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(1)细胞核的分离: 将培养的细胞制成细胞混悬液,或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核(Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 )。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后,使核从细胞分离,细胞核混悬液浓度为4~5×106细胞核/ml。(2)细胞固定和酸的处理:在5 ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10 min。在4 ℃离心(×150 g)10 min。重复加三次冷的100%酒精入试管内,离心,倾去。置于冰上10 min,再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1 n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10 min。加入IBM-0.25%Triton X-100(IBM配方:50 mmol/l KCl, 10 mmol/L MgSO4, 5 mmol/L HEPES pH8.0)。再离心,重复IBM漂洗(这时细胞核可在不染色情况下,以荧光显微镜观察)后,以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min,继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5 mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液,加IBm -Triton X-100漂洗,离心,使细胞核混悬液最终浓度为108/ml,(可用IBM-Triton X-100稀释约50倍,在血球计数器计数),混悬液镜检应含单个,完整的细胞核。(3)细胞核混悬液杂交①配制杂交混合液:甲酰胺5份,20×SSC1份,50%硫酸葡聚糖2份,pH调至7.0。此原液(stock solution)可贮存在4 ℃冰箱内。应用时加1份10 mg/ml鲱鱼精子DNA(herring sperm DNA)。②混合1 μl的细胞核混悬液(108/ml)与18μl的杂交混合液,充分混匀。将此19 μl混合液移入1.5 ml容积的Eppendorf 管中(核含量约为105)。③加入100 ng/每管的AAF标记DNA探针(如为生物素标记DNA探针浓度为20~40 ng/每管)。④置70 ℃10min使DNA探针和核DNA变性。⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较,不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应,而应迅速转入37 ℃孵育过夜。(4)杂交后漂洗在每管中加入1.25 ml 50%甲酰胺-2×SSC(pH7.0),在42 ℃静置10~15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100 μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞(107/ml)混匀,离心,室温,10min,轻弹试管使沉淀的小块散开,加入1.25 ml 2×SSC(pH7.0),42 ℃,继之,静置于室温10~15min,如前离心,再加1.25 ml IBM-Triton X-100,室温静置5min,离心。注:DEMS处理红细胞方法:经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中,细胞含量为108/ml,以K2CO3和DEMS溶液处理3次,第1次:K2CO3为20 mmol/L,DEMS为3 mmol/L,以后2次:K2CO3依然为20 mmol/L,而DEMS为10 mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中,应用100 mmol/l K2CO3将pH调至9~10。在25 ℃,15min后,加入50 μl,100 mmol/l 的柠檬酸(citric acid)/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后,用2×SSC稀释到108/ml,加0.1%叠氮钠可在4 ℃保存至少1年。(5)AFF标记的荧光显示:加200 μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清(NGS),轻轻振荡混匀,室温静置10min,加20 μl 1:100的单克隆抗AFF抗体,37 ℃孵育45min,加1.25 ml的PBS-Tween,室温静置10min,加20间歇性振荡,离心,倾去上清液,加200 μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡,室温静置10min,加20 μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清,稀释度1:100~1:300。孵育于37 ℃ 45min,加1.25 ml PBS –Tween,室温静置10min,离心,倾去上清液。(6)生物素标记探针的荧光显示:加200 μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10 min后,加20 μl抗生物素标记FITC抗血清15 μg/ml,孵育在37 ℃ 30min,以1.5 ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次,加入1.25 ml IBm –Triton X-100,室温静置10~15min,间歇振荡、离心。(7)荧光显微镜观察:将细胞核混悬液稀释于250 μl的IBM-Trion X-100中,轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上,选择适当的激发波长观察。(8)流式细胞计:将750 μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪(Flow cytometry, FCM),DEMS处理过的红细胞作为对照(Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT)。
900万像素显微镜摄像头加在生物显微镜上所拍细胞核移植显微图片:[IMG]http://mshot.cn//uploadfile/b/RxCGPWaeCYhTU1tWiNYo.jpg[/IMG]
目前血细胞分析仪检测原理包括电学和光学两种,电学包括电阻抗法和射频电导法,光法包括激光散射法和分光光度法。电阻抗法根据Coulter原理及血细胞非传导的性质,以电解质溶液中悬浮的血细胞在通过计数小孔时引起的电阻变化进行检测为基础,进行血细胞计数和体积测定。当有细胞通过小孔时,由于电阻增加,于瞬间引起电压变化及通过脉冲。细胞体积越大,脉冲振幅越高,细胞数量越多,脉冲数量也越多。脉冲信号经过:放大、阈值调节、甄别、整形、计数而得出细胞技术结果。电阻抗法可准确量出细胞(或类似颗粒)的大小,是三分类血液分析仪的主要应用原理,并与光学检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。激光散射法应用了流式细胞术检测原理及细胞通过激光束被照射时,产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。对经信号检测器接受的散射光信息进行综合分析,即可准确区分正常类型的细胞。激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时,比电阻抗法分群更加准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。射频电导法是用高频电磁探针渗入细胞膜脂质可测定细胞的导电性,提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质、颗粒成分等特征信息。射频电流是每秒变化大于10000次的高频交流电磁波,能够通过细胞壁。分光光度法是所有类型的血细胞分析仪检测血红蛋白的原理,它利用血红蛋白与溶血剂在特定波长下比色,吸光度的变化与液体中血红蛋白含量成比例。