿瘤医院）、李轶勋（昆明医科大学第一附属医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）、彭余（重庆大学附属肿瘤医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）专家组成员（按姓氏汉语拼音排列）：陈曼（北京陆道培医院）、陈朴（复旦大学附属中山医院）、池沛冬（中山大学肿瘤防治中心）、蒋能刚（四川大学华西医院）、李力（南部战区总医院）、李珍（南方医科大学南方医院）、李国盛（山东大学齐鲁医院）、李智伟（新疆维吾尔自治区人民医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）、刘艳荣（北京大学人民医院）、马骁（苏州大学附属第一医院）、毛霞（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、倪万茂（浙江省人民医院）、冉隆荣（重庆大学附属肿瘤医院）、任方刚（山西医科大学第二医院）、王卉（河北燕达陆道培医院）、王慧君（中国医学科学院血液病医院）、王剑飚（上海交通大学附属瑞金医院）、翁香琴（上海交通大学附属瑞金医院）、吴丽娟（西部战区总医院）、吴雨洁（江苏省人民医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、徐翀（上海市临床检验中心）、杨军军（温州医科大学检验医学院）、杨顺娥（新疆医科大学附属肿瘤医院）、杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）、岳保红（郑州大学第一附属医院）、张爱梅（中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院）、张会来（天津医科大学肿瘤医院）、赵明宇（重庆大学附属肿瘤医院）、朱杰（大连医科大学附属第二医院）、朱莉（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、朱明清（苏州大学附属第一医院）、朱明霞（北京大学第三医院）、郑金娥（华中科技大学同济医学院附属协和医院）、周辉（湖南省肿瘤医院）利益冲突声明所有作者声明无利益冲突

在新型冠状病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia, NCP）的各个诊疗方案中，我们仍然能够发现与流式细胞术相关的检测得到了不少认可与建议，那么，究竟流式细胞术在新型冠状病毒感染的诊断与治疗中，有哪些用途呢？这些基于流式的检测又是否对临床具有实际意义的帮助呢？我们从现有的已经官方发布的新型冠状病毒肺炎的诊疗方案中，寻到了建议进行流式相关检测的依据。即，对于新型冠状病毒感染，在有条件的情况下，建议进行淋巴细胞亚群和细胞因子的检测。针对已确诊的2019-nCoV病人建议留观后第3、5、7天及出院时依据病情可，若有条件可检查血细胞，肝肾功能，肌酶+肌红蛋白，凝血、CRP；第5-7天若有条件可复查PCT及TB淋巴细胞亚群11项。而进行淋巴细胞亚群和细胞因子的检测，最常用的检测方法即流式细胞术。由于对2019-nCov的机制尚在研究中，我们参考了与之相似性很高的SARS的诊治方案和研究结果，来共同探讨一下这些检测的临床意义。其他研究显示，在SARS治疗过程中，糖皮质激素的应用会使T淋巴细胞及亚群发生不同程度减低，因此，外周血T淋巴细胞亚群的动态监测，有助于SARS-Cov致病机制的研究和诊断，并对于指导治疗（尤其糖皮质激素应用的试剂、剂量等）以及提示预后具有重要价值。3还有很多研究揭示了细胞因子在冠状病毒感染中扮演的重要角色。Chen J等人在2010年发表的，利用BALB/c小鼠模式，对SARS-CoV感染的细胞免疫反应进行的研究显示，细胞因子在病毒感染后的早期（如TNF-α, IL-6, 趋化因子CXCL10, CCL2, CCL3, CCL5等）和疾病进程中（如 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-5, IL- 6, 趋化因子CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL3和CCL5等）均有增高，这些细胞因子的增高，要么与早期炎症细胞的募集相关，要么与病毒清除，肺部损伤肺部炎症产生相关。5另有研究认为，SARS感染后，机体会因为受到较强的外界刺激而产生过度免疫，出现细胞因子风暴。而细胞因子风暴会造成的肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞的弥漫性损伤，引发急性呼吸急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）。6最新发表在Lancet上的针对2019-nCoV 感染的研究揭示，感染2019-nCoV的患者有大量的IL1B、IFNγ、IP10和MCP1增高，可能与激活Th1细胞免疫反应有关。然而，2019-nCoV感染也启动了抑制炎症的Th2细胞因子（如IL4和IL10）分泌的增加，这与SARS-CoV感染还是不同的。进一步比较ICU患者与非ICU患者，发现ICU患者血浆IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1A、TNFα的浓度均高于非ICU患者，提示细胞因子风暴与疾病严重程度相关（图2）。7由此可见，检测病毒感染者的细胞因子的情况，有助于了解机体在冠状病毒感染后的一系列免疫应答状态，为疾病治疗和预后判断提供重要依据，同时也为探索新型冠状病毒的致病机制提供更多的线索。当然，对于新型冠状病毒的研究仍在继续，流式细胞术能贡献的检测指标也远不止淋巴细胞亚群和细胞因子，在条件允许的情况下，纳入更多有潜在意义的检测指标，也很有可能为探索新型冠状病毒感染的更优诊疗方案，以及致病机制研究带来新的助益和指引。参考文献1. 新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）2. 北京协和医院关于 “新型冠状病毒感染的肺炎”诊疗建议方案（V2.0）3. 传染性非典型肺炎(SARS)诊疗方案[J].现代实用医学,2004(02):119-126.4. He Z, ZhaoC, Dong Q, et al. Effects of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus infection on peripheral blood lymphocytes and their subsets[J]. International Journal of Infectious Diseases, 2005, 9(6): 323-330.5. Chen J, Lau Y F, Lamirande E W, et al. Cellular Immune Responses to Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) Infection in Senescent BALB/c Mice: CD4+ T Cells Are Important in Control of SARS-CoV Infection[J]. Journal of Virology, 2010, 84(3): 1289-1301.6. 张艳丽, 蒋澄宇. 细胞因子风暴:急性呼吸窘迫综合征中的主宰生命之手[J].生命科学,2015,27(05):554-557.7. Huang C, Wang Y, Li X, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China[J]. The Lancet, 2020.

首先感谢以下同仁向本文提供资料和信息：Sherrie女士，李增强先生；科瑞斯生物孙胜虎；微信公众号《竞逐IVD原料江湖》版主古井秋筠。——01—— 流式细胞术市场有多大？新的报告预估全球流式细胞术市场将从2022年的52亿美金增长到2027年的76亿美金。往前一年，则是估算2021年43亿美金，增长到2026年为63亿美金。司空见惯的市场预测，都是画一个基数，拍一个年复合增长率（这里是8%左右）。但，2022年回看估算的2021年43亿到2023年估算的2022年的52亿，增长20%，这其中发生了什么？其后能维持或者不能维持的理由又是什么？——02—— 大陆流式细胞术市场有多大？首先，终端销售额，流通商数据，制造商数据，大相径庭，不能混为一谈，甚至重复计算。累加制造商出货口径，大陆流式细胞市场容量大概在40亿左右。如果采信全球报告数据，按我们占全球10%~15%计算，则是5.2亿~7.8亿美金。——03——大陆流式公司有多少？不完全不确切统计，大陆流式公司生产及研发分布如下图。表中共收录140家公司，其中35家公司生产流式细胞仪或（和）微球流式细胞仪。看到表格，多数人的第一反应是“卷”——此词似乎已经成了人们的口头禅。生而为人，卷为宿命。什么事情不卷？一个事但凡少人做，原因不外乎难如乔（戈里）峰，想做做不到；或是轻如鸿毛，做也没意思。卷也符合事物发展的逻辑。生产商希望原料商卷以减低成本，终用户希望生产商卷以丰富选择。在卷的世道选择同卷，是乐观于百舸争流，无畏浪遏飞舟。在不卷的时候选择入，是坚定了俏不争春，守望山花烂漫。共性是底牌一张，你与众不同的是什么？应用、性能、价格、渠道还是人员？否则就是与快乐的小猪一起等风来。——04——光谱流式是流式发展的未来吗？是的，不然呢。至于质谱流式，其核心是质谱。让细胞流动起来并加上标签，本质上就是进样器。无论是光谱流式，还是质谱流式，过去一直执着于多色“军备竞赛”。其实，多色的应用面和话语权从来都在少数专家手上，懂的人不觉得正在使用的分光流式有什么不好；不懂的人如笔者，以为40色以上的应用在仪器层面上形成不了产业规模的需求。把目光放到20色以下——光谱流式把10色，15色，20色的细胞分群做得漂亮，简单上手，而且价格不比分光型流式贵，你会选择谁？当然，光谱流式高度依赖荧光染料（另文分析），目前染料倒是层出不穷，不谈价格的优越就是耍流氓。更重要的是，荧光染料最大发射波长和发射光谱的批间波动，用于分光型流式倒是无所谓，反正是带宽检测，但是用到光谱流式就不是一回事，这是亟待解决的问题。光谱流式区分两种发射光谱接近的荧光染料。图片由李增强先生提供——05—— 微球流式走向何方？参见 《发光向左，荧光向右：微球流式荧光未来在何方？》与传统流式相异，微球流式以微球为载体，以编码微球为特色，以同时多参数分析为优势。如果说光谱流式扩展了流式的生存空间，微球流式则拓宽了流式的应用边界。流式市场将因微球流式的日益普及而加速增长——增速8%还是20%，全村人希望所在！流式需要的编码微球，国内已经有10余家公司可以提供，并且多数是磁性微球，重数基本满足目前临床多参数分析的需要。当下的难点在于发现临床价值明显的项目，实现多而不费，同时相比单检速度快的项目有更好的性价比。——06—— 多联检细胞因子还有继续增长的空间吗？一般而言，流式临床项目普及，国内延循国外。除了细胞因子以外。目前，已有9家公司注册了29个细胞因子联检试剂盒——联检需要注册而非备案无需多言。这其中又涉及34个细胞因子及其它可溶性蛋白受体。求多求新的组合方式，借着”细胞因子风暴“在新冠三年带来大陆流式市场的一个高潮。但，医保控费的压力，以及疫情后临床选品趋于理性的趋势，让越来越多的人看到：这么多因子放在一起，价值何在，是否都不可或缺?同为促炎或同为抑炎的结果矛盾，是机制没有理清还是实验结果的误差？仅仅因为是可溶性受体合并为一个试剂盒，而对应基本不会同时发生的疾病，这样的联检意义何在？笔者有理由相信，接下来将是微球流式细胞因子的一个调整阶段，调整的结果是继续增长还是如同FITC 516nm之后的发射表现，见仁见智。——07—— 国内抗体原料厂家的生存空间何在？《竞逐IVD原料江湖》曾经发布过名单国内IVD抗原抗体厂家分布其中，能够提供CD分子抗体的公司不多，其中还有些是国外进口分装。据内部人士透露，大陆能够大规模生产CD分子抗体的公司不超过3家，至多5家。至于可溶性蛋白检测的抗体对和抗原，理论上化学发光、酶联免疫等厂家都可以提供，但至少在目前，大家的注意力还没有转移过来，甚至在网站主页上都不屑于一提。当然，国产绝对不应该成为厂家的第一甚至唯一优点，稳定的质量才是自产的生存基本，一票否决。顺便说到，国产化的定义是什么？是国内品牌，那么大家只好也不要出口。是国内设厂，这对国际大品牌来说日益成为常态。是国内出厂，那么原料依赖进口是不是另外一种形式的媚外？笔者会希望，如果我们以国产化为特点，以自主创新为优势，那么80%以上的成分都应该产自中华大地。图片来自网络

