双光室光谱仪

意大利GNR有一款直读光谱仪S7采用的是双光室设计：两个分光室同步工作，既具有CCD直读光谱仪的多元素检测优势，也具有光电倍增管低检出限、高精度的分析优势，很有独到之处。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191700_667567_1841897_3.jpg

直读光谱CCD和PMT双光室结构示意图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/04/201304121156_435072_1841897_3.jpg左面是PMT光学室，右面是CCD光学室。

[align=center][b]双光子激光扫描显微镜的检测模式及其在生物医学领域的应用[/b][/align][align=center][font=宋体]刘皎[/font][sup]1[/sup]，吴晶[sup]1[/sup][/align][align=center]1. [font=宋体]北京大学医药卫生分析中心，北京，[/font]100191[/align][b][font=黑体][[/font]摘要] [/b]双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scan microscope, TPLSM[font=宋体]）具有低光毒性、高时空分辨率、高信噪比等优点，结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究领域。本文结合作者所在的北京大学医药卫生分析中心共聚焦平台的工作经验，概述了[/font]TPLSM适用的样本、检测模式以及在生物医学领域的应用，以期为相关科研技术人员提供参考。[b][font=&][Abstract][/font] [/b]Two-photon laser scan microscopy (TPLSM) has the advantages of low phototoxicity, high spatial and temporal resolution, and high signal-to-noise ratio.TPLSM combines laser scanning confocal microscopy with two-photon excitationtechnology and it is widely used in brain science, immunology, tumor, embryodevelopment and other biomedical related research fields. Based on the author'swork experience in the confocal center of Peking University Medical and HealthAnalysis Center, this paper summarizes the applicable samples, detection modesand applications of TPLSM in the biomedical field, in order to provide referencefor related scientific researchers and technicians.[b][font=黑体][[/font]关键词] [/b]显微镜双光子，检测模式，应用[b]1 引言[/b]双光子激发技术的基本原理是在高光子密度情况下，荧光分子可同时吸收2个长波长光子，产生一个一半波长光子去激发荧光分子的相同效果。双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scan microscope, TPLSM[font=宋体]）在激光扫描共聚焦显微镜的基础上，以红外飞秒激光作为光源，长波长的近红外激光受散射影响小，易穿透标本，可深入组织内部非线性激发荧光，对细胞毒性小且具有高空间分辨率，适合生物样品的深层成像及活体样品的长时间观察成像[/font][1]。使用高能量锁模脉冲激光器，物镜焦点处的光子密度最高，在焦点平面上才有光漂白及光毒性，焦点外不损伤细胞。双光子效应只发生在焦点处，所以双光子显微镜无需共聚焦针孔，也能做到点激发点探测，提高了荧光检测效率[2]。[b][/b]双光子激光扫描显微镜显微镜可以通过XYZ，XYT，XYλ，XYZT，XYλT等多种模式实现多维成像，亦可进行更复杂实验的拍摄，比如二次谐波成像（Second Harmonic Generation Imaging,SHG[font=宋体]）、双光子荧光寿命成像（[/font]Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, TP-FLIM[font=宋体]）、荧光寿命[/font]-[font=宋体]荧光共振能量转移成像（[/font]FluorescenceLifetime - Fluorescence Resonance Energy Transfer Imaging, FLIM-FRET[font=宋体]）等实验以满足对样品的定性、定量、定位、共定位等多维度多功能的研究。