基因芯片分析

基因芯片技术进展及应用 作者：刘炎 [关键词] 基因芯片；核酸探针序列；杂交 1　基因芯片概述　　随着人类基因组计划( Human Genome Project)即全部核苷酸测序的即将完成，人类基因组研究的重心逐渐进入后基因组时代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多样性倾斜［1，2］。通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理，进而在人类重大疾病如癌症、心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大的作用。它将大大推动人类结构基因组及功能基因组的各项基因组研究计划。　　基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析［3，4］。基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。　　基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的，目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）或突变点的检测，表达型芯片的目的是在杂交实验中对多个不同状态样品(不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA 或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法［5］，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描。　　芯片制备方法主要包括两种类型：(1)点样法：首先是探针库的制备, 根据基因芯片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列［6］，然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。(2)原位合成法［7～10］：该法是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节, 靶基因在与芯片探针结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行逆转录，并加入偶联有标记物的dNTP，从而完成对靶基因的标记过程［11］，对于阵列密度较小的芯片可以用同位素，所需仪器均为实验室常规使用设备，易于开展相关工作，但是在信号检测时，一些杂交信号强的点阵容易产生光晕，干扰周围信号的分析。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱［12，13］，常用的双色荧光试剂有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可以大大提高芯片的准确性和检测范围，例如用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列，使它们同时与芯片杂交，通过不同荧光强弱的比较得出靶序列中碱基失配的信息［14］。　　基因芯片与靶基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影，若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，从而得到待测样品的相应信息。由于基因芯片获取的信息量大，对于基因芯片杂交数据的分析、处理、查询、比较等需要一个标准的数据格式，目前，一个大型的基因芯片的数据库正在构建中，将各实验室获得的基因芯片的结果集中起来，以利于数据的交流及结果的评估与分析。

1、基因芯片综合分析软件ArrayVision 7.0 一种功能强大的商业版基因芯片分析软件，不仅可以进行图像分析，还可以进行数据处理，方便protocol的管理功能强大，商业版正式版：6900美元。 Arraypro 4.0 Media Cybernetics公司的产品，该公司的gelpro, imagepro一直以精确成为同类产品中的佼佼者，相信arraypro也不会差。phoretix™ Array Nonlinear Dynamics公司的基因片综合分析软件。J-express 挪威Bergen大学编写，是一个用JAVA语言写的应用程序，界面清晰漂亮，用来分析微矩阵（microarray）实验获得的基因表达数据，需要下载安装JAVA运行环境JRE1.2后(5.1M)后，才能运行。2、 基因芯片阅读图像分析软件 ScanAlyze 2.44 斯坦福的基因芯片基因芯片阅读软件，进行微矩阵荧光图像分析，包括半自动定义格栅与像素点分析。输出为分隔的文本格式，可很容易地转化为任何数据库。 3、 基因芯片数据分析软件 Cluster 斯坦福的对大量微矩阵数据组进行各种簇（Cluster)分析与其它各种处理的软件。 SAM Significance Analysis of Microarrays 的缩写，微矩阵显著性分析软件，EXCEL软件的插件，由Stanford大学编制。4．基因芯片聚类图形显示 TreeView 1.5 斯坦福开发的用来显示Cluster软件分析的图形化结果。现已和Cluster成为了基因芯片处理的标准软件。FreeView 是基于JAVA语言的系统树生成软件，接收Cluster生成的数据，比Treeview增强了某些功能。 5．基因芯片引物设计 Array Designer 2.00 DNA微矩阵（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。

基因芯片及其在病原微生物检测中的应用基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术，它以其能够快速、高效、大规模地同步检测生物遗传信息的卓越功能而得到发展。在基因测序、基因表达分析、药物筛选、基因诊断等领域显示出重要的理论和实用价值。基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术。在固相支持物表面（常用的固相支持物有玻璃、硅片、尼龙膜等载体）有规律地合成数万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”或液相合成探针后由点样器有规律地点样于固相支持物表面；然后将要研究的目的材料中的DNA、RNA或用cDNA同位素或荧光物标记后，与固相支持物表面的探针进行杂交，通过放射自显影或荧光共聚焦显微镜扫描，对这些杂交图谱进行检测；再利用计算机对每一个探针上的杂交信号作分析处理，便可得到目的材料中有关基因表达信息。该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析。基因芯片分类基因芯片按其片基不同可分为无机片基芯片和有机合成片基芯片：如果按其应用不同，可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片；如果按其结构不同可分为DNA阵列和寡核苷酸芯片；如果按其制备方法不同可分为原位合成芯片和合成后交联芯片。目前，常用于基因芯片制作的固相支持物主要包括半导体硅片、普通玻璃片、尼龙膜等基质。它们各有优缺点，可根据不同的用途和目的选择使用。用硅片制作的芯片，其DNA探针排列的密度高，在1.28cm芯片上，可达40万点阵。检测灵敏度高但专一性差。用玻璃制作的芯片，可用于双色荧光标记杂交，便于杂交信号的检测，但其灵敏度低，而且对玻璃片的处理要求高。尼龙膜主要用于制作eDNA芯片，即将不同的eDNA片断点阵于尼龙膜上，它可用同位素标记检测，灵敏度高，专一性好，但是DNA阵列的密度低。DNA探针的制备及固化探针的制备及固化有2种方法：①在片基上原位合成寡核苷酸；②在片基以外制备DNA探针，并以显微打印等手段将其固化于片基上。作者介绍了待测DNA样品的制备、标记样品与基因芯片杂交、杂交信息的检测与分析、操作过程中存在的问题及解决办法。基因芯片可以对病原细菌检测、病毒的检测及其他方面如支原体检测等。问题和展望基因芯片在病原微生物检测中具有快速、灵敏、高通量、自动化等特点。但目前仍面临一些问题有待解决，这些问题主要体现在硬件和软件2个方面。在硬件方面，DNA芯片技术需要昂贵的尖端仪器，如生产原位合成芯片需要光刻机器和寡核苷酸合成仪；构建DNA微集阵列的自动仪器约需8万美元以上，而检测芯片则要激光共聚焦显微镜、落射荧光显微镜等设备，费用较高。在软件（即技术）上也存在一些问题。首先，探针制备的环节上，原位合成寡核苷酸技术复杂，且有专利保护，合成过程中有可能插入错误核苷酸或混入杂质，降低了特异性和信噪比；显微打印技术较灵活，易实现，但需收集或合成大量探针，且阵列的集成度不高。其次，在样品和芯片杂交的环节上 ，因为杂交在固相上进行，空间因素会对杂交造成不利影响；还有，在一个芯片上存在多种探针，这对杂交条件是个挑战，因为这种探针的最适条件未必适合另一种探针；而且，复杂的探针如长寡核苷酸容易自身形成二 、三级结构，影响与靶序列的杂交或给出错误的阴性信号，当然在其它技术环节上也存在着一些难题，如样品准备复杂、检测的灵敏度低等。虽然基因芯片技术在多个环节上有待提高，但它在生命科学及相关领域中已呈现出广阔的应用前景，相信随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片会成为基础研究和临床应用的强有力工具。