前言 随着人类对生物学领域深入探索和科技创新的不断发展，目前越来越多的研究院所和生物制药公司将细胞水平的功能性研究、模型建立及药物筛选做为一个重要的研究/研发手段。而高内涵成像分析系统就为这种细胞水平的研究提供了集高分辨率、自动化、智能化及海量信息为一体的新的检测平台。干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体干细胞。正是干细胞的这种特性，为细胞生物学的研究提供了更有力的永生化的稳定细胞株。干细胞水平的研究比在普通的细胞株提供了更接近临床相关性的生理学信息；并且比原代细胞相比更容易获得，且具有更好的实验重复性。 干细胞的研究与其他细胞水平的研究有一些相似之处，但其关键的不同点在于在干细胞的研究过程中干细胞的分化。干细胞水平的实验比传统的单线性/单参数的实验具有更多的检测目标，包括其分化能力、分化过程、分化类型及不同类型的量化分析统计等。高内涵成像分析系统以其自身的高分辨率、多参数及智能化分析的特性，恰如其分的满足了干细胞研究的以上需求，而高内涵成像系统的自动化和高通量的特点又以海量的有效数据加速了该研究的过程。 利用高内涵成像分析系统可完成干细胞研究的自动化图像获取及多参数分析，目前常用的全能性干细胞分化研究主要有三类：造血细胞、神经细胞和诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPS）来源的心肌细胞（图1）。图1：全能干细胞分化层次图应用实例1． 神经祖细胞向神经球分化研究冷藏保存的神经祖细胞（StemCell Technologies, mouse Cells）培养在6孔板内，在培养基中加入不同的生长因子，培养6天后通过ImageXpress Micro对每孔内神经球进行无标记相差成像，并对的神经球的面积进行自动化定量分析。结果如下（图2）： 图2：神经球无标记检测及分析（ImageXpress Micro 20X 相差物镜）2． 神经干细胞向神经元及胶质细胞分化研究神经干细胞在加有EGF（表皮生长因子）和bFGF（成纤维细胞生长因子）的培养基中培养1-2天，然后在分化培养基中培养12-14天。加入EPO（促红细胞生成素）后，检测为神经球向神经元及胶质细胞的分化情况。ImageXpress Micro进行自动化图像获取，运用细胞分类（Cell Scoring）模块进行神经元/胶质细胞阳性率分析，运用神经生长（Neurite Outgrowth）模块进行神经元突触长度及数量分析。结果如下（图3）：图3：神经干细胞分化检测及分析。图（上）表示加入（左）及不加（右）神经细胞的分化图片；图（下）表示不同条件下神经元细胞的阳性率（左）及神经元突出的长度（右）。（ImageXpress Micro 20X物镜）3． 造血祖细胞向骨髓细胞及血细胞分化研究人源CD34+造血祖细胞培养在96孔板中，加入多种不同的造血细胞因子组合（SCF+Flk3+TPO/SCF+IL-3+GM-SCF）后，通过检测CD45和CD15两种标记物在细胞内的表达量，统计分析不同造血细胞因子组合对造血祖细胞的自我更新能力及骨髓细胞分化能力的变化。结果如下（图4）：图4：检测细胞内CD45和CD15的阳性率，评价造血祖细胞在不同条件下的自我更新能力及定向分化能力4． 诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPS）向心肌细胞分化研究iPS细胞（Celprogen）在专用培养基中培养3-7天，同时检测7种不同标志物的表达量，以判断心肌细胞分化及成熟的状态。下图（图5）中显示Oct4（干细胞标记物）和a-Actinin（心肌细胞标志物）在细胞内的表达情况：图5：iPS细胞分化情况（ImageXpress Micro 20X 物镜）5． iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验临床前安全性评价是药物研发过程中非常重要的环节，早期的心脏毒理学研究将会大大降低在进入临床研究阶段后因药物毒性带来的投入风险。iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验为药物心脏毒性评价提供了一个高效的体外细胞水平的检测方法。心脏跳动可通过传统电生理的方法来检测，用高内涵成像分析系统来进行检测及分析是一个全新的挑战。Molecular Devices公司最近一代的高内涵成像分析系统ImageXpress Micro XL以其最新一代的检测器sCMOS（采样频率可达100pfs）和自定义模块分析功能，完全可出色完成心肌细胞跳动实验的快速检测及分析要求。iPS细胞来源的心肌细胞单层培养在96或384孔板中，心肌细胞会自发跳动同步收缩。加入Calcein-AM染料孵育10min后，撤掉培养基，再加入不同浓度的化合物，置于ImageXpress Micro XL活细胞培养装置中，检测心肌细胞跳动频率的变化。结果如下（图6）：图6：iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验（ImageXpress Micro XL 20X 物镜）总结 干细胞研究作为一种复杂的细胞水平检测模型，需对干细胞的生长、增殖、分化能力、分化类型及状态等多种参数进行检测及定量分析，为疾病治疗研究及药物研发提供了更有效的研究手段。Molecular Devices公司的ImageXpress高内涵系统提供了集高分辨率、自动化、智能化及海量信息为一体高内涵成像分析系统完全解决方案，可满足以上研究需求（图7）。图7：Molecular Devices公司针对干细胞研究的高内涵成像系统完全解决方案

博士Eric T. Ahrens表示，起初我们想观察这种技术联合作用对于新型细胞疗法的效果，而我们可以通过反馈细胞活性、改善剂量等途径来改善细胞疗法的效率；当前并没有有效的方法对人类机体中的细胞进行成像，早先可以利用基于金属离子的血管MRI对比制剂和放射性同位素来成像，但是其在体内就不能够对细胞进行有效区分了。hz-E10044 human soluble cluster of differentiation 28,sCD28 ELISAkit 人可溶性CD28(sCD28)检测试剂盒 hz-E10045 Human lymphocyte factor ELISAkit 人淋巴细胞因子检测试剂盒 hz-E10046 Human thymus activation regulated chemokine,TARC ELISAkit 人胸腺活化调节趋化因子(TARC/CCL17)检测试剂盒 hz-E10047 Human Neural cell adhesion molecule ligand 1,NCAM-L1 人神经细胞粘附分子配体1(NCAM-L1/CD171)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10048 Human Cobra venom neuronal protective factor,CVNPF ELISAkit 人神经保护因子(CVNPF)检测试剂盒 hz-E10049 Human soluble Tumor Necrosis Factorαreceptor,sTNFαR 人可溶性肿瘤坏死因子α受体(sTNFαR)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10050 Human soluble cytokine receptor,sCKR ELISAkit 人可溶性细胞因子受体(sCKR)检测试剂盒 hz-E10051 Human soluble Factor-related Apoptosis ligand,sFASL/Apo-1 人可溶性凋亡相关因子配体(sFASL)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10052 Human inhibitor of apoptosis,IAP ELISAkit 人细胞凋亡抑制因子(IAP)检测试剂盒 hz-E10053 Human colony-stimulating factor,CSF ELISAkit 人集落刺激因子(CSF)检测试剂盒 hz-E10054 Human monocyte interferon gamma inducing factor,MIGF 人γ干扰素诱导单核细胞因子(MIGF/CXCL9)检测试剂盒 ELISAkit hz-E10055 Human Interferon inducible T-cell Chemoattractant,I- 人干扰素诱导T细胞趋化因子(ITAC/CXCL11)检测试剂盒 TAC ELISAkit hz-E10056 Human cluster Of differentiation,CDl4 ELISAkit 人CD14分子(CDl4)检测试剂盒 hz-E10057 Human apoptosis inducing factor,AIF ELISAkit 人凋亡诱导因子(AIF)检测试剂盒 hz-E10058 Human leukocyte common antigen,LCA/CD45 ELISAkit 人白细胞共同抗原(LCA/CD45)检测试剂盒 hz-E10059 Human cluster Of differentiation,CD4 ELISAkit 人CD4分子(CD4)检测试剂盒 hz-E10060 Human Placenta Cadherin,P-cad ELISAkit 人P钙黏蛋白/胎盘钙黏蛋白(P-cad)检测试剂盒 hz-E10061 Human Keratinocyte Growth Factor,KGF ELISAkit 人角化细胞生长因子(KGF)检测试剂盒 hz-E10062 Human Platelet-Derived Growth Factor-BB,PDGF-BB ELISAkit 人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)检测试剂盒 hz-E10063 Human CXC-chemokine ligand 16,CXCL16 ELISAkit 人CXC趋化因子配体16(CXCL16)检测试剂盒 研究者表示，这项研究中他们利用全氟碳化合物(PFC)示踪技术和非侵入性磁共振成像成技术进行结合来直接检测标记细胞的氟原子，自然状态下氟原子在机体中的浓度极低，这就可以利用MRI技术对氟标记的细胞进行观察；而本文中研究者首次通过患者的白细胞制备了被修饰和标记的树突细胞，随后研究者将这些细胞注入到4期结直肠癌患者的机体中来刺激机体抗癌T细胞免疫反应。