[/font]TPLSM已成为生命科学各领域重要的研究工具，可在细胞及亚细胞水平对活体动物的神经细胞形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象进行直接的长时间成像监测，还能进行光激活染及光损伤等光学操纵，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究[3-5]。本文拟通过按TPLSM常见的检测模式分别阐述其在生物医学领域的应用，以其为相关科研技术人员提供参考。[b]2. TPLSM适用的样本[/b]TPLSM适用的样本非常广泛，从液体、固体等形式的材料或制剂、细菌、细胞、细胞团、类器官、组织切片、到各种模式动物（如线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猴等）及其[font=宋体]脑、脊髓、肝脏、肺、皮肤等器官[/font]，都可以通过搭载不同载物台进行测试。相对于传统激光扫描共聚焦显微镜200μm的成像深度极限，双光子显微镜成像深度可达800μm，如果是透明化样品可更厚。TPLSM尤其适合活体动物成像，且比小动物荧光成像有更高的分辨率和信噪比，一般TPLSM的XY轴分辨率为200 nm左右，Z轴分辨率为300 nm左右。[b]3. TPLSM的检测模式[/b]3.1 二维成像模式TPLSM可以实现点扫描、点探测，得到生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像，从而获得细胞/组织等光学切片的物理、生物化学特性及变化。也可以对所感兴趣的区域进行准确的定性、定量及定位分析。激光扫描显微镜的zoom功能，可以用来调节扫描区域的放大倍数。但受物镜分辨率的限制，一味的增大zoom值，不能得到相应的高清图像，需根据实际情况参考piexl size进行设定。TPLSM可以实现XY、XZ或XT的二维成像模式，XT线扫会在后文与XYT时间序列成像一起进行举例说明（图2b）。3.2 三维成像模式3.2.1 Z轴序列三维成像（XYZ）[align=left]TPLSM可沿Z轴方向通过电动载物台的连续扫描对样品进行无损伤的光学切片（XYZ），获得三维立体图像。同理，通过沿Y轴方向连续扫描，可获得连续的XZY图像。如图1所示TPLSM[font=宋体]可以顺利观察到可以观察到血管清晰形态结构：单个胚胎的胎盘微血管（图[/font]1a）、肝脏血窦微血管（图1b）和后肢微血管（图1c）[6]。[/align][align=center][img=,690,230]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212151626576232_4807_3237657_3.png!w690x230.jpg[/img][/align][align=center]图1（a）胚胎胎盘微（b）肝脏血窦和（c）后肢的微血管三维成像[/align]3.2.2 时间序列扫描模式（XYT）[align=left]按照一定的时间间隔重复采集，则可实现对该样品的实时监测（XYT）。此类实验可观察组织区域内特异荧光探针标记的单个细胞或细胞内不同部位接受刺激后的整个变化过程。[font=宋体]如图[/font]2[font=宋体]（[/font]a[font=宋体]），可以根据微血管[/font]XYT[font=宋体]序列扫描的成像结果中某一血细胞在前后两张图的位置移动和这两帧图的扫描时间间隔计算血流速度。若血流速度很快，[/font]XYT扫描不足以捕捉实际流速，可以使用XT线扫计算。如图2（b），微血管XT扫描图像中绿色荧光背景里的黑色线条代表单个血细胞的流动轨迹，每条线条的横坐标代表血细胞移动的距离（distance / μm[font=宋体]），纵坐标代表此段时间（[/font]time/ ms[font=宋体]），根据这两个数据可以计算出单位时间内血细胞的流动速度（[/font]μm / ms）[6]。[/align][align=center][img=,690,262]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212151627102569_8367_3237657_3.png!w690x262.jpg[/img] [/align][align=center]图2 微血管（a）XYT扫描结果和（b）XT一维扫描结果图像计算血流说明示意图[/align]3.2.3 光谱扫描模式（XYλ/XYΛ）通常配置有可调节接受范围的检测器的TPLSM，可以实现从400nm-800nm的发射波谱扫描。