自动细胞反应器

生物反应器的应用生物反应器在生物技术，工艺开发和研究中发挥着至关重要的作用，其主要应用包括：1. 细胞株开发：台式生物反应器可用于评估各个细胞株的性能，包括生长和表达效率，这有助于确定最适合进行进一步工艺开发和放大的候选细胞株。2. 工艺开发：台式生物反应器广泛应用于工艺开发的早期阶段，包括了参数优化和工艺放大两方面，首先在较小规模上优化温度，pH，DO等工艺控制参数，然后再进行工艺放大研究，降低放大至较大体积的生物反应器中可能存在的成本和风险。更复杂的工艺开发包括了增强型工艺，例如灌流培养和连续培养。3. 培养基优化：台式生物反应器可以用于优化培养基和补料策略，以改善细胞生长、活力和蛋白质表达，有助于实现高效，稳定且成本可控的大规模细胞培养。4. 工艺表征：台式生物反应器可进行工艺缩小研究，在较小规模上模拟较大生物反应器的条件，有助于了解和解决工艺放大过程中可能出现的限制性因素，如氧气传质、混合效率、CO2分压和剪切力。5. 质量源于设计（QbD）：可以在台式生物反应器规模实施QbD开发原则，系统地研究和优化关键工艺参数，以确保产品质量的一致性。6. 临床样品制备：符合GMP要求的台式生物反应器系统，可用于临床前研究或早期临床试验中的小规模生产，以快速、经济地生产小批量的治疗性产品。Reference:cell culture bioprocess engineering, second edition细胞生长所处的生理压力生物制药中，CHO细胞作为常用的重组蛋白的表达体系，优化其生长和产物表达效率至关重要，然而生物反应器中CHO细胞却面临着多方面的生理压力，包括培养条件、营养供应和环境参数有关的各种因素，因此需要反应器提供良好的工艺参数控制，以维持合适的细胞生长微环境。 营养限制：CHO细胞的能量和生物合成严重依赖葡萄糖，葡萄糖浓度过低会导致细胞新陈代谢压力和活力降低；氨基酸是蛋白质合成所必需的，特定氨基酸含量不足会影响细胞生长和蛋白表达；细胞培养基中的生长因子、维生素和微量元素的不足也会影响 CHO 细胞的生理机能。 温度：温度波动会影响细胞的新陈代谢，对于细胞生长和蛋白表达通常所需最适温度不同，需要制定针对性控制策略。 pH值波动：pH 值的变化会导致培养基的酸化，影响分子的电离状态，并影响细胞的新陈代谢，维持pH值在最佳范围内对细胞活力和表达至关重要。 溶解氧浓度：溶解氧浓度过低会导致供氧不足，造成细胞应激，影响细胞生长和蛋白质表达。 二氧化碳分压：二氧化碳分压影响了pH控制，细胞代谢和生理功能，需要加以及时的检测和有效的控制策略。 渗透压：代谢物积累或营养浓度过高导致的高渗透压会对细胞造成压力，这会影响细胞体积大小调节和整体细胞功能。 剪切力：生物反应器中的搅拌和通气产生的能量耗散会对细胞造成剪切应力，过大的剪切应力会损伤细胞结构并影响其生产率。 代谢副产物：细胞新陈代谢产生的有毒副产物（如乳酸、氨）的积累会对细胞活力和蛋白表达产生不利影响。 细胞密度：高细胞密度和细胞聚集会导致营养和氧气的限制，造成压力，有效的混合和充分的氧气供应对防止这些问题至关重要。理解细胞所处的生理压力环境对于工艺条件优化，增强细胞活率，获得高表达产物和目标质量属性非常关键。工艺过程参数的控制在了解了细胞所处的生理压力之后，遵循质量源于设计（QbD）的指导原则，通过风险评估的方式确定关键工艺过程参数（CPP）, 重要工艺过程参数（KPP）及非重要过程控制参数（Non-KPP），制定参数各自的设定空间（DS），并在操作范围内进行控制，这整体上需要工艺过程分析技术（PAT）及生物反应器所配置过程控制策略，以提供一致的工艺性能和产品质量（CQA）。图片来源于网络生物反应器常用控制策略 开环控制：开环控制系统应用一组预定义的控制输入或设定点，而不连续测量实际输出，系统假定输入将实现所需的输出，而无需实时反馈。该控制策略的准确度依赖于高精度及快速响应的硬件配置。 闭环（反馈）控制：闭环控制使用传感器持续监测系统输出，将其与所需设定点进行比较，并实时调整控制输入以保持所需的条件。