文章来源：中华检验医学杂志, 2023,46(08)：792-801.作者：国家医学检验临床医学研究中心（中国医科大学附属第一医院） 中华医学会检验医学分会 国家卫生健康委临床检验中心 中华检验医学杂志编委会摘要流式细胞术在临床血液及免疫相关疾病的精准诊治中具有重要作用。随着流式细胞仪普及程度的不断提高，临床实验室开展流式细胞术检测，服务临床诊疗的能力和水平也逐渐提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和需求，加强质量控制，结合近年来国内外相关领域研究进展，对2013年发表的《流式细胞术的临床应用共识》进行更新，制定此共识。随着医学的进步及疾病精准化诊治需求的增加，我国临床实验室流式细胞仪的普及水平得到提高，开展流式细胞术检测服务临床诊疗的能力和水平亦不断提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和临床检验需求的更新，我们延续2013年《流式细胞术临床应用的建议》［ 1 ］的编写初衷，并在此前版本的基础上，经专家组讨论，适时对相应内容进行修订和扩增。本共识由国家医学检验临床医学研究中心、中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委临床检验中心及中华检验医学杂志编委会组织专家进行讨论撰写并发布。一、流式细胞仪及器材的准备（一）流式细胞仪的选择2017年12月，我国颁布《流式细胞仪》国家行业标准［ 2 ］，规定了流式细胞仪的产品分类、技术要求、试验方法及使用方法等。在临床检验工作中，应选择有临床注册证的流式细胞仪，满足检测灵敏度和收集速率等的要求；根据检测项目所需参数，确定适宜激光器和检测器，使其检测参数与临床使用的荧光抗体匹配；考虑操作的简便性和兼容性，以及未来可升级满足新检测需求的空间；兼顾临床实验室场地、仪器维护、人员培训、试剂和耗材供应稳定性、售后服务等因素。（二）流式细胞仪的设置1.仪器质控：流式细胞仪的仪器性能与检测结果准确与否密切相关。为保证仪器运转正常，每日开机流程后应运行仪器的质控微球等，保证仪器处于最佳性能状态，变异系数小于仪器软件中的可接受范围。如有可接受范围外的偏离，应及时进行校准和维修。2.仪器维护：（1）环境温湿度可影响激光器、光纤和棱镜等光学元件，使用时可参考仪器说明书推荐的温湿度，推荐室温18~25 ℃；（2）灰尘可损伤激光器和光学元件，降低检测的灵敏度，日常工作中注意仪器的整洁，清洁频率依据环境而定；（3）使用1%的次氯酸或75%医用乙醇每日清洁进样针，宜定期（或按需）清洁流动室，避免黏性大和聚集成团的细胞堵塞进样针；（4）过滤器影响荧光信号的稳定性和压缩空气的供应，在需要时排除气泡并定期更换；（5）鞘液桶、废液桶需维持密闭性，定期清洁和更换；（6）电脑数据定期备份，存储数据不超过硬盘的一定容量，避免损坏和拖慢系统性能；（7）定期对仪器性能进行全面评估、校准和保养，并应出具书面报告。3.补偿设置：传统的多色流式细胞仪存在荧光溢漏，合适的补偿是获得可靠数据的关键［ 3 , 4 , 5 ］。（1）补偿对照可以使用新鲜血细胞制品（更贴近待检测细胞）和商品化的荧光微球（操作简便）。使用荧光微球建立的补偿，宜用待检细胞进行优化；（2）如流式细胞仪具备“自动补偿”功能，可采用自动补偿进行条件设置并进一步手动优化；（3）同一通道检测的相似荧光，建立补偿时不能互相替代，如PE-Cy5、PerCP、PerCP-Cy5.5等，应分别建立补偿；（4）补偿设置的染色处理过程宜与待测项目一致，细胞膜染色和经过固定、破膜的胞浆（或胞核）染色会有不同，建议分别设置补偿；（5）补偿矩阵并非永久适用，当建立新的实验或仪器性能出现允许范围外的变化，应重新建立补偿。（三）移液器、离心机、标本前处理系统等的维护及定期校准上述仪器除日常清洁维护，应按照实验室认可标准（例如ISO15189）的相关要求，定期对不同量程的移液器、离心机和标本前处理系统的性能进行全面评估和校准，并出具书面报告。共识1 临床检测选用的流式细胞仪应有国家有关机构核发的注册证。建议根据临床实验室及流式细胞术检测项目的特点，选择技术性能符合使用要求的流式细胞仪，宜同时考虑相关技术培训及售后服务等。流式细胞仪的使用应注意每次检测过程中的仪器质量控制，应按要求进行维护保养和校准评估。流式细胞术检测相关的器材也应注意日常清洁维护和定期校准评估。推荐强度：强烈建议。二、流式细胞术检测试剂（一）荧光抗体的选择和搭配流式细胞术使用的抗体应符合国家相关标准［ 6 ］。在搭配多色抗体组合时需要考虑［ 5 ］：（1）流式细胞仪的检测通道特性：根据流式细胞仪的配置，选择可使用的荧光抗体；（2）荧光染料本身的强弱、荧光标记物的稳定性、荧光素分子大小、荧光抗体克隆号等，例如同一荧光标记物，不同克隆号抗体对某些抗原的检测效果也会出现差异［ 7 , 8 ］；（3）待测抗原表达强弱：弱表达抗原选择强荧光标记，强表达抗原可选择弱荧光标记；（4）尽量避免光谱重叠多的荧光染料搭配如PE-Cy5和APC等，对细胞共表达的抗原进行染色时，尽量避免选用串色和荧光溢漏大的通道［ 5 ］。（二）抗体的滴定设置通过抗体滴定计算染色指数（stain index，SI），判断荧光染色后阴性群和阳性群的分离效果，是确定最佳抗体使用浓度的重要方法。SI计算公式为：［中位荧光强度（median fluorescent intensity，MdFI）阳性群-MdFI阴性群］/（2× rSD阴性群）［ 5 ］。SI受荧光强度、抗原表达强度、抗体结合力及流式细胞仪设置等影响［ 5 ］。在更换抗体或抗体批号之前，宜进行抗体滴定以确定最佳浓度，避免因抗体浓度不合适，导致弱表达抗原检测不到或强抗原超出检测限。（三）对照的设置和选择选择适宜的对照是流式细胞术检测中正确获取和分析数据的基础［ 5 ］。“荧光减一”（fully stained minus one fluorochrome或fluorescence minus one，FMO）对照是目前确定阴性和阳性细胞群cutoff值的最佳对照，对于弱阳性或阳性细胞比较少的情况尤为适用，可排除交叉干扰等；同型对照可评估Fc受体或蛋白的交叉反应，排除非特异性染色。生物品对照如血液制品质控，可根据制品的cutoff值来确定检测样品的阴阳性。（四）其他试剂红细胞裂解是流式细胞术检测血液白细胞或骨髓有核细胞时不可或缺的过程［ 9 , 10 ］，宜选择相应品牌的裂解液或自行配制。由于裂解液可对粒细胞和单核细胞等造成不同的影响，也会影响染色的效果［ 9 , 10 ］，建议根据检测目的不同进行比对，择优选用。细胞的稀释、洗涤和重悬需使用缓冲液或稀释液［ 11 , 12 , 13 ］，宜依据反应的最适pH值（如中性）、副作用（如磷酸盐缓冲液会导致一些激酶反应的抑制）、可能的络合作用、对光谱的吸收以及成本等进行选择［ 13 ］。日常工作中可选用商品化的缓冲液或PBS，依据检测目的确定是否添加胎牛血清/牛血清白蛋白，以及是否加入叠氮化钠用于保存。此外，细胞培养基和医用生理盐水等也可用作稀释液和缓冲液。不同于细胞表面（细胞膜）的染色，对细胞内（细胞浆或细胞核）的分子进行染色，需要经过“固定”（如甲醛等），保持目标抗原的位点和结构，再通过“破膜”（如Triton-X）使抗体进入细胞。不同品牌破膜剂对细胞内染色有不同程度的影响，建议根据检测效果进行比对，择优选用［ 14 ］。共识2 流式细胞术检测中，建议合理选择和搭配所需荧光抗体，通过滴定确定抗体使用的最佳浓度，并合理选择和设置对照；染色过程中，选择适宜的红细胞裂解液、缓冲液以及固定破膜剂。推荐强度：强烈建议。 三、标本的采集、存储、运输及制备（一）外周血标本（1）患者准备：流式细胞术检测同其他项目外周血采集无异，因脂血等会对检测结果造成影响，采血前尽量清淡饮食；（2）抗凝剂选择：同时进行白细胞分类和流式细胞术检测时，建议使用乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝真空管进行标本采集，室温保存，尽快送检［ 15 ］。如进行T细胞功能的检测如IFN-γ分泌时，因EDTA可螯合钙离子，影响T细胞激活效果，建议采用肝素钠等抗凝。（二）其他标本骨髓标本、造血干细胞采集物的抗凝剂选择可以参照外周血。脑脊液标本一般不需要抗凝剂，渗出液性质的浆膜腔积液常有凝块，建议抗凝处理。因体液标本久置会导致细胞破裂，影响细胞计数、分类等检测结果，所以需要尽快送检。一般要求在采集后立即送检［ 16 ］，如使用特殊保存剂，可以适当延长送检时间［ 17 ］。样品应离心浓缩调整细胞浓度后进行染色。对于淋巴结等组织标本，一般不需要抗凝剂，活检取材后应尽快送检。标本可经过物理研磨法和酶消化法获得单细胞悬液，调整细胞浓度后进行细胞染色。体外培养的细胞（如胞内细胞因子染色时，需刺激后加入蛋白转运抑制剂），根据细胞储存状态（冻存与否）、细胞特性（贴壁或悬浮），进行复苏或消化、洗涤，调整细胞浓度后染色。（三）标本制备流式细胞术标本的制备，需考虑新鲜度和检测项目的要求。（1）细胞浓度：一般不建议超过1×106 cells/ml（参照试剂说明书）；（2）全血体积：一般建议50~400 μl［ 18 ］；（3）活细胞染料：常规新鲜外周血可以不使用活细胞染料，但造血干细胞计数、白血病微小残留病（minimal residual disease，MRD）筛选与监测等，建议添加活细胞染料如7-AAD等，以去除死细胞的干扰；（4）细胞染色、固定与破膜：需考虑细胞膜染色、细胞浆染色和细胞核染色的区别，选择相应适宜的固定破膜剂；（5）染色温度：一般室温染色即可［ 18 ］，但造血干细胞染色、使用某些固定破膜剂时，要求在融冰或4 ℃完成；一些特殊项目（如中性粒细胞吞噬二氢罗丹明辅助诊断慢性肉芽肿）需经过37 ℃孵育；（6）染色时间：受荧光抗体和染色体积影响，一般建议10~30 min［ 18 ］。根据目的抗原的位置分布不同（细胞膜、细胞浆和细胞核），染色时间不同，可依据说明书及检测需求，探索最优染色时间。另外，如染色体积在200 μl以上，可适当延长抗体孵育时间［ 18 ］。共识3 建议根据检测标本的种类及实验需求的差异，选择适宜的抗凝剂，采样后应尽快送检；样品制备时确保细胞浓度在合理的范围内，根据检测项目的特性，选择最优的染色方法和染色条件。推荐强度：建议执行。四、流式细胞术的临床应用（一）淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析是目前流式细胞术临床应用范围最广泛的项目，可获得淋巴细胞亚群，包括CD3+总T细胞、CD3+CD4+辅助T细胞（Th）、CD3+CD8+细胞毒性T细胞（Tc）、CD3-CD19+B淋巴细胞和CD3-（CD16+CD56）+NK细胞的相对百分比（%）和细胞绝对值（cells/μl），在临床诊治中发挥了重要作用。国家卫生健康委员会发布的《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》［ 19 ］（该行标处于修订过程中），以及《流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用共识（2019版）》［ 20 ］和《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》［ 21 ］等，对此项目的开展及应用具有重要的指导意义。（二）免疫细胞精细分型1.淋巴细胞：（1）T细胞：对T细胞的精细分型，根据细胞表面标记区分T细胞，如调节性T细胞（Treg）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、Th1、Th2、Th9、Th17和Th22［ 22 ］，初始（naive）、效应（effector）、效应记忆型（effector memory）和中央记忆型（central memory）亚群、活化细胞亚群等［ 22 , 23 , 24 , 25 ］。（2）B细胞：根据CD27、IgD、CD24、CD38、CD5等表达，可以将B细胞分为不同亚群［ 23 ， 26 , 27 , 28 , 29 ］。（3）NK细胞：根据CD16和CD56表达的不同，可以将NK细胞细分为不同亚群 ［ 23 ， 30 , 31 ］。目前精细分型的方案并未统一， 表1 汇总了文献报道的常见淋巴细胞精细分型方案，可供参考。2.髓系细胞：（1）粒细胞：根据CD45和SSC，CD13和CD16以及CD66、CD123、CD203c、HLA-DR等的表达不同，可以将粒细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞［ 23 ， 30 ］。（2）单核细胞：根据CD45和SSC，CD13、CD14和CD16的表达不同，可以将单核细胞分为不同亚群［ 23 ， 30 ］。（3）树突状细胞（dendritic cell，DC）：使用系列抗原（lineage：CD3、CD14、CD16、CD19和CD56）排除T细胞、B细胞、NK细胞、单核、粒细胞等，再根据CD123、HLA-DR、CD11c、CD1c、CD141等的不同表达，可以将DC细胞分为不同亚群 ［ 23 ， 30 ， 32 ］。（4）髓源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）：根据CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD33等指标的表达，可以将MDSC分为3个不同亚群 ［ 33 , 34 ］。 表1 汇总了文献报道的常见髓系细胞精细分型方案，可供参考。（三）白血病免疫表型分析及微小残留病监测1.白血病免疫表型分析：（1）急性白血病：对于急性白血病免疫分型，2013版《流式细胞术临床应用的建议》［ 1 ］及《四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（2015年版）》［ 35 ］均有详细介绍。在上述《建议》和《共识》中，对白血病免疫表型分析均主要推荐采取“2步法”，但对于某些跨系别表达的抗原或是混合表型的白血病，可能会因为检测抗原不足导致漏检的现象。国家卫生健康委发布的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗规范（2018年版）》［ 36 ］和《儿童急性早幼粒细胞白血病诊疗规范（2018年版）》［ 37 ］，对于急性白血病免疫分型，建议使用多色流式细胞仪，至少检测上述《诊疗规范》提及的35个CD分子，视情况增加更多抗原检测，同时检测的CD分子越多，准确性相对越高。（2）慢性淋巴细胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）/非霍奇金淋巴瘤：流式细胞术检测的抗原可以参考《流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识（2017版）》［ 38 ］。但是对于B淋巴细胞，由于慢淋/非霍奇金淋巴瘤的细胞可能来源于淋巴结的多个结构部位［如DLBCL分为生发中心型GCB型、非生发中心non-GCB型和活化B细胞样（ABC）型］，需注意其免疫表型的多样性［ 39 ］；对于T细胞，如出现异常免疫表型或TCRVβ的单克隆，需要与病毒感染等鉴别。（3）霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）：对于HL，因背景含有大量表型相对正常的淋巴细胞，寻找低比例的Reed-Sternberg细胞存在一定困难。Reed-Sternberg细胞在免疫表型上可以表现为CD45-CD30+CD15+CD71+CD40+CD95+CD3-CD19-等免疫学特征，需要与其他一些表达CD30+的肿瘤细胞进行鉴别［ 40 ］，多色流式细胞术在HL中具有一定的辅助诊断价值，HL最终诊断需要结合组织病理学。2.白血病微小残留病（MRD）监测：（1）急性白血病MRD监测：基于白血病相关免疫表型（leukemia-associated immunophenotype，LAIP，根据非白血病细胞的表达背景来定义）和/或细胞“异于正常（different from normal，DFN）”的表型，可以鉴定出异常的细胞群，进行MRD细胞监测［ 41 ］。急性白血病MRD监测可以参考已发表的中国专家共识［ 42 , 43 ］。（2）慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤MRD监测：典型的CLL免疫表型为CD19+CD5+CD23+CD22+CD200+CD43+CD79blow/-且CD10-FMC7-CD103-CD20lowsIgMlow［ 44 ］，可用于CLL诊断和MRD监测。上述表型可以通过固定的MRD组合进行监测，推荐方案包括CD5/CD19/CD20/CD38/CD81/CD22/CD79b/CD43等［ 44 , 45 ］，需注意美罗华（Rituximab，利妥昔单抗）治疗会使CD20出现假阴性，鉴于CD200在CLL和其他CD5+淋巴瘤如套细胞淋巴瘤中的作用，也可推荐CD200［ 46 ］和CD160［ 47 ］作为CLL的MRD监测指标。对于免疫表型不典型的淋巴瘤等进行MRD监测，需结合其初发时的免疫表型特征。淋巴瘤的分布具有异质性（如可能涉及外周血、骨髓、淋巴结、肝脏、脾脏等），当采样不同时，MRD监测结果可能也不一致。目前，骨髓是使用最广泛的MRD监测标本，但脾脏、肝脏和淋巴结中的MRD监测亦可在疾病复发中起重要作用［ 45 ］。（3）多发性骨髓瘤MRD监测：可参考已经发表的相关共识进行检测［ 42 ］。MRD监测需要获取足够的细胞数，确定检测的最低检出限（limit of detection，LOD）和最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ），推荐固定和规律的取样时间进行MRD监测 ［ 45 ］。（四）细胞因子检测通过流式细胞术检测细胞因子，主要包括2类方法：（1）基于流式微球阵列技术（Cytometric beads array，CBA），可检测血清、血浆或体液等标本中细胞因子水平。其原理为样品中细胞因子与细胞因子抗体预包被的微球及荧光标记检测抗体结合，形成“双抗体夹心”复合物。此方法使用标本量少，2个荧光检测通道可以同时检测多种细胞因子。（2）可检测激活后胞内细胞因子如IFN-γ等表达，用于评估免疫细胞的功能等。此方法需要新鲜肝素抗凝外周血或分离获得的外周血单个核细胞，使用刺激剂激活细胞，并用阻断剂阻断胞内蛋白质转运，使得刺激产生的细胞因子聚集在细胞内。细胞膜抗原染色后，再使用固定破膜剂固定及破膜对胞内细胞因子如IFN-γ等进行染色。共识6 流式细胞术检测的质量控制应贯穿始终，包括检验前的标本、试剂和仪器，检验中的染色、数据获取和数据分析，检验后的报告发放和结果解释，重视人员质控。推荐强度：强烈建议。