通过配置具有连续可调波长的双光子激光器，还可以实现750nm-1300nm激发波谱扫描。这对于开发研制特殊染料探针的课题来说是很方便、全面的检测功能。3.3四维成像模式（XYZT/XYλT/XYΛT）基于上述三维成像模式，结合时间序列扫描，可以实现TPLSM的四维成像。3.4二次谐波成像（SHG）SHG是一个二阶非线性过程，且一般为非共振过程，适合富含胶原纤维的样本成像，如角膜、鼠尾肌腱、皮肤等。生物组织产生的二次谐波最主要的转换源自胶原，不同生物组织中的二次谐波信号强弱与组织中的胶原含量密切相关，含胶原丰富的组织包括结缔组织和肌肉组织等二次谐波信号也比较强，另外还有一些能产生强二次谐波的生物结构是微管，如细胞分裂中纺锤体。对于具有中心对称性的生物结构，如果局部中心对称性的破坏也会产生二次谐波：在两中心对称介质的界面，不同物态分子的相互作用使局部微观场特性在交界面（如细胞膜）发生突变，从而产生界面二次谐波[7]。除了动物组织外，一些含有特殊分子结构的植物组织也能产生二次谐波。二次谐波显微成像具有高空间分辨率、深成像深度、低损伤、以及对结构对称性的高度敏感性的特点，如果能与其他成像技术结合，将成为生物样品研究的有力工具[8]。3.5双光子荧光寿命成像（TP-FLIM）[9]FLIM技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法。荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，因此其不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响，且能区分荧光光谱非常接近的不同荧光团，故具有非常好的特异性和很高的灵敏度。此外，由于荧光分子的荧光寿命能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移，因此FLIM技术常被用来实现对微环境中许多生化参数的定量测量，如细胞中折射率、黏度、温度、pH值的分布和动力学变化等，这在生物医学研究中具有非常重要的意义。目前FLIM技术在细胞生物学中一些重要科学问题的研究、临床医学上一些重大疾病的诊断与治疗研究以及纳米材料的生物医学应用研究等方面均有广泛应用，并取得了许多利用传统的研究手段无法获取的数据。FLIM检测需要脉冲激光，TPLSM带有的高能量锁模脉冲激光器可以满足激发要求。3.6荧光寿命-荧光共振能量转移成像（FLIM-FRET）[10]传统的FRET过程分析通常是基于荧光强度成像来实现，分析的结果容易受光谱串扰的影响。而将FLIM技术应用于FRET过程分析，利用FLIM技术可定量测量这一优势，可非常灵敏地反映供体荧光分子与受体荧光分子之间的能量转移过程。当受体分子与供体之间的距离10nm时，供体的能量转移到受体，受体从基态发生能量跃迁，从而影响供体的荧光寿命。与没有受体分子的时候相比，发生FRET的供体分子的荧光寿命降低。因此，FRET-FLIM联合能够实时监测生物细胞中蛋白质的动态变化，如蛋白质折叠、分子间（蛋白-蛋白，蛋白-核酸）相互作用和细胞间信号分子传递、分子运输以及病理学研究等。[b]4 结论和展望[/b]综上，TPLSM应用灵活，具备多种检测模式，适用于多种样本，亦可实现多种实验目的，如荧光的定量、定性、定位、共定位，动态荧光的测定等。一些特殊的实验模式，将TPLSM在生物医学领域的应用进一步扩大。通过结合其他技术（多手段联合拓展，如膜片钳、原子力显微镜、光电联用等），TPLSM必将成为助力生物医学领域研究的有力工具。双光子荧光成像由于具有天生的三维层析能力以及深穿透能力，在活体生物组织成像上广受欢迎。双光子显微镜镜下空间增大后，可广泛应用于猴、大小鼠、兔等较大的模式动物的活体成像。且可结合电生理技术、光遗传技术，广泛应用于麻醉、清醒或运行行为等生理状态下的动物脑科学神经相关研究，在单细胞、单树突精度上对神经元群体活动进行监控。如结合膜片钳技术，对活体脑组组急性切片神经元进行双光子深层成像[11]；结合光遗传技术，实现视觉皮层同一神经元和神经元群体的稳定操控和长期多次重复记录[12]；对在健身球上移动的头部固定小鼠小脑进行成像，探讨觉醒状态和运动行为对胶质网络中钙离子的激发的影响[13]；结合多种疾病模型，探讨大脑皮层神经元及胶质细胞活性的改变及作用等[14]。随着多种双光子显微镜系统的出现，双光子显微镜成像技术将以其实时、无损地探测、诊断及检测能力，在生物医药及临床医学应用中发挥更大作用。[b]参考文献[/b][1] [font=宋体]李娟[/font],[font=宋体]张岚岚[/font],[font=宋体]吴珏珩[/font].[font=宋体]双光子显微镜的应用优势与维护要素[/font][J].[font=宋体]中国医学装备[/font],2021,18(12):158-163.