这种方法能更好地适应过程中的变化和干扰。该控制策略的准确度依赖于控制器模式，参数的预设和调节。 前馈控制：前馈控制可预测系统中的干扰，并在干扰影响输出之前调整控制输入。它是对反馈控制策略的补充。生物反应器控制器策略的应用 PID控制：PID 控制是一种闭环控制策略的实现形式，通过比较设定值和实际值（误差），使用比例、积分和微分项来计算控制输出。比例部分使用增益（Gain）乘以误差进行输出；积分部分累积 CV（控制输出）随时间变化的程度，以纠正误差；微分部分分析参数过去的变化率，并将其推断到未来，其动作单位为秒（你想推断多远），可以让回路在发生突发事件时迅速做出反应，但很容易受到测量噪音的影响。 PID同时可以结合死区（DB, Dead Band）来使用，例如pH的PID控制，细胞对于pH有一个适应范围，设定合适的DB值，避免酸，碱的反复添加和渗透压的升高。 级联控制：级联控制涉及主控制器与子控制器，主控制器的输出作为子控制器的设定值，从而更好地抑制干扰；子控制器可以为一个或多个，通过顺序级联或同时级联，以满足不同复杂程度工艺的需求。例如DO控制中，主控制器为DO PID控制器，子控制器为Air，O2，搅拌等控制器。 Profile控制：为控制器的设定值设定随时间变化的程序，控制器接受该设定值进行开环或闭环控制。例如补料泵的控制中，根据预测的细胞密度增加情况调整补料速度供给率，从而实现对营养物质浓度的前瞻性控制。复杂工艺应用需求常见的细胞培养方式为补料分批工艺（Fed Batch），需要多级的种子扩增步骤，主反应器中也需生长至稳定期进行蛋白表达，因此所需设备成本高，占地空间大，生产效率较低且产品质量一致性存在差异。随着灌流培养基，细胞截留设备及PAT技术等方面的发展，增强型工艺（Process Intensification）在生物制药中逐渐得以应用。根据对细胞和蛋白的截留，增强型工艺分为Concentrate Fed Batch, Dynamic perfusion及Continuous Perfusion等不同形式。Reference：Perfusion Cell Culture Processes for Biopharmaceuticals灌流工艺的开发通常在台式反应器中进行，相比Fed Batch系统具有如下组成及特点： 反应器从结构设计到工艺验证上应能支持系统长时间无菌培养的要求。 反应器的通气及搅拌系统配置应当满足高细胞密度培养对于传质和混合的要求，并进行充分的表征，以评估放大过程中的限制性因素。 细胞截留装置：支持切向流或声学细胞截留装置的无菌连接，截留装置控制器可选择接受生物反应器控制，细胞在截留装置中所受的生理压力（剪切力，温度变化，溶解氧浓度等）应当加以控制。 PAT整合：系统应当支持额外的电极整合，实时监控细胞密度、活力、二氧化碳分压等关键参数。 外置设备的拓展：可拓展外置天平等设备。 自动化控制系统：系统应配置自动化灌流程序或配方，实现高精度自动化的灌流速率，反应器液位及细胞密度控制，减少灌流工艺长时间培养过程中复杂的人为操作所带来的风险。英赛斯NestoBR台式生物反应器NestoBR是一款基于生物工艺进行设计和研发的先进型台式生物反应器系统，应用于生物制药及生物技术等方向的工艺研究和开发，系统设计满足生物行业对于反应器的高性能及法规方面的要求，可降低用户实验的批次失败风险，提高工艺开发能力，加速生命科学的研究发现，实现稳健化的技术转移。NestoBR产品特点紧凑化的结构设计：集成式工业控制器，直观的用户界面与交互；减少设备空间需求，易于使用。严格的材料选择及处理：高硼硅玻璃，耐高温，耐腐蚀；316L不锈钢，表面抛光及钝化处理，，易清洗，易清洁；垫圈采用EPDM材质，符合cGMP要求。基于工艺理解的产品设计：从细胞生所处的生长微环境出发，进行功能设计，拓展工艺可操作空间，保障批次稳定。丰富的高性能硬件配置：灵活的硬件配置方案，满足不同细胞或工艺在培养体积、温度控制、搅拌控制、通气控制等工艺方面的差异化要求。