2022年10月，南方医科大学南方医院郑磊教授牵头申报的“流式细胞技术应用推广”项目入选“国家卫生健康技术推广项目”，同时入选“国家卫生健康技术推广应用信息服务平台技术备选库”。为做好流式细胞技术的推广工作，中国民族卫生协会于2022年12月30日成立流式细胞临床应用推广组（简称：流式推广组）并举办流式细胞技术推广论坛。本次大会由中国民族卫生协会和广东省医学会联合举办，郑磊教授、王前教授担任大会主席，欧阳涓教授担任大会主持，著名检验专家崔巍教授、关明教授，中国民族卫生协会钱阳明副会长兼秘书长莅临大会并致辞，多位国内血液、检验等领域专家分享了流式细胞技术的发展趋势、行业标准、研究进展和临床应用。线上2500余人次点击观看。开幕式会议伊始，大会主席南方医科大学南方医院郑磊教授就流式推广组的成立背景、宗旨、组织架构、推广内容以及工作计划进行了详细地介绍。中国流式细胞技术的临床应用主要面临两大发展问题：专业技术人才紧缺、临床医生认知不足。流式推广组的宗旨是致力于流式细胞技术的人才培养、技术规范化、科研转化和临床应用推广，推动流式行业发展，服务临床诊疗工作。流式推广组的成立将打破限制发展的两大瓶颈问题，为中国流式细胞技术临床推广和应用开创新局面。大会主席南方医科大学珠江医院王前教授在致辞中指出，在国家医疗体制改革和分级诊疗政策推进的大背景下，县级诊疗水平和服务能力的提升是国家迫切需要解决的问题，此时，成立流式推广组，充分发挥协会的力量、专家的力量，将流式细胞技术推广到基层医院，帮助解决实际的问题，是非常有意义的。特邀嘉宾复旦大学附属华山医院关明教授出席会议并进行了致辞。关明教授指出，流式细胞术在临床各学科，尤其是疑难病的诊疗中，发挥重要作用，且应用价值得到不断地拓展，其具有自动化、多参数等优点，能更好地在各级医院中进行推广和应用。他坚信，流式推广组将在全国流式细胞术的发展中发挥引领和支撑的作用。特邀嘉宾中国医学科学院肿瘤医院崔巍教授出席会议并进行了致辞。崔巍教授指出流式细胞术的应用已经不限于血液系统疾病领域，在细胞亚群及功能检测需要更多的推广，所以在检验领域成立流式推广组具有重要的现实意义。流式推广组为全国流式细胞技术的发展搭建了一个很好的平台，这将有利于建立规范化的人才培养体系，推动流式细胞技术的推广和转化。特邀嘉宾中国民族卫生协会副会长兼秘书长钱阳明教授在致辞中指出，由郑磊教授牵头成立流式细胞技术临床应用推广组，聚集全国优秀的流式专家、平台和资源，专门致力于流式专业技术人才的培养、技术规范化、科研转化和临床应用推广，这将有利于促进流式行业的发展和技术下沉基层，切实提高各级医疗机构的诊疗水平，这是一项利国利民的工作。成立仪式中国民族卫生协会副会长兼秘书长钱阳明教授为推广组、推广单位、技术指导单位授牌，为推广组核心成员颁发聘书。中国民族卫生协会流式细胞临床应用推广组组长：郑磊顾问：王前、崔巍、关明副组长：欧阳涓、易斌、岳保红、谢丽、刘灿、桑圣刚、汪峰、李俊明秘书：褚帅首批推广单位南方医科大学南方医院、中山大学附属第一医院、广西医科大学第二附属医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、南昌大学第一附属医院、海南医学院第一附属医院、中南大学湘雅医院、福建医科大学附属第一医院、郑州大学第一附属医院首批技术指导单位南方医科大学南方医院、中山大学附属第一医院、广东省人民医院、中山大学肿瘤防治中心、广东省中医院、佛山市第一人民医院、广州市妇女儿童医疗中心大会报告报告题目：规范流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群报告专家：崔巍 中国医学科学院肿瘤医院 崔巍教授为我们讲授了外周血淋巴细胞亚群的流式细胞技术规范化检测。崔巍教授为我们介绍了外周血淋巴细胞亚群检测的临床意义，并分析了外周血淋巴细胞亚群检测流程中的影响因素，强调了外周血淋巴细胞亚群检测质量控制的重要性。随后崔巍教授为我们解读了2021新版《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，与2011版相比，新版指南完善了仪器质量控制和项目性能评估的内容，增加了流式细胞仪性能评估内容，梳理了分析前、分析中、分析后的内容及要求，增加了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的6色分析方案。报告题目：新版WHO分类浆细胞肿瘤的归属及流式克隆性分析应用报告专家：欧阳涓 中山大学附属第一医院 欧阳涓教授首先为我们讲解了第五版的淋巴浆细胞和浆细胞肿瘤的WHO分类，指出在第五版指南中浆细胞肿瘤将属于新设立的浆细胞肿瘤和其他伴副蛋白疾病这一独立类别，并且单克隆丙种球蛋白病被重新作为意义未明IgM单克隆丙种球蛋白病、意义未明非IgM单克隆丙种球蛋白病这2种疾病的上一级病名，并加入冷凝集素病CAD和有肾脏意义的单克隆丙种球蛋白病MGRS。欧阳教授还讲述了这些疾病的临床表现和实验室诊断，重点介绍了流式细胞方面的相关指标。随后，欧阳教授重点为我们介绍了浆细胞克隆性疾病的流式评估方法，分析了流式细胞术检测异常浆细胞的注意事项，综合分析前、分析中和分析后的要素为我们提出了了流式细胞术检测异常浆细胞的难点和一些可能存在的陷阱。最后，欧阳教授提出了浆细胞流式检测面临的挑战和实现检测的规范化、标准化的展望。报告题目：流式细胞术的临床应用和发展报告专家：郑磊 南方医科大学南方医院 郑磊教授为我们讲述了流式细胞术的临床应用和发展。郑磊教授首先介绍了流式细胞术临床应用发展的现状，存在基层医院开展不足、普及率低等问题，总结了流式细胞术临床应用发展两大瓶颈问题：临床医生认知落后以及专业技术人才匮乏。接着，郑磊教授指出疫情后大众对流式细胞术的认知提高，需求增大，并为我们讲解了近年来的国家对流式细胞术的扶持政策。随后，郑磊教授讲述了流式细胞术在传统领域（血液恶性肿瘤）、热门领域（细胞免疫检查）疾病的全程管理以及健康管理中的应用，并指出了技术革新、质量管理优化、临床服务创新、专业人才培养、平台支撑、产业发展等多个发展驱动要素。最后，郑磊教授提出了对流式细胞术的展望，认为流式细胞技术临床应用非常广阔，是提升临床诊疗水平的重要着力点，并且流式细胞技术发展前景良好，技术推广势在必行。报告题目：流式细胞术细胞因子测定在血液病诊疗中的应用报告专家：岳保红 郑州大学第一附属医院 岳保红教授对细胞因子的概述、历史、分类、检测方法及热点进行了讲解，重点给我们讲述了细胞因子在噬血细胞综合征的诊断与监控、细胞因子风暴的监控、PD-1治疗疗效的评估、移植物抗宿主病以及病毒感染性疾病中的应用。随后，岳教授通过案例分析为我们讲解了脓毒血症中相关细胞因子联合检测的重要性以及细胞因子检测对病毒感染转归的提示作用，并提出了对细胞因子检测在临床应用中的展望。报告题目：宿主免疫功能评估项目介绍和临床应用报告专家：汪峰 华中科技大学同济医学院附属同济医院汪峰教授首先对免疫功能评估项目进行了介绍并讲解了项目质量控制的要点，包括室内质控和室间质评等。汪峰教授指出除了细胞数量和功能检测（包括淋巴细胞绝对计数，中性粒细胞呼吸爆发试验以及CD34干细胞计数等）之外，还可以进行细胞表型的检测（如T、B细胞细分类检测，Treg细胞检测，单核细胞细分类等）。此外，汪峰教授还提出了评估方案“三位一体”和免疫状态“三位一体”两个概念。接着，汪峰教授通过临床案例为我们讲述了淋巴细胞功能检测的重要性以及免疫功能评估项目在疾病鉴别诊断与预后判断应用。最后，汪峰教授提出了对免疫功能评估的展望，除了在临床上的应用之外，还希望能在临床研究上有更好的发挥。大会总结最后，欧阳涓教授对大会进行总结：“流式细胞术在血液病、感染、肿瘤等领域有着广泛的应用价值，也是检验医学发展的热点之一。但是在发展的过程中，人才培养、技术标准化、科研转化和临床应用推广等方面还有待加强。郑磊教授牵头成立的这个中国民族卫生协会流式细胞技术临床应用推广组，召集了全国相关领域的专家，本次大会的学术环节也邀请了像崔巍教授、岳保红教授、汪峰教授这样的资深专家授课。大会会将这些专家的经验带到全国，并进一步深入基层医院进行推广。在此，我谨代表郑磊教授和流式推广组，欢迎全国各地的流式专家加入我们的推广组，也欢迎需要交流的单位积极联系我们”。回顾本次会议，多名国内相关专业的顶级专家针对流式细胞行业备受关注的热点问题献上了一场丰富的学术盛宴，剖析了流式细胞技术的发展现状、发展趋势、发展策略，解读了最新行业标准和共识，详细介绍了热点项目细胞因子检测和宿主免疫功能评估的临床应用，充分展现了推广组专家团队的临床和科研水平，让各位参会人员收获满满。流式推广组的成立，致力于推动流式细胞技术在各级医院的应用，服务于临床诊疗工作，欢迎全国范围内的流式从业人员积极与推广组联系，加入推广组，推动流式细胞技术临床应用。最后，感谢会务组辛勤的付出、感谢赞助公司的大力支持、感谢所有参会代表的积极参与！