[2] HendelT,Mank M, Schnell B,et al.Fluorescence changes of genetic calcium indicatorsand OGB1correlated with neural ac tivity and calcium in vivo and in vitro[J].JNeurosci, 2008,28(29):7399-7411.[3] DolginE.What leva lamps and vinaigrette can teach us about cellbiology[J].Nature,2018,555(7696):300-302.[4] Noguchi J,Nagaoka A, Watanabe S,et al.in vivo two-photon uncaging of glutamate revealingthe structure-function relatio nships of dendritic spines in the neocortex ofadult mice[J]. 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直读光谱有两个火花台是值得推荐的，假如你想分析不同的基体，第二个火花台可以完成另一基体的分析，既可以同时完成双基体分析，这就扩展了直读光谱的功能。当一个火花台用之前必须先清理时，另一个火花台可以在同时有效的使用。这大大提高了分析操作的效率，也节省了操作者的时间，也即提供了额外的帮助。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409251417_515563_1841897_3.jpg

[color=#444444]做超低浓度的双酚A（溶剂为二氯甲烷）的紫外光谱，发现两个峰，已知其中一个是苯环的共轭，那么另一个可能代表什么呢？[/color][color=#444444][img=,690,538]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/06/201906111056129720_7002_1806906_3.png!w690x538.jpg[/img][/color]

为了解决日益突显的能源、环保问题，新能源行业越来越受到世界各国的关注。锂电池行业作为国家重点扶持新能源项目发展较为迅速。近两年，中央和地方各项扶持政策协同效果逐渐显现,我国的新能源汽车市场出现了超预期发展和增长，并带动了产业链上下游企业的高速增长尤其是锂电池行业, 随着新能源汽车销量的进一步提高，业内预计，2018年锂电池或将进入供应紧张的阶段,强烈的需求对锂电池的产品技术、工艺、性能提出了更高的要求，更进一步凸显了产能的不足。目前国际上大多采用先进的激光焊接技术对锂电池的电池芯及保护板进行焊接。随着制造业的不断发展，大力发展高端制造技术，如何提高激光技术在锂电池制造领域的技术水平、如何升级优化激光焊接设备的整体性能，成为目前各个厂家研究的重点。在运动平台部分，直线电机相较于滚珠丝杆有更优的动态性能，更精密的定位精度及重复定位精度，更高的稳定性，更低的维护成本。用直线电机传动平台替换滚珠丝杆运动平台已成为必然趋势。激光焊接技术特点及难点: 激光焊接是一个将正负极材料、隔膜和电解液等原材料化零为整的融合制造过程，是整个锂电池生产流程中的关键工艺。激光焊接是利用激光束优良的方向性和高功率密度等特点来进行工作的。激光焊接有以下特点：激光功率密度高，可以对高熔点、难熔金属或两种材料进行焊接 聚焦光斑小，加热速度快，作用时间短，热影响区域小，热变形可忽略；激光焊接属于非金属焊接，无机械应力和机械变形；激光焊接装置易于计算机联机，能精确定位，实现自动焊接。锂电池模组通过高效精密的激光焊接可以大大降低接触电阻，降低能耗，提高电池的安全性、可靠性和使用寿命。但激光焊接要求焊件装配精度高，且要求激光束在工件上的位置不能有显著偏移。若焊件装配精度以及激光束定位精度达不到要求，很容易造成焊接缺憾，影响焊接质量。激光焊接技术的特点以及锂电池的结构性能对激光焊接设备的运动平台提出了更高更精密的要求。双轴联动直线电机平台技术特点及难点： 直线电机的本质是把旋转电机平放展开并直接连接到驱动负载上。它能替代例如滚珠丝杠、齿条与齿轮、皮带与皮带轮和减速箱的所有机械传动部分，从而消除了齿隙以及与机械传动相关的问题。具有结构简单、调速范围宽、动态性能优良、定位精度高、安全可靠、运行噪声低、无磨损、免维护以及无限行程等优点。灵猴双轴联动直线电机平台加速度可达5g、重复定位精度可达1μm并且在深度优化结构设计的基础上采用独特自主编写控制算法，跟踪检测速度波动，并作出后续补偿，使双轴直线电机在高速度走曲线小圆弧运动条件下,速度波动在3%以下,轨迹偏差更是在微米级别。完全满足锂电池激光焊接对平台精度、加速度、速度等性能的要求。