高级自动化软件架构：ISA88批处理控制高级自动化软件架构，将物理硬件、操作程序和个性化工艺的紧密的结合，为控制系统提供安全性，稳定性保障。符合cGMP法规要求： 根据用户需求，提供从设计、测试、验证、文件等一系列技术服务；系统设计与验证遵循ISPE GAMP5。快速稳定的自动化参数控制：控制系统配置不同的控制策略，实现快速，稳定，灵活的工艺过程参数自动化控制完善的批次过程监控与管理：系统配置趋势图，批次报告，用户管理，审计追踪功能满足复杂工艺应用需求：NestoBR提供长时间运行的无菌保障，完善的设备表征数据，可集成PAT，外置设备与灌流装置，可新增控制回路实现自动化灌流工艺操作。全面的安全性保障：提供生物反应器在使用，批次，软件，数据，工艺等方面全方位的安全保障。

当前，我国生物医药生物反应器设备虽然已经实现了较大程度的国产替代，但是高端产品，尤其是超大规模生物反应器（1万升以上）仍然严重依赖进口，不仅成本高，而且在关键技术和维修保养方面也极易被卡脖子。我国在这一领域长期处于空白状态，仅通过罐体加工国产化、软件自控用进口的方式实现部分国产替代。近年来，随着国家对生物经济的重视和扶持，&zwnj 我国在上游生物工艺装备的技术创新和市场投入程度持续加大，国内已有公司成功研制出全自主知识产权的国产制造，并成功进行了抗体表达工艺的验证测试。此次超大规模1.5万升生物反应器的设计、制造和下线，填补了我国在该领域的空白。双方合影（从左至右：仪器信息网生命科学编辑李兆坤、沃美生物总经理滕小锘博士、仪器信息网客户成功经理康龙、仪器信息网生命科学编辑樊雪竹）为了一睹这套设备的真容，仪器信息网一行走进了这家在生物制造上游产品和服务有着良好口碑的公司——苏州沃美生物有限公司（以下简称“沃美生物”），并在沃美生物总经理滕小锘博士的带领下进入了超大反应器研究和测试车间。那么这套设备到底有什么特别之处？我国在高端生物反应器领域还有哪些难点亟待攻克？……跟着我们的脚步一起去了解吧！专注高端产品，成功自研国内1.5万升动物细胞生物反应器高端装备制造业作为国家战略性新兴产业，是提升制造业核心竞争力、实现新型工业化、建设制造强国的重要支撑。那么，什么是高端装备呢？高端装备又称先进装备，是指具备高技术含量、高附加值的先进工业设施设备，是以高技术为引领，处于价值链高端和产业核心环节，决定整个产业链综合竞争力的核心装备。以高端生物反应器为例，其“高端化”体现在设计、制造、运行和维护等各个细节之中，该系统集成了诸如数字化设计、CFD仿真模拟、PAT技术、QbD设计理念和智能化控制等关键核心技术，每一项都需以高度专业化的人才和精密仪器作为支撑。“换句话说，谁掌握了最先进的生产力，谁就能在竞争中占据优势。比如，在细胞株、菌株无较大差异的情况下，不同的装备最大可造成20%-50%的产量差异。”滕博士解释道，“我们专注于高端的产品，如今，已经有很多企业开始使用这些高端产品，其中多为行业龙头和先进制造企业。”在滕博士介绍完高端装备的概念后，我们也走进了沃美生物工业反应器研究和测试车间。在看到了经历三次技术和软件迭代的生物反应器系列产品后，这台完全自主研发的1.5万升动物细胞生物反应器（DOE-BS15000L）便映入眼帘。这套1.5万升动物细胞生物反应器总共有三层，所有核心元器件均为进口。在问及为何不选用国产配件时，滕博士表示：“该设备主要用于人用抗体药物的生产，国内用户在配件选型阶段优先考虑具有成熟法规认证和良好使用记录的国外供应商。对于高端反应器的配件来说，国产配件在合规性、稳定性和关键性能方面尚不及进口配件，这也导致了我们在进行国产替代的时候，只能先努力做到整机的国产替代，而对于配件的国产替代来说，仍需要后续和众多国产配件商的共同努力。”DOE系列15000L不锈钢细胞生物反应器系统（DOE-BS15000L）工业反应器研究和测试车间布局也充分考虑实际GMP生产时的要求，进行了合理化设计，管廊与主体设备分区布置，充分考虑操作和维护保养便捷性。设置有操作和检修专用通道，可以方便的对每个配件和每一层管道进行检修。