近日，指真生物CytoFocus系列流式细胞仪获得北京市药品监督管理局批准的二类医疗器械注册证（京械注准20212220543），该仪器同时可配置双激光四色/六色/八色的流式细胞仪。CytoFocus系列流式细胞仪标配蓝色（488nm）和红色（638nm）激光器，配置四色、六色和八色荧光通道，自动进样，操作简单，功能全面，能够覆盖临床常规开展的淋巴细胞亚群分析（TBNK）及CD4细胞绝对计数、细胞因子检测、HLA-B27检测、白血病/淋巴瘤免疫分型、中性粒细胞CD64、造血干细胞计数、精子检测和DNA倍体分析等。主要特点：配置灵活：双激光四色、六色、八色性能强大：高分析速度、高灵敏度和高稳定性高速自动：支持40个管或96孔板自动进样，最高50000events/s进样速度智能简洁：固定光路无需校正，自动荧光补偿调节绝对计数：体积法和微球法同时兼容荧光通道：高灵敏度：FITC≤30MESF、PE≤20 MESF、APC≤20 MESF高分辨率：仪器分辨率：CV＜2%配套多种细胞因子检测试剂产品特点：时间短：单次样本处理＜1小时，大大节省时间，市面上大部分试剂样本处理时间在3小时左右。自动化：采用磁性微球，使用磁力架可实现分离或后期配套使用样本前处理系统实现无手工处理，解放劳动力同时避免人为误差，市面上大部分试剂采用塑料微球无法实现后续自动化。质控品：试剂盒内包含高低质控品，市面上大部分试剂盒内不包含质控品或需要单独购买。

p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " span style=" text-indent: 2em " 新型冠状病毒疫情的蔓延已经给国人的生活带来了严重的影响。从已经获得的数据资料来看，这种病毒的传播能力相比SARS更强，危害范围更广。众多仪器厂商自发行动，为抗击疫情献出自己的力量。当前，仪器厂商推出仪器或试剂盒产品大多是关于疑似病例确诊的核酸检测。而新型冠状病毒以及类似病原体的不断升级进化，临床和科研迫切需要先进、全面的技术平台用于病毒致病机制研究、诊断治疗、药物研发和疫苗研制。 /span br/ /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 仪器信息网：针对此次新型冠状病毒（2019-nCoV）感染肺炎疫情，贵单位推出了什么样的检测仪器、试剂和解决方案？有何特点？ /span /strong /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " strong 安捷伦 /strong ：新型冠状病毒以及类似病原体的不断升级进化，临床和科研迫切需要先进、全面的技术平台用于病毒致病机制研究、诊断治疗、药物研发和疫苗研制。Agilent推出的流式细胞仪和xCELLigence& nbsp RTCA实时监测系统，在保证研究人员安全的同时，不耽误研究进程，从而协助攻关专家，助力病毒研究。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " xCELLigence RTCA 实时细胞分析技术是一种独特的活细胞检测技术，该技术可实现无标记和持续性的跟踪记录病毒感染细胞过程中CPE（细胞病变效应）的进展，为多种病毒学检测提供异常简易的实验流程，包括但不限于：病毒滴度测定、疫苗研发、中和抗体的检测与定量、抗病毒药物的开发等，可实时电子生物传感检测和多达四个独立的活细胞成像参数，包括1个明场和3个荧光通道。 span style=" text-indent: 2em " 该技术可满足研究人员尽可能少地接触病毒，并可以做到无需研究人员值守的进行病毒研究任务。目前该系统已针对此次新型冠状病毒（2019-nCoV）展开各方面研究支持。 /span /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " Agilent多色流式细胞仪，最高可达4激光25色，最高上样速度可达100，000 events/s，具备千余种临床和科研试剂，配套自动多功能数据分析软件NovoExpress，能够同时检测多种免疫细胞的表型、状态和细胞因子以及病毒的生物学特征和病理机制，可检测多种标本如血液、血清、脑脊液、细胞培养液和肺泡灌洗液等，对标本中的细胞类型、细胞器、蛋白质、核酸等成分进行定性定量的检测。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 199px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/21c14eb1-d0c1-4ee6-a760-3ba1237d913c.jpg" title=" Agilent流式细胞仪体积法绝对计数无需绝对计数微球，节省检测成本.png" alt=" Agilent流式细胞仪体积法绝对计数无需绝对计数微球，节省检测成本.png" width=" 600" height=" 199" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center " Agilent流式细胞仪体积法绝对计数无需绝对计数微球，节省检测成本 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 新型冠状病毒肺炎诊疗方案和指南中提到免疫检查和监测对于易感人群的筛查以及隔离观察、新冠肺炎患者病情监测、判断细胞因子和炎症反应的产生，预警预测细胞因子风暴的重要性。流式细胞术在临床上可用于新冠肺炎患者的免疫细胞和免疫状态的评估，为筛查诊断、用药治疗和预后评估提供精确指导。应用Agilent流式细胞仪进行无成本淋巴细胞亚群的绝对计数，辅助临床客观、准确地评估细胞和体液免疫功能和免疫状态。临床医生通过免疫检测结果判断患者是否需要隔离，调整激素药物剂量以防止过量激素造成的免疫损伤和副作用，并动态监测治疗过程中新冠肺炎患者的免疫评估患者的治疗效果和评估预后。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 应用Agilent流式细胞仪配套试剂盒软件对新冠肺炎血清细胞因子进行定量检查，细胞因子风暴是导致新冠肺炎患者死亡的重要原因，动态监测细胞因子对细胞因子风暴的预警预测和及时采取相应药物或生物制剂治疗如细胞因子拮抗剂、激素和免疫抑制剂起指导作用。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " Agilent流式细胞仪检测新冠病毒肺炎患者中性粒细胞CD64感染指数可辅助临床诊断和鉴别诊断患者是否合并细菌感染，中性粒细胞CD64感染指数是诊断细菌感染的一项敏感度高、特异性强的新指标，与细菌感染的严重程度、预后及患者的死亡密切相关，监测CD64感染指数为评估病情、抗菌疗效和预后提供参考。Agilent流式细胞仪配合配套试剂检测新冠肺炎患者的中性粒细胞淋巴细胞亚群、细胞因子和CD64感染指数，可快速、精确、自动地出报告，节省检测成本和时间，为临床监测病情、用药指导、疗效和预后评估提供参考，为脓毒症、细胞因子风暴提供预警预测、免疫治疗指导和个性化治疗方案,同时为研发抗病毒药物和设计疫苗提供理论支持和开发新靶点并为药物和疫苗筛选、药效评估、安全性评估和免疫评价等提供高效、准确、客观、可靠的技术平台。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 266px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/4c6f331b-070b-45a5-aa93-d29c70811635.jpg" title=" Agilent流式细胞仪.png" alt=" Agilent流式细胞仪.png" width=" 500" height=" 266" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center " Agilent流式细胞仪 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 仪器信息网：目前，贵单位开展了哪些具体工作？给疫情防控带来了哪些具体帮助？ /strong /span /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " strong 安捷伦 /strong ：安捷伦从未停止奋斗在对抗疫情、挽救生命、助力科研第一线的步伐，2020年1月27日，大年初三，安捷伦宣布捐赠价值300万元急需的生物仪器设备到临床和科研一线。1月26日（大年初二），多名安捷伦杭州员工自愿放弃与家人团聚的时间，火速赶到公司完成捐赠货物NovoCyte流式细胞仪和实时无标记细胞分析仪的装箱发货，1月27日（大年初三），安捷伦捐赠价值300万元急需的临床与科研设备已经全部运出，并在第一时间完成仪器安装和调试，满足奋斗一线的医护和科研人员的临床样本检测、病毒学研究和抗病毒药物研究的迫切需求。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 同时，安捷伦有幸向中科院武汉病毒所和中国家疾病预防控制中心病毒所捐赠公司的xCELLigence RTCA系统，协助两家国家重点病毒科研单位用于病毒CPE，抗病毒药物和疫苗的研究，集中力量，快速突破，攻克技术难关，遏制病毒蔓延。xCELLigence RTCA实时监测技术可满足研究人员尽可能少地接触病毒，并可以做到无需研究人员值守的进行病毒研究任务。这在保证研究人员安全的同时，不耽误研究进程，从而协助攻关专家，助力病毒研究。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 值得一提的是，为了支持广大相关用户工作的正常运转，安捷伦工程师已提前到岗，以确保用户在特殊时期的仪器服务需求，最大限度降低用户因延期复工造成的损失。 span style=" text-indent: 2em " & nbsp /span /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 仪器信息网：针对疫情防控，后续还将有哪些工作计划？ /strong /span /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " strong 安捷伦 /strong ：冠状病毒及类似病原体的不断出现和变异对全球人类健康安全和经济发展造成了严重威胁，作为生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，通过丰富的产品线，安捷伦有义务也有能力，从多方面为战胜疾病、保障人类健康做出贡献。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 接下来，安捷伦将持续支持病毒一线研究工作，利用领先的细胞技术在病毒致病机制研究、诊断治疗、药物研发和疫苗研制工作方面提供强有力的仪器、试剂和技术支持。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 安捷伦也将为此次疫情提供质量控制方面提供的多方面的解决方案。无论是针对疫苗的开发，抑或是在核酸与细胞层面对致病机理的研究，都离不开对蛋白与核酸样本的质量控制。安捷伦自动化电泳产品线以及UV-Vis光谱产品等可快速对DNA、RNA，蛋白样本进行分析。安捷伦液相和毛细管电泳可用于疫苗的质控分析，进行纯度及杂质检测，针对新冠肺炎的研究针分夺秒，可大大节省获取结果的时间，同时保障结果的准确性与重现性。另外，安捷伦顶空气相色谱法测定一次性医疗器械产品中各化学物质残留量，如医用口罩，中的环氧乙烷和2_氯乙醇的残留量，为一次性医疗器械生产过程的质量控制保驾护航。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 此外，针对疫情期间的环境隐患，污染物应急监测，和固废危废检测及其处理相关排放污染物检测等方面等，安捷伦有相应的丰富检测方案，积极配合相关机构进行高效的监测和分析。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 今后，安捷伦将推出更多的临床检测试剂和科研检测技术，并结合安捷伦的多个平台、仪器、软件和专业技能，为临床检测、科学研究、药物和疫苗开发等提出更优更全面的解决方案。赢取此次战役之后，安捷伦期待更多参与并支持国家的公共卫生能力建设，应对公共安全挑战。 /p