日前有某激光焊接设备厂商客户的设备运动平台采用的是丝杆模组，但在其加速度为1g、速度提到100mm/s时其设备的焊接质量将无法保证，现需求双轴联动直线电机平台以替代丝杆平台模组并明确要求提供包括圆弧转角在内的跟随误差测试报告，但该客户对直线电机运动平台并不了解，故向我公司寻求解决方案。经过与客户的数次技术交流，在完全理解掌握客户设备的特性信息后设计了初版双轴联动直线电机运动平台模组，但是其要求的运动平台的运动轨迹的圆弧转角要求较小，且其速度及精度要求较高，经过我司对双轴联动直线电机平台的结构优化，定制化编写算法控制上下两轴的耦合，经过详细的系统测试，最终满足客户的需求，升级优化了客户的激光焊接设备，使其设备的焊接速度、精度以及稳定性在同行业处于领先地位。客户要求如下：[b]直线电机需求表 [/b]客户名称：[u] 某激光焊接设备集成 [/u]运用行业：[u] 锂电池激光焊接 [/u]联系人电话：[u] [/u]电子邮箱：[u] [/u]运动轴运动方式 ：□水平 √ □垂直速度规划曲线：□1/3-1/3-1/3梯形波 √ □1/2-1/2三角形波总的运动行程：[u] 上轴270mm、下轴300mm [/u]mm总的运行时间：[u] 1.8s [/u]s最大运行速度：[u] 0.5 [/u]m/s最大运行加速度：[u] 3g [/u]m/s2负载重量：[u] 30 [/u]kg精度定位精度：[u] ±5 [/u]μm重复定位精度：[u] ±1 [/u]μm分辨率：[u] 0.1 [/u]μm放大器和电源最大电流：[u] 6.3 [/u]A电压：[u] 220 [/u]VAC □50 Hz √ □60Hz使用环境环境温度：[u] 室温 [/u]℃最大允许温升：[u] 130 [/u]℃是否在无尘环境中： □是 √ □否是否允许水冷或空气冷却：□是 □否 √是否是真空环境： □是 √ □否硬件总体设计及验证系统配置: 双轴联动直线电机运动平台主要由:直线电机、检测反馈、驱动控制，防护装置四部分组成。该运动平台选用无铁芯直线电机，运动平滑无齿槽力；检测反馈由光栅或磁栅、霍尔、温控组成；此平台模组选用的是高创驱动器，防护装置由风琴防护罩、高性能拖链、光电传感器、优力胶硬限位组成，充分保护运动平台的安全可靠性。模型效果如图2所示： [img=十字滑台,554,415]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708311009_01_3294819_3.jpg[/img][align=center]图1:双轴联动模组模型[/align]双轴联动直线电机主要性能参数如图3所示： [img=,327,290]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708311010_01_3294819_3.jpg[/img][align=center]图2:双轴联动模组性能参数[/align]验证测试根据客户设备的运动特点及轨迹，为保证客户设备在运行过程中的稳定性及可靠性，我们多次做了过需求验证并出具了相关的验证报告，运动平台的各项参数均符合客户需求，并做了相当于设备连续运行1.5年的耐疲劳测试，各项参数均无异常。经过多次技术交流、结构优化、测试验证，灵猴双轴联动直线电机运动平台仅在两周的时间就达到了客户的要求，满足了交付条件并实时在客户现场调试安装，直到客户设备完全出货,我们还积极跟踪我司产品在客户设备终端的运行状况以及各项数据,实时为客户设备提供可靠性报告。该客户“非标私人订制”的双轴联动直线电机运动平台模组上下两轴均采用自主研发的BUM系列无铁芯直线电机，该系列直线电机具有高推力、低运动质量、无齿槽效应、无磁吸力等特点，特别是在走曲线圆弧轨迹时，可实现高速度小圆弧转角下的低速度波动。在使用了双轴联动直线电机运动平台后，使其焊接速度提高50%，提高了其圆弧转角处的焊接质量，升级优化了客户整体设备的性能，提高客户设备销量的同时也增加了直线电机模组的销量，真正实现了双赢价值。直线电机平台模组除上述应用外，还有在医疗行业应用的超薄十字蛇形运动平台模组，其整体尺寸大小仅有圆珠笔大小；在3C行业中的视觉检测以及点胶平台上的快速移动的四轴联动直线电机模组；在机床以及快速搬运行业的LPS系列单轴平台模组；可以完全直接替换丝杆的SP标准系列单轴平台模组等等。随着制造行业越来越苛刻的要求，现代先进制造装备向着高速度、高精度、快响应、大行程的趋势发展。这必然要求一个反应灵敏、高速、轻便的驱动系统，由于传统的进给方式—“旋转电机+ 滚珠丝杠”需要联轴器、丝杠等中间传递环节，造成整体系统刚性不够、弹性变形严重，又因为该“间接传动”中丝杠精度很难提高、存在反向间隙等缺点，使得传统的进给系统无法达到上述要求。相对而言，直线电机具有结构简单、安装方便、无接触、无磨损等优点，并在精度、重复定位精度、刚度、工作寿命等其他性能指标上都优于旋转电机。其主要推广与高速、高精等旋转电机无法满足要求的场合。现代直线电机技术日益成熟，其势必取代传统的“旋转电机+ 丝杠”的传动模式。