所有这些设备都是全自动控制，且具备全生命周期管理功能。同时，整个反应器配备了也配置了联合华东理工大学国家生物反应器重点实验室研发的拉曼在线检测整体解决方案，可实现包括氨、糖、氨基酸、抗体质量属性等二十几种物质的实时在线检测。滕博士说，这套用反应器的设计、自控水平和PAT解决方案代表当前国内生物反应器的最高水平。DOE-BS15000L的背面管道分布图在另一间测试实验室内，35L多联平行细胞生物反应器(图A和图B)和第四代500 ml高通量平行智能生物反应器（图C）在实验台上一字排开，“我身边的这款仪器，就是我们最新研制的多联高通量平行智能生物反应器（WT-IM500），它主要用于高通量工艺开发，，通过自主开发的XBIO上位机软件，可以实现一台控制器同时操控4-64台平行生物反应器的运行。”滕博士为我们介绍道。同时，他认为多联高通量平行智能生物反应器的关键技术主要有以下几点：罐体的合理性设计、制造加工精度和平行性、智能传感器、稳定的自控系统和功能强大的数据采集和工艺分析软件。“总体来说，多联平行生物反应器的技术方面国内外已无明显差异，并且从最终使用效果来看差别也不大。而在售后服务方面，进口品牌做的远不如国内品牌，这也是促使用户从进口品牌转向国产品牌的主要原因之一。”图A：DOE-B35 多联平行细胞生物反应器；图B：多联平行生物反应器产品线图C：WT-IM500 500ml高通量平行智能生物反应器依托华东理工大学技术背景稳扎稳打15载沃美生物最早成立于2010年，成立初始便与华东理工大学国家生化工程技术研究中心（上海）（以下简称“工程中心”）建立合作。经过十多年的发展，公司现在形成了围绕生物医药（动保和人用）、合成生物学上游关键技术服务和相关产品的业务范围，其中细胞培养基和生物反应器是公司的两大主要产品线。在企业发展历程墙边，滕博士与我们回顾了沃美生物的发展史。公司成立初期，沃美生物在上海以技术服务和细胞培养基起家。得益于扎实的技术基础，沃美生物培养基的业务发展很快，2012年便在苏州建立了生产基地。2016年，沃美生物成立了生物反应器事业部，主要开发各种高端生物反应器，2021年，为进一步提高公司的装备制造能力，沃美生物联合珐成制药系统工程（上海）有限公司（以下简称“珐成浩鑫”）共同成立了一家专注于高端生物反应器研发、生产和销售于一体的合资公司——沃钛思（南通）生物科技有限公司（以下简称“沃钛思”），并与华东理工大学生物反应器国家重点实验联合成立了华东理工大学&沃钛思智能制造和过程控制联合技术创新转移中心（创新中心），“通过该中心，可以将最前沿的生物反应器一系列先进关键技术及前沿成果实现快速产业化转移。本次15000升的研发过程也得到了创新中心的强力支持。”滕博士自豪地说。滕小锘介绍沃美生物发展历程2024年如此复杂的环境，沃美生物生物反应器板块仍实现了稳健的发展。仅7月份新签1600万订单，其中海外订单超过一半。“得益于国家对于海外市场的支持，加之一带一路国家的市场需求旺盛，加快了我们产品走出国门的步伐。”滕博士说。公司15年来一直深植技术研发和创新、稳扎稳打。如今，沃美生物的研发总面积将近一万平米，以上海研发中心为主，并在苏州姑苏区和武汉设有研发中心，制造则在张家港工厂。此外，珐成浩鑫的海宁与广州工厂则承担反应器的主要生产制造业务，滕博士说：“当前，我们的制造能力、技术水平和服务能力与国内其他同类型企业相比处于前列。”高端生物反应器领域国内外仍有差距据滕博士介绍，在高端生物反应器领域，国内外的技术差距虽然小，但仍存在。这些技术差距主要体现在以下几个方面：第一，微型高通量智能生物反应器。该类型仪器对于合成生物学的研究以及药物、培养基的开发至关重要，目前国内还没有企业可以在这个方面真正实现高通量和智能化，尤其是在工艺层面的高通量和智能化。第二，超大规模生物反应器。虽然我国目前可以做到生物反应器的大型化，但在高端生物反应器的超大规模生产和应用方面还缺少成功案例。当前，我国对于万升的细胞生物反应器基本依赖于进口厂商，或者进口技术国内制造。第三，核心元器件和传感器。