肾细胞癌（RCC）是常见的一种肾脏癌症。RCC现在仍然缺少有效的医学诊断指标，已经成为RCC治疗方法开发的大挑战。外泌体是一种潜在的癌症诊断指标，细胞分泌的外泌体的组成会因细胞的生理状态不同而发生变化。肿瘤内乏氧是癌症发生、发展及扩散的一个关键因素。研究表明，处于乏氧状态的细胞分泌的外泌体会影响癌细胞的增殖、扩散以及肿瘤血管生成，且与外泌体的内容物有关。外泌体内容物的表型可以通过蛋白组学和转录组学方法检测，但这些方法过于繁琐，难以用于医学诊断。单个外泌体表型分析是将免疫学与光学结合的一种新技术。该技术先利用免疫识别将特定的外泌体进行捕获分离，然后再对目标外泌体的表面标志物及内容物（如携带的蛋白质、RNA、DNA及细胞因子）进行定量分析，从而更加全面地反映外泌体的特性。该技术在短短两年时间，备受广大科研工作者的关注。本文将为大家分享使用单外泌体表征分析技术与蛋白组学检测乏氧状态的肾细胞癌外泌体，以供参考。研究人员先分离了鼠RCC细胞的细胞培养上清液，使用基于单个外泌体表型分析技术的全自动外泌体荧光检测分析系统Exoview检测了在乏氧和正常状态下分泌的外泌体中CD81和CD9亚群的含量。图1结果表明，乏氧状态下分泌的含CD81与含CD9外泌体均为正常状态下的3.1-3.6倍。图1 ExoView检测乏氧与正常RCC细胞外泌体表型接下来使用Western Blot检测上清液以及不同纯化方法获得的外泌体的蛋白含量。由图2结果可知，WB无法检测到上清液（左列）中的蛋白，而Exo-spin排阻色谱法（中列）和梯度超速离心法（右列）获得的外泌体中，乏氧RCC的CD81和CD9低于正常组，与Exoview的结果相一致。 图2 Western Blot检测不同纯化方法获得的外泌体的蛋白含量确定了不同状态条件下细胞分泌的外泌体表面标志物有差别后，研究人员使用了SERS，TG-RS（图3）和TG-SERS（图4）检测不同纯化方法获得的外泌体的谱线。由谱线可知，TG-RS和TG-SERS法检测Exo-spin法纯化的外泌体，可以分辨出乏氧和正常外泌体的不同谱峰。后，研究人员使用质谱检测了Exo-spin法纯化的外泌体。蛋白组学分析结果表明，乏氧外泌体的CD9的表达量高于正常，这与Exoview和WB结果一致。图3 TG-RS与一般SERS检测不同纯化方法获得的外泌体的谱线图4 TG-SERS检测Exo-spin法纯化获得的外泌体的谱线本研究的TG-RS结果中，不同纯化方法的结果也有不同，这既说明了TG-RS方法检测的高灵敏度，也说明纯化确实影响了外泌体样品的组成。Exoview使用细胞上清液或其他体液的原液直接进行检测，通过芯片上的抗体特异性结合外泌体，可以排除杂质的影响，无需对样品进行纯化，而WB等方法由于浓度限制无法直接检测。也说明，Exoview可以作为一种标准的外泌体表型检测方法，作为其他检测和诊断方法开发的有效参照。作为外泌体表征分析的倡导者，美国NanoView Biosciences于2018年推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，该系统一经推出，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，凭借其稳定、出色的性能，短短几年在全球已有近百个客户，发表文献100多篇。ExoView的表征，能够帮助科学家更深入地了解外泌体与疾病之间的关系，助力疾病诊断和新药开发。参考文献： [1] Samoylenko, A., Kögler, M., Zhyvolozhnyi, A., Makieieva, O., Bart, G., Andoh, S. S., ... & Hiltunen, J. (2021). Time-gated Raman spectroscopy and proteomics analyses of hypoxic and normoxic renal carcinoma extracellular vesicles. Scientific reports, 11(1), 1-14.全自动外泌体荧光检测分析系统（ExoView R100）简介Nanoview所开发的全自动外泌体荧光检测分析系统（ExoView R100）采用单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）技术，是一款无需纯化的全自动的新型外泌体表征设备。该设备能够提供全方位的外泌体表征信息，包括颗粒大小、计数、表型与生物标志物共定位等，提供多层次和全面的外泌体测量解决方案。为了更好的服务中国客户，Quantum Design中国子公司在北京建立了专业的客户服务中心，正式推出专业的全方位外泌体表征测试服务，您只需要少量样品即可获得全方位的外泌体表征数据。欢迎各位老师垂询：010-85120280。前10名订购服务的老师，可享受8折优惠！扫描上方二维码，即刻订购吧！

流式荧光技术，是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术，又被称为液态芯片、悬浮阵列及Luminex® xMAP技术等。该项技术是继生物芯片技术、化学发光技术之后的新一代高通量分子诊断技术平台，是临床诊断领域及生命科学研究中的一大热点。其综合了有色微球、应用流体学、激光技术及高速数字信号处理技术的技术优势，目前已被广泛应用于免疫分析、核酸检测、酶学分析、受体和配体识别分析等研究领域。本届流式细胞网络大会特别设立【流式荧光技术及应用】分会场，特别邀请 解放军总医院第三医学中心检验科杨晓莉主任、 郑州大学第一附属医院 检验科副主任 岳保红教授、中国康复研究中心北京博爱医院主管技师幸雯为我们分享细胞因子及流式临床的应用。 部分精彩报告预览 报告题目：细胞因子的临床意义及检测进展报告嘉宾：杨晓莉 解放军总医院第三医学中心检验科 主任【摘要】 介绍细胞因子发现的历史沿革与临床意义，结合现在市场成熟的检测技术，探讨临床应用的优势与不足，促进检验专业人员掌握i细胞因子的背景知识，了解其在临床应用领域的机遇与挑战。报告题目：流式细胞因子及受体检测在临床疾病中免疫状态变化中的应用报告嘉宾：岳保红 郑州大学第一附属医院 检验科副主任/教授报告题目：流式细胞术在临床检验中的应用及发展报告嘉宾：幸雯 中国康复研究中心北京博爱医院 主管技师【摘要】 本次报告以流式细胞术在临床检验中的应用及发展为主题，就流式细胞术的发展历史，流式细胞术在淋巴细胞亚群监测分析、HLA-B27抗原表达分析、中性粒细胞CD64感染指数检测、CD34+造血干细胞计数、白血病/淋巴瘤免疫分型、PNH相关抗原检测、血小板相关分析等方面进行解读分享。更多精彩报告敬请查看：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icfcm2023/ iCFCM 2023 交流群 温馨提示:1) 报名后，直播前助教会统一审核，审核通过后，会发送参会链接给报名手机号。填写不完整或填写内容敷衍将不予审核。2) 通过审核后，会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。会议海报

近几十年来，医疗技术快速发展，对人们健康做出了巨大贡献，但是越来越多难以治愈的疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病和老年痴呆症等发病率也在不断攀升，而以化学药物和手术治疗为支柱的传统西医学发展逐渐遭遇瓶颈。 20世纪末以来，以干细胞技术为核心、被科学界誉为第三次医学革命的再生医学成为了人们治愈此类疾病的新希望。全球干细胞领域领军人物哈佛大学资深医学专家威廉.雷德博士说：“再生医学是继药物、手术治疗后的又一场医学革命，他拥有治愈疾病、器官再生、延长生命的潜能。并且可以完全颠覆我们的行医方法”。 一、间充质干细胞间充质干细胞(MSC)是一类早期未分化细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化潜能等特点，可通过分泌细胞因子，减少炎症、减少组织细胞凋亡、促进内源性组织器官的干祖细胞增殖及进行免疫调节，从而作为种子细胞达到修复组织器官的效果。 目前间充质干细胞治疗各种疾病的临床试验在世界范围内都在如火如荼的进行中，截止目前，clinicaltrial.gov网站注册应用的间充质干细胞相关的临床试验超过950项，中国临床试验注册中心注册的间充质干细胞临床试验超过150项。 二、间充质干细胞治疗优势多向分化：具有强大的增殖能力和多向分化潜能；免疫调节：免疫原性低，有免疫调节功能，使用不引起免疫排斥反应，且可抑制排斥反应；数量丰富：各组织中含量丰富，易于采集。繁殖力强：经体外培养可达10亿个，供多次使用。安全可靠：基因稳定，不易突变，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。适用面广：适用范围广泛，几乎可用于治疗所有的组织损伤、衰老及退行性病变。三、临床产品示例1.移植物抗宿主病：TEMCELL2016年2月，Mesoblast公司的药物在日本获批上市，商品名称TEMCELL。TEMCELL是一款骨髓来源的间充质干细胞产品，主要批准用于儿童和成人的移植物抗宿主病。这是日本国内首个获批的异体细胞治疗药物。2.骨关节炎治疗药物：CartistemMedi-post公司的Cartistem是通过分离间充质干细胞，培养并制成商品化的药物。主要用于治疗由于年龄、创伤、退行性及疾病引起的骨关节炎。爱必信为您提供优质的无血清培养基，助力细胞治疗！爱必信无血清培养基优点：1.无外源动物蛋白成分，大大降低各类病毒、霉菌和支原体等的污染风险。2.全程无血清生产，极大降低批次间差异。3.可用于原代分离，且培养过程无需包被培养板。4.扩增效率高，24h左右增殖翻倍，节省培养时间。5.内毒素 abs9416 成软骨检测染液 100ml 462 abs9415 成骨检测染液 100ml 462 abs9413 无血清细胞冻存液（治疗级） 100ml 1712 abs9417 无血清细胞冻存液（科研级） 100ml 662 abs9402 Xeno-Free人间充质干细胞培养基 100ml/500ml 998/3108 abs9401 Xeno-Free人间充质干细胞培养基（无酚红） 100ml/500ml 998/3108 abs9405 人多能干细胞分化培养基 500ml 2289 abs9404 人多能干细胞完全培养基 500ml 3444 abs9403 人多能干细胞条件培养基 500ml 2772 abs9409 人多能干细胞消化液 100ml 305 abs9420 人脂肪干细胞无血清培养基(无酚红） 500ml 2548 abs9419 人脐带间充质干细胞无血清培养基(无酚红） 500ml 2548 abs9407 人间充质干细胞成脂分化试剂盒 100ml 1953 abs9418 人间充质干细胞成软骨分化试剂盒 100ml 2069 abs9406 人间充质干细胞成软骨分化试剂盒 100ml 2069 abs9408 人间充质干细胞成骨分化试剂盒 100ml 2541 abs9412 ES/iPS细胞冻存液 100ml 1943Absin特色产品线（全部现货）：WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)... 爱必信(上海)生物科技有限公司联系邮箱：info@absin.cn公众平台：爱必信生物

质谱流式细胞术及其在精准医学中研究进展张浩1,2,3, 韩国军1,2,31北京大学跨学部生物医学工程系；2北京大学口腔医院；3 北京大学医学部医学技术研究院。质谱流式细胞术（Mass Cytometry）是近年来应用最为广泛的单细胞技术之一种。其将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起，用金属同位素代替荧光标记特异性抗体或探针，并利用质谱来定量同位素标签，可以在单细胞水平完成多种生物标志物的检测分析，包括核酸、蛋白质及其它小分子。其具有高通量、高灵敏度和高稳定性等优点，尤其适合于肿瘤、免疫、血液、药物和遗传学等学科的研究。当前新冠病毒COVID-19对人体免疫系统造成严重侵害，质谱流式技术能够更深入、全面的分析人体免疫系统的各种细胞亚型及其比例的变化，并预测临床病程的变化趋势，对于早期诊断、治疗与病理研究具有重要意义。 （一） 质谱流式细胞术发展历史图 1美国斯坦福大学医学院Garry Nolan 实验室中三台质谱流式仪器： CyTOF 1， CyTOF 2，CyTOF 3 （Helios）和BD公司荧光流式细胞仪LSR II。[1]质谱流式细胞术从最初的分析方法学概念到单细胞仪器装置、最终在基础生物学与临床医学中取得重要的应用，经过近二十年的发展历程。图1为2015年美国斯坦福大学医学院免疫学与微生物学系Garry Nolan教授实验室中三台不同型号CyTOF质谱流式仪与BD公司荧光流式细胞仪同时使用的照片。回顾质谱流式细胞术的发展历史，有三位重要的科学家作出了杰出的贡献。如图2中所示，首先2002年清华大学张新荣教授在学术期刊Analytical Chemistry中第一次提出元素标记策略用于电感耦合等离子体质谱的生物大分子检测的方法学研究[2]；2009年加拿大多伦多大学的Scott Tanner教授在学术期刊Analytical Chemistry中首次发布质谱流式细胞仪（Cytometry for Time of Flight，CyTOF）的研究工作[3]，并成立DVS Sciences公司将传统流式细胞术与电感耦合等离子体质谱相结合，推出了首台商用质谱流式分析仪器。2011年斯坦福大学Garry Nolan教授首次将质谱流式技术成功应用于临床血癌免疫性疾病的单细胞的表型与磷酸化蛋白信号通路研究[4]，开创了质谱流式医学应用的新篇章。2014年，DVS Sciences公司和质谱流式技术被美国Fluidigm公司收购，随后分别于与2015年和2017年陆续推出了Helios质谱流式系统和Hyperion组织成像系统以及700多种相关抗体和预设计标记试剂盒。目前为止，全球已经安装超过200台质谱流式细胞仪，中国拥有30台以上。并且，已经有50多个临床试验使用了质谱流式细胞术，这表明高通量、高灵敏、高稳定的质谱流式时代已经来临。图2 质谱流式细胞术三位主要奠基人：图A左一为清华大学张新荣教授；图A右一为加拿大多伦多大学Scott Tanner教授； 图B第一排右一为美国斯坦福大学Garry Nolan。（二） 质谱流式细胞术原理质谱流式细胞术主要工作原理是通过重金属同位素标记抗体或探针，然后识别细胞表面或内部信号，被标记的细胞以细胞悬液形式进入雾化器，随后样品在等离子体内发生汽化，产生离子云、离子在四级杆内根据质荷比进行筛选，然后在时间飞行器中通过已知强度的电场加速后到达检测器，而其到达检测器的飞行时间与离子质量有关。最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面或内部的信号分子数据，并通过专业计算机分析软件对获得的数据进行降维处理分析，从而得到细胞外部表型和内部信号网络的数据结果。图3 质谱流式细胞术金属稳定同位素标记探针。包括标记单克隆抗体分子的稀土同位素；标记细胞编码的贵金属同位素；标记细胞周期的卤素[1]。北京大学韩国军教授首次建立了48种稳定同位素单克隆抗体统一标记策如图3所示，并定量分析了镧系、钇、铟、钯同位素间的CyTOF质谱干扰。系统性的建立了标准方法用于同位素标记抗体定量分析、抗体活性与选择性验证、以及抗体细胞染色浓度优化等，被多个国际质谱流式实验室作为同位素抗体标记标准手册使用。与传统流式技术相比，质谱流式细胞术主要有以下优势：① 前者使用荧光基团偶联抗体或分子，后者主要通过金属同位素进行标记，因为细胞中不含或很少含有这些金属同位素，因此背景信号较低，检测数据可靠性较高；② 传统荧光流式采用激光器和光电倍增管作为检测手段，最多可同时检测通道数不足20个，而质谱流式细胞术使用ICP-MS作为检测手段，不仅提高了检测通道数，可同时检测100个左右参数，而且避免了通道信号之间的串色干扰，无补偿或补偿非常小，使方案设计更加容易。③ 除可以在单细胞水平进行自身多参数分析以外，还可以检测分析一些金属治疗药物的分布及代谢情况，比如顺铂类化疗药物等。但质谱流式细胞术当前也存在一些问题，比如样本采集速度慢，每秒最多约1000个事件；测量不同样本之间需要程序清洁，导致每个样本平均测样时间延长；由于样本被气化，所以无法进行前向散射和侧向散射测量，也不能分选回收细胞进行后续实验等。（三）质谱流式细胞术的应用3.1 细胞表型鉴定与信号通路检测质谱流式细胞术非常适合对复杂的细胞表型进行深层次分析，可以区分在疾病发展过程中发挥不同作用的相似细胞，这对疾病的个体化治疗具有重要意义。Su等人通过对结直肠癌患者血液中的T细胞群进行质谱流式分析，展示了患者个体及不同患者之间 T 细胞亚群的表型多样性[5]。此外，Lelieveldt等用HSNE进行数据分析，在免疫细胞中发现了稀有细胞群[6]。分析细胞因子可以为研究免疫激活状态提供新的视角。Vendrame 等人利用 CyTOF评估细胞因子对自然杀伤 (NK) 细胞的影响，发现白介素 (IL)-12/IL-15/ IL-18刺激可显著增加NK细胞中γ干扰素 (IFN‐γ)的表达[7]。Doyle等对丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的肝脏和外周血中的浆细胞样树突状细胞(pDCs)进行了研究，证明肝脏pDC具有多功能性，能够在慢性HCV感染期间产生大量的IFN-γ 和其他免疫调节因子[8]。随着检测细胞因子的报道不断增多，CyTOF将可能成为免疫细胞功能研究中不可或缺的工具。细胞受外界刺激后，细胞内信号网络会做出相应反应。使用靶向磷酸化蛋白的金属螯合抗体，CyTOF能够检测单个细胞内的信号通路。Shinko等人为临床血样提供了磷酸化信号蛋白染色的优化方案[9]。厦门大学周大旺教授团队应用 CyTOF质谱流式细胞仪发现了Hippo信号通路中转录共激活因子TAZ在调节 CD4+初始T细胞分化为Th17细胞和Treg细胞的过程中发挥着关键调控作用及其重要机理[10]。 3.2细胞周期鉴定、RNA和蛋白质的共同检测细胞周期改变是肿瘤进展、生物发育和免疫调节的重要方面。Behbehani 等人开发了一种新的CyTOF方法来描绘细胞周期阶段，分别使用IdU、磷酸化视网膜母细胞瘤抗体、细胞周期蛋白 B1抗体、细胞周期蛋白 A 抗体和磷酸化组蛋白H3抗体来标记S、G0、G1、G2、和 M 期细胞[11]。并利用这种细胞周期鉴定方法，研究展示了介导急性髓性白血病化疗敏感性的细胞周期差异[12]。为了能够在单细胞分辨率下同时检测 RNA 和蛋白质，Frei 等人开发了 RNA 邻近连接技术 (PLAYR)[13]。PLAYR包括杂交、连接、滚环扩增和检测四个阶段。针对目标RNA设计两个相邻区段的探针，与目标RNA结合后再与Backbone和Insert两个探针进行杂交，随后Backbone和Insert探针连接成一个环，做为后续滚环扩增的模板，与带有金属标签的探针杂交后就可以扩增并检测了。PLAYR的优势在于可以同时兼容蛋白检测，在实验过程中，可以先用抗体对胞内外蛋白进行标记，然后在用PLAYR流程对RNA进行原位标记和扩增。我们可以根据表面Marker对细胞进行亚群分析，深入研究每个亚群中信号通路、转录因子的激活及其相关基因的表达。并且利用PLAYR监测脂多糖刺激后PBMCs中8个细胞因子mRNA和18个蛋白表位的变化，揭示了每个细胞的功能能力与其蛋白标记物表达之间的相关性。3.3 质谱流式细胞术成像Geisen 等人使用 CyTOF 对组织样本进行成像以获得蛋白质空间组学[14]。他们提出的IMC （Imaging Mass Cytometry）技术使用分辨率为 1 μm 的激光光斑进行烧蚀、雾化、电离，并通过惰性气流传送到质谱检测器。IMC 被认为是具有里程碑意义的发展，因为它在亚细胞分辨率下将细胞间相互作用和的空间信息联系在一起，并能同时分析多达50种参数。自推出以来，IMC 正迅速被应用于各个研究领域。Damond 等人使用 IMC 对4例非糖尿病患者、4例首发1型糖尿病患者和4例长期1型糖尿病患者的胰岛进行研究，描述了人类1型糖尿病的进展，并发现在发病之前β胰岛素细胞表型已经发生改变[15]。另一类元素标记的单细胞成像技术是利用二次离子质谱SIMS（Secondary Imaging Mass Spectrometry），图4为北京大学韩国军教授利用NanoSIMS 50L质谱对Hela单细胞核中新生成的DNA与RNA的时空分析[16]。图4 基于二次离子质谱的高分辨Hela细胞核成像技术与人工智能机器学习数据分析。3.4 新冠肺炎检测及治疗 Silvin等人对COVID-19 患者外周血进行单细胞CyTOF及RNA测序，发现血浆内钙结合蛋白水平和非典型单核细胞减少可以鉴别严重的COVID-19患者[17]。Schrepping等人对全血和外周血单个核细胞进行RNA测序和单细胞蛋白质组学分析，揭示了SARS-CoV-2感染后免疫系统的反应[18]。而Rendeiro等人利用质谱流式细胞术进行空间成像，研究包括SARS-CoV-2 感染在内的人类急性肺损伤的细胞组成和空间结构。从而使我们能够从结构、免疫学和临床角度提出生物学上可解释的肺病理图谱，为理解COVID-19和一般的肺损伤病理学提供了重要的基础[19]。（四）总结质谱流式细胞术相较传统荧光流式细胞技术具有可以同时检测更多参数不需补偿、方案设计简单、灵敏度高等优点。其多参数检测的特征尤其适合对细胞表型、细胞因子、信号通路等进行深层次分析，适用于肿瘤、免疫系统疾病、传染病、血液病、药物临床试验、预后评估等方面研究。但质谱流式细胞术也存在采样较慢、清洁费时、成本较高等问题，因此还需研究人员根据自己的实验目的及需求进行选择。参考文献：1. Han GJ, Spitzer MH, Bendall SC, et al. Metal‐isotope‐tagged monoclonal antibodies for high‐dimensional mass cytometry[J]. Nat Protoc, 2018 13(10):2121-2148. DOI: 10.1038/s41596-018-0016-7.2. C. Zhang, Z. Y. Zhang, B. B. Yu, J. J. Shi, X. R. Zhang. Application fo the biological conjugate between antibody and colloid Au nanoparticle as analyte to inductively coupled plasma spectrometry. Anal.Chem. 20023. Bandura DR, Baranov VI, Ornatsky OI, et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time - of - flight masss pectrometry[J]. Anal Chem, 2009 81(16):6813-22. DOI: 10.1021/ac901049w.4. Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, et al. Single‐cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum[J]. Science, 2011 332(6030):687-96. DOI: 10.1126/science.1198704.5. Di J, Liu M, Fan Y, et al. Phenotype molding of T cells in colorectal cancer by single‐cell analysis[J]. Int J Cancer. 2020 146(8):2281‐2295. DOI:10.1002/ijc.32856.6. van Unen V, Hollt T, Pezzotti N, et al. Visual analysis of mass cytometry data by hierarchical stochastic neighbour embedding reveals rare cell types[J]. Nat Commun. 2017 8(1):1740. DOI:10.1038/s41467-017-01689-9.7. Vendrame E, Fukuyama J, Strauss‐Albee DM, et al. Mass cytometry analytical approaches reveal cytokine‐induced changes in natural killer cells[J]. Cytometry B Clin Cytom. 2017 92(1):57‐67. DOI:10.1002/cyto.b.21500.8. Doyle EH, Rahman A, Aloman C, et al. Individual liver plasmacytoid dendritic cells are capable of producing IFNalpha and multiple additional cytokines during chronic HCV infection[J]. PLoS Pathog. 2019 15(7):e1007935. DOI:10.1371/journal.ppat.1007935.9. Shinko D, Ashhurst TM, McGuire HM, et al. Staining of phosphorylated signalling markers protocol for mass cytometry[J]. Methods Mol Biol. 2019 1989:139‐146. DOI:10.1007/978-1-4939-9454-0_10.10. Geng J, Yu S, Zhao H, et al. The transcriptional coactivator TAZ regulates reciprocal differentiation of TH17 cells and Treg cells[J]. Nat Immunol, 2017 18(7):800-812. DOI: 10.1038/ni.3748. 11. Behbehani GK, Bendall SC, Clutter MR, et al. Single‐cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle[J]. Cytometry A. 2012 81(7):552‐566. DOI:10.1002/cyto.a.22075.12. Behbehani GK, Samusik N, Bjornson ZB, et al. Mass cytometric functional profiling of acute myeloid leukemia defines cell‐cycle and immunophenotypic properties that correlate with known responses to therapy[J]. Cancer Discov. 2015 5(9):988‐1003. DOI:10.1158/2159-8290.CD-15-0298.13. Frei AP, Bava FA, Zunder ER, et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells[J]. Nat Methods. 2016 13(3):269‐275. DOI:10.1038/nmeth.3742. 14. Giesen C, Wang HA, Schapiro D, et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry[J]. Nat Methods. 2014 11(4):417‐422. DOI:10.1038/nmeth.2869.15. Damond N, Engler S, Zanotelli VRT, et al. A map of human type 1 diabetes progression by imaging mass cytometry[J]. Cell Metab. 2019 29(3):755‐768.e5. DOI:10.1016/j.cmet.2018.11.014.16. Coskun. A. F., Guojun Han, Ganesh S. et al. Nanoscopic subcellular imaging enabled by ion beam tomography, Nature Communications, 2021, 12(789)17. Silvin A, Chapuis N, Dunsmore G, et al. Elevated Calprotectin and Abnormal Myeloid Cell Subsets Discriminate Severe from Mild COVID-19[J]. Cell, 2020 182(6):1401-1418.e18. DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.002.18. Schulte-Schrepping J, Reusch N, Paclik D, et al. Severe COVID-19 Is Marked by a Dysregulated Myeloid Cell Compartment[J]. Cell, 2020 182(6):1419-1440.e23. DOI:10.1016/j.cell.2020.08.001. 19. Rendeiro AF, Ravichandran H, Bram Y, et al. The spatial landscape of lung pathology during COVID-19 progression[J]. Nature, 2021 593(7860):564-569. DOI:10.1038/s41586-021-03475-6. 【作者简介】张浩 博士 2020级北京大学口腔医学技术专业科研型博士，导师韩国军教授。硕士就读于山东大学口腔医院（导师刘少华教授），从事血管瘤临床治疗及泡沫硬化剂的改良研究，发表SCI论文4篇。目前师从韩国军教授，主要从事口腔鳞癌单细胞质谱研究及质谱病理诊断新方法研究。韩国军 研究员北京大学跨学部生物医学工程系研究员、博士生导师，北京大学口腔医院双聘博士生导师。2013年毕业于清华大学化学系（导师张新荣教授），2013至2020年在美国斯坦福大学医学院Mass Cytometry创始人Garry Nolan课题组从事新一代质谱流式相关技术与临床医学应用研究。曾获教育部自然科学一等奖，并在Nature Communications、Nature Protocols、Cell Reports、Angew Chem、Anal Chem、Cytometry等发表论文20余篇。目前主要从事质谱新技术在临床医学中应用研究，与北京大学口腔医院、北京大学第三医院、北京大学第一医院开展单细胞质谱流式临床精准医学研究。点击查看流式细胞仪专场Webinar预告（点击报名）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通邮箱：liuld@instrument.com.cn微信/电话：13683372576扫码关注【3i生仪社】，解锁生命科学行业资讯！