在自控的仪器仪表、阀门、核心的过程监测传感器等配件方面，尚不能实现完全国产化。部分领域已出现国产化替代产品，但在高端生物医药领域的推广应用还比较匮乏。第四，基于工艺出发的理性设计与放大技术。如今，大多数反应器的设计均是在效仿国外，“照葫芦画瓢”，但真正的设计要结合自己的菌株、产品、工艺等特点。在放大过程中，以往靠的是经验，但真正的放大需要依赖于对工艺特性和设备特性的充分理解，流场分析技术起到至关重要的作用，可以从方法学上解决问题。合成生物学发展方向：工艺工程装备一体化如今，合成生物学已经成为了沃美生物业绩快速增长的新型业务板块，其主要发展方向是“工艺-工程-装备一体化”。未来五年，沃美生物仍将继续深耕生物技术产业链上游环节，不仅提供工艺开发过程的全流程装备，还将为用户提供工程设计以及合成生物CDMO服务。“虽然今年的合成生物学市场变得更加‘理性’，但整体来说仍然十分乐观。我认为，合成生物学的繁荣不止50年，由于合成生物学技术发展很快，合成生物企业需要将产品快速落地并产生效益才能有未来，否则很容易被市场淘汰。在企业快速发展的过程中，不仅需要政府的大力支持，同时也离不开我们这种合成生物学的上游企业，希望我们能做好上游繁荣，并通过上游繁荣来支撑下游的发展。”据悉，除了与华东理工大学建立的华东理工大学&沃钛思智能制造和过程控制联合技术创新转移中心以外，沃美生物也与华东理工大学合作建立了合成生物联合技术创新转移中心，主要侧重于合成生物关键技术研究及科研成果的快速产业化。谈及未来的发展策略，滕博士表示，一方面持续加大自身的研发投入，增强自我造血功能，另一方面将继续深化与华东理工大学、华中科技大学、四川农业大学、苏州工学院等高等学府的合作，通过校企合作的方式加速科研成果产业化，最终实现双赢乃至多赢的局面。此外，沃美生物还在积极参与国家和地方在生物医药、合成生物、生物制造等领域的布局，将自身的发展融入到国家战略发展中。沃美生物总经理滕小锘博士

p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 简介 /span /strong /p p 　　用于重组蛋白和单克隆抗体(mAb)生产的细胞培养工艺有不同的方式。补料分批(Feb-Batch)工艺由于操作简单，且较易规模放大，被临床和商业化生产广泛采用，目前的技术发展已可在18天内获得20-30x10^6cells/mL的细胞密度，同时获得& gt 10g/L的滴度水平。 /p p 　　灌流工艺以往更多用于生产不稳定的产品，如血液凝集因子和酶类产品，但也有用于生产 mAb产品，如Remicade(英利昔单抗)。在灌流培养中，通过培养基置换，降低产物在反应器内的滞留时间，而灌流速率取决于特异性的产物和/或工艺需求。 /p p 　　近几年，在上游工艺中，基于灌流的工艺强化获得了极大的发展，驱动力主要来自于对降低成本和占地的需求，以及提高设备灵活性。随着细胞系、培养基和细胞截留设备的发展，现在的灌流工艺已可获得较高的细胞密度和产量，使其成为一个非常有吸引力的选择，包括mAb的生产。例如，在mAb生产中，结合2vvd的培养基置换速率，通常可达到50-60x10^6cells/mL的稳态细胞密度，以及高达4g/L/day的生物反应器产率。此外，浓缩补料分批(CFB)也可以通过培养基置换，维持高细胞密度，而将产物截留在生物反应器内。 /p p 　　灌流和CFB的差异在于所用的中空纤维膜的孔径。对于抗体，使用Per.C6细胞系，可在12-13天内，达到21.4g/L的终产物滴度(峰细胞密度& gt 150x10^6cells/mL)，而使用CHO细胞系时，可在16天内达到25.3g/L的滴度，峰细胞密度& gt 180x10^6cells/mL。随着生物反应器产率的提高，可使用占地更小、成本更低的一次性设备，来替代大规模的不锈钢设备(10,000-25,000L)，通过增加设备轮转或连续工艺，生产等量的产物。 /p p 　　尽管灌流工艺可使用基于过滤的细胞截留设备，如TFF和ATF，在生物反应器内获得并维持高细胞密度，但通常会要求使用较高的培养基置换速率，以将高密度细胞的活性维持在可接受的水平。与不同工艺相关的培养基成本是评估其生产等量产物时经济性的关键因素。而即使单位培养基成本适当，较高的培养基置换速率也会显著影响生产产品成本(CoG)，亦即，上游操作成本与培养基成本紧密相关。 /p p 　　生产单位产品的总生产CoG和上/下游成本的比重会随产物滴度和设备尺寸的变化而变化。在分析CoG的所有输入值中，一旦工艺确定，培养基用量及其成本是固定的，不管设备、设施等是否发生改变。细胞培养工程师的一个主要目标是降低培养基成本，同时获得高产量。本文使用相同的基础(basal)和补料(feed)培养基，稍作优化，开发了具有高生物反应器产率的不同细胞培养工艺(补料分批、灌流和CFB)，并比较了不同操作模式的生物反应器产率及其相关的培养基成本。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验 /span /strong /p p 　　实验使用生产单克隆抗体的重组CHO细胞系，不同工艺使用相同的3L生物反应器，培养基使用专利的基础(basal)和补液(feed)培养基，后者又分为两种补液-A和补液-B，均富含葡萄糖、氨基酸、维他命等。详细细胞系和种子扩增、生物反应器操作信息请参看原文。 /p p 　　对于补料分批培养，反应器起始工作体积1.5L，接种密度为0.5或2x10^6cells/mL，后者通过3天的N-1灌流来达到目标密度。生物反应器补液以每日葡萄糖水平为基础进行。 /p p 　　对于CFB工艺，使用50kD PS中空纤维过滤器的灌流设备，对于灌流，使用0.2μm PES中空纤维过滤器的灌流设备。接种密度1x10^6cells/mL，工作体积1.3L，一般第2天开始培养基置换，最大置换速率1vvd。灌流培养在第8天开始进行细胞废弃(cell bleeding)，以维持所需细胞密度和活性。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b370cbae-a09d-4aad-901e-9998bacb5c16.jpg" title=" 1_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 不同细胞培养模式图解(xu et al, 2017) /span /strong /p p 　　细胞培养每日取样分析，详细分析内容和方法，请参考原文。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 讨论 /span /strong /p p 　　不同操作模式的细胞培养性能 /p p 　　实验测试操作模式包括：补料分批、灌流和CFB，使用相同的3L生物反应器规格以及基础和补料培养基组合，以便比较细胞/生物反应器产率和培养基成本。 /p p 　　补料分批模式 对于补料分批模式，接种密度为0.5或2x10^6cells/mL，后者通过N-1灌流，可使对数生长期降低2天，所以8天就可达到峰密度，而前者需要10天。两种条件达到的峰细胞密度范围均为20.2-26.2x10^6cells/mL。两种接种密度在第14天分别达到5.4± 0.1g/L和6.8± 0.2g/L的滴度。生物反应器单位体积产率(VPR)按最终生物反应器滴度除以培养周期计算。2x10^6cells/mL接种密度条件，相比0.5x10^6cells/mL，可获得更高的VPR(0.49± 0.01g/L/day vs. 0.39± 0.01g/L/day)，主要是由于前者降低了起始生长阶段的时间，延长了生产期。 /p p 　　灌流模式 在灌流培养中，使用了2种不同的培养基组成：1种只使用基础培养基，另一种为基础加补液-A。在培养过程中，通过合适的cell bleeding，维持较高的活性& gt 85%。只使用基础培养基时，平均细胞密度为44± 4.1x10^6cells/mL，从第8天至32天的日产量为0.7± 0.04g/L/day。