一部分血液系统恶性肿瘤患者需要进行造血干细胞移植 (hematopoietic stem cell transplantation，HSCT) 才有治愈机会，而这些患者中只有大约50%有完全匹配的供体，其余患者需要来自不完全匹配的HSCT治疗。这些不匹配的供体HSCT中有近60%会导致移植物抗宿主病 (graft-versus-host disease，GvHD)。而T-allo10疗法可有望降低GvHD的发病概率，其通过1型调节T细胞（Type 1 regulatory cell，Tr1 cell）以抑制同种异体反应【1】。Tr1细胞一般存在于外周血中，是CD4+ T细胞的亚群，可诱导和维持外周免疫耐受 【2】。一般来说，Tr1细胞可分泌抑制性细胞因子 IL-10 和 TGF-β 【3】，表达抑制性受体CTLA-4【4】，但目前尚不明确Tr1细胞在T-allo10疗法的具体作用机制，亟需系统探索。2021年10月27日，美国斯坦福大学医学院Maria Grazia Roncarolo教授研究组在Science Translational Medicine上发表题为Alloantigen-specific type 1 regulatory T cells suppress through CTLA-4 and PD-1 pathways and persist long-term in patients的研究论文，描绘了Tr1 细胞的独特分子表型和作用机制，对深入理解Tr1 的细胞生物学特征及设计新型造血干细胞移植临床策略具有一定意义。在这项研究中，研究者利用T-allo10构建了稳定的、可重复的CD45RA - CD49b + LAG3 + Tr1细胞，并验证其表达Tr1特异的细胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-22、IFN-γ），且具有同种抗原特异性。作者采用TCR-seq系统表征Tr1细胞，发现Tr1 细胞分化可能导致其TCR免疫组库的多样性降低。为了探索Tr1细胞的转录组特征，作者利用RNA-seq测序并发现了其若干特征基因，包括IL10、LAG3、ITGA2 (CD49b)、IFNG、PRF1、GZMB、GZMA等。Tr1细胞亦高表达Treg细胞相关基因，如CTLA4、LGMN (legumain)、TNFRSF4 (OX40) 、TNFRSF18等。为了进一步探索如何靶向同种异体抗原特异性 Tr1 细胞，作者基于转录组测序结果推测CTLA-4 或PD-1 通路可能对于Tr1 细胞至关重要。因此，作者阻断了这些通路，发现CTLA-4 阻断几乎完全消除了 T-allo10 介导的对应答Teff细胞增殖的抑制，PD-1/PD-L1 阻断也具有类似的效果。最后，作者研究了体外培养产生的Tr1 细胞的临床意义。研究者综合利用了正在进行I期临床试验（NCT03198234）【5】 的前三名患者的临床样本。结果表明，T-allo10细胞治疗过继转移后的24小时内，患者2和3外周血中的 Tr1 细胞频率达到峰值。在治疗后第 28 天，患者1的Tr1细胞比例仍达11.6%。作者进一步利用TCR-seq发现外周血循环的部分Tr1细胞携带与T-allo10疗法输入时的Tr1 细胞相同的TCR克隆型，表明过继转移的 Tr1 细胞可能在体内长期存在。综上，该工作系统探索了CD45RA- CD49b+ LAG3+ Tr1细胞的免疫表型、免疫组库、活化的分子及通路特征，并发现阻断CTLA-4/PD-1可作为Tr1 细胞的潜在抑制剂。值得一提的是，在能够反映患者真实情况的临床样本中，研究者发现T-allo10疗法过继转移的 Tr1 细胞可在体内长期存在，这对基于Tr1的造血干细胞移植新型治疗策略的设计和追踪提供了重要线索。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.abf5264

在上篇推送中，为大家介绍了珀金埃尔默生命科学产品线从抗体互作、免疫细胞活力和肿瘤细胞行为三个方面提供ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）整体解决方案。在这篇推送中，会给大家预告在2020中国细胞生物学会年会上，珀金埃尔默生命科学试剂在ADCC中的详细应用。治疗性单克隆抗体是迄今为止最有效的生物疗法之一。所有目前批准通过的抗体均为IgG，并可进一步分为四个亚型(即， IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)。不同的亚型所介导的ADCC效应不同，因此选择不同的IgG亚型，以及对Fc进行修饰可以调节ADCC效应，来满足不同的治疗需求。检测ADCC效应，珀金埃尔默生命科学试剂现可提供基于HTRF技术的细胞水平的Fc/FcγR结合assay、基于AlphaLISA技术的生化水平Fc/FcγR结合assay、基于HTRF技术的ADCC相关biomarker的定量assay、基于DELFIA技术的细胞杀伤检测assay。详细的实验原理会在会议上为大家详细介绍。HTRF（均相时间分辨荧光）技术：基于时间分辨荧光（TRF）和荧光共振能量转移（FRET）两大技术原理。将荧光的灵敏性、均相免洗和低背景等特点结合在一起。广泛用于GPCRs，激酶，细胞因子，磷酸化蛋白，表观遗传，生物大分子（抗体）等靶点的检测和定量。HTRF技术已在基础研究，新靶点发现和验证，高通量筛选，候选化合物优化等阶段有全面应用。ALPHA（放大化学发光接近性均相实验） 技术：基于微珠的均相高灵敏度检测技术， 其检测形式灵活多变， 适用于细胞因子， 生物大分子筛选， 第二信使， 生化及细胞水平表观遗传学研究， 激酶磷酸化检测， 及多种相互作用的检测。DELFIA（解离增强镧系元素荧光免疫检测）技术：技术使用镧系螯合物 (Eu, Sm, Tb, Dy） 标记的试剂， 通过洗涤分离去除掉未被结合的试剂， 结合时间分辨荧光 (TRF) 检测从而检测体系中被标记的某种目的化合物或生物分子。 相比普通荧光基团的纳秒级衰变时间， 镧系元素荧光寿命可达微秒甚至毫秒级，结合时间分辨检测可显著降低自发荧光背景干扰， 且其具有很宽的Strokes’ shift， 可极大得提高检测信噪比和灵敏度。 8月4日中午12:00-13:00，珀金埃尔默将在细胞生物大会现场G107会议室举办技术交流午餐会，我们的技术专家将就珀金埃尔默设计产品在ADCC中的应用做更详细的介绍。另有多场干货报告和精美礼品等您来参与！ 点击下方链接完成签到，即可在会议期间至珀金埃尔默展台领取精美礼品一份！http://wx.custouch.com/OauthLink/preauth/wx898a40f01b0e70bc?r=http://wx.custouch.com/OauthLink/proxy/app/wx898a40f01b0e70bc?r=https://wechat.custouch.com/question/t/wx898a40f01b0e70bc/5f02be35fdf42c1600ca902d

项目编号：GXTC-A1-22130377项目名称：武汉大学全光谱流式细胞分析仪预算金额：300.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：300.0000000 万元（人民币）采购需求：序号货物名称主要功能数量交货期质保期交货地点是否接受进口产品1全光谱流式细胞分析仪测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可以检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞因子、细胞内DNA、RNA含量等；它可对群体细胞在单细胞水平进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，从同一个细胞无需滤光片即可轻松对20多及以上个荧光标志物进行同时检测，全面统计其表达水平。1台合同签订后90日内本项目免费质量保证期要求不低于贰年。免费质量保证期从货物供货、安装、调试正常且经采购人确认验收合格之日起算。武汉大学泰康医学院（基础医学院）接受2配套附件：质控微球1盒合同履行期限：交货期：合同签订后90日内本项目( 不接受 )联合体投标。

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

责任 / 与 / 使命新型冠状病毒疫情爆发以来， 疫情抗战一线对各种医疗物资的需求仍在持续增加。Cytek公司作为医疗行业的一份子，一直关注着疫情的发展，同样也承担共同抗击疫情的责任与使命。/ 捐赠 /近日，Cytek中国分公司上海厦泰生物科技有限公司经过与一线的多次沟通，决定向疫情最为严重的湖北地区（湖北武汉中部战区医院）捐赠一台Cytek公司自主研发的分析型流式细胞仪（Cytek DxP Athena），为奋战在一线的医务工作人员贡献来自Cytek人的一份力量。仪器已于本周运达武汉。/ 流式细胞仪 /流式细胞仪主要用于新型冠状病毒肺炎的诊断和治疗过程中，对淋巴细胞亚群和细胞因子风暴的检测。在国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》，北京协和医院关于“新型冠状病毒感染的肺炎”诊疗建议方案（V2.0）等诊治指南中，均提到了淋巴细胞亚群，细胞因子等的检测需求。Cytek希望通过捐赠仪器的方式，为一线医务人员开展流式细胞术相关检测提供更多便利，以协助医务人员尽快了解感染者的免疫状态，更好的判断疾病进展及预后，为诊治患者提供更多可靠的依据。

“世界心脏日今天9月29日是世界心脏日(World Heart Day)，是由世界心脏联盟确定，旨在世界范围内宣传有关心脏健康的知识，并让公众认识到生命需要健康的心脏。在全世界范围内，心血管疾病是威胁人类健康的高危病种，其危害无年龄、身份、地域之分。在中国，每年大约有260万人死于心脑血管疾病，死亡人数位列世界第二。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出，每5例死亡中就有2例死于心血管病。急性心肌梗死(MI)是一种常见的由突发冠状动脉血栓形成和闭塞引起的心脏急症。急性心肌梗死期间持续的缺血组织损伤导致疤痕形成，进而可能心力衰竭。心肌梗死后形成的新血管可减轻疤痕和心功能恶化。然而心肌梗塞后形成血管生成和功能适应的细胞间的相互作用仍不完全清楚。下面跟随小编来看一下德国汉诺威医学院的研究人员今年发表在《Science》上的“心脏知识”。德国汉诺威医学院Kai C. Wollert研究团队发表题为Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase的研究。通过对急性心肌梗死的小鼠进行生物信息学分泌组分析，发现细胞因子METRNL(Meteorin-like) 在梗死边界区内皮细胞高度表达，促进心肌梗死后的血管生成、组织修复和功能适应。使用化学交联质谱法发现，KIT（受体酪氨酸激酶）是内皮细胞中METRNL细胞表面受体。为了评估METRNL是否与KIT的细胞外结构域结合，通过微量热泳动（MST）技术，检测到KIT-ECD-Fc可结合METRNL和SCF（KIT已知配体），并且亲和力很高（Kd分别是87nM和175nM）,而不与血管内皮生长因子A(VEGFA)结合。Pull Down实验获得相同的结果。图注：MST技术和Pull Down检测KIT的胞外结构域与METRNL，SCF和VEGFA结合随后，作者检测时发现METRNL的治疗会增强心肌梗死区域边缘的毛细血管化，限制瘢痕的形成并对心脏功能具有持续有益的影响。研究结果: 作者定义了一种基于METRNL的髓系细胞和内皮细胞之间的交叉信号，METRNL通过KIT依赖的信号通路介导内皮细胞的血管生成作用促进心肌梗死后组织修复，为急性心肌梗死的治疗提供了新的药物靶点。心脏是人体最重要的器官之一，无论工作或者科研再忙碌，一定要注意休息。马上就要国庆节了，让我们一起为劳苦功高的心脏放个假吧！文献参考：Reboll, Marc R., et al. "Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase." Science 376.6599 (2022): 1343-1347.*文内部分图片来源自百度，侵则删。