在基础+补液条件中，随细胞密度的增加，补液-A作为培养基置换的一部分，逐渐引入，而总培养基置换率保持为1vvd，平均细胞密度增加至73.9± 5.4x10^6cells/mL，日产量增加至2.29± 0.28g/L/day。细胞特异性产率从16.0± 1.2pg/cell/day增加至30.1± 2.3pg/cell/day，从而使反应器产量增加~230%。 /p p 　　浓缩补料分批模式(CFB) 与灌流相似，评估了只使用基础培养基和使用基础+补液培养基的条件。与灌流工艺相比，CFB不需要进行cellbleeding，细胞质累积至更高的水平。当只使用基础培养基时，在第18天达到峰细胞密度72.0± 9.6x10^6cells/mL，上清液滴度为12.2± 0.6g/L。使用基础+6%补液-A+2%补液-B时，峰细胞密度为117.4x10^6cells/mL，第18天上清液滴度为21.4g/L，使用基础+8% 补液-A +8% Feed-B时，峰细胞密度为83.4x10^6cells/mL，第18天上清液滴度为36.7g/L。可见，增加补液-A和补液-B的量，可显著提高细胞特异性产率至45.1pg/cell/day。 /p p 　　细胞特异性产率、生物反应器产率和产物质量 /p p 　　当只使用基础培养基时，批次、灌流和CFB工艺可达到相似的qP，范围为14.7-17.1pg/cell/day。在此条件下，累积的细胞数量会直接影响产物滴度和单位体积产率。正如预期，批次培养的VPR显著较低，仅为0.08g/L/day，而灌流和CFB工艺由于可维持更高的细胞密度，可获得相当的VPR，0.68-0.70g/L/day。 /p p 　　浓缩补液培养基通常用于补料分批工艺，以提高细胞生长和细胞特异性产率。在此研究中，补加补液培养基，可显著提高qP和VPR。对于补料分批培养，qP提高至29.4-32.0pg/cell/day，VPR达到0.39g/L/day(接种密度0.5x10^6cells/mL)或0.49g/L/day(接种密度2x10^6cells/mL)。N-1灌流获得的更高的接种密度可提高VPR，因为缩短了生长期的时间，延长了生产期，提高产量。但是，即使与只使用基础培养基的灌流和CFB相比，补料分批培养的VPR仍较低，因为细胞密度差别显著。 /p p 　　相比补料分批工艺，只使用基础培养基以1vvd的速率进行培养基置换时，可轻松地将细胞密度提高2-3倍。而与只使用基础培养基的条件相比，在灌流培养中补充10%补液-A可使VPR提高~230%，qP提高~90%。相似的，在CFB工艺中，补充不同比例的补液-A和补液-B可将VPR提高至1.19-2.04g/L/day。 /p p 　　最近有报道显示，长寿命的人浆细胞可在体外维持120pg/cell/day的IgG分泌率，对于基因工程哺乳动物细胞，最高生产速率估计为~100pg/cell/day。qP的提高将来自于细胞系和培养基的优化。所以，理论上，在灌流工艺中，如稳态细胞密度维持为100x10^6cells/mL时，每日产量可高达10g/L/day。 /p p 　　实验同时评估了不同操作模式的产物质量特征，结果显示，CFB会形成更高水平的HMW和稍高的酸性异构体，主要是由于产物所暴露的细胞培养环境。在补料分批和浓缩补料分批中，产物滞留时间为整个培养周期。此外，在仅使用基础培养基的CFB工艺中，HMW最高，说明培养基组成可能在HMW形成中扮演了重要的角色。但是，产生的HMW仍低于5%，且大部分可在纯化步骤中去除。另一方面，即使是相同的高细胞密度环境和相似的培养基组成，灌流培养的酸性异构体和HMW更低，可能是由于产物在罐内更低的滞留时间。 /p p 　　培养基成本分析 /p p 　　由于细胞系或培养基组成的变化会显著影响产物滴度/产率，所以对不同操作模式的比较需使用相同的细胞系和培养基条件才有意义。本文使用从小规模生物反应器获得的细胞培养性能，来比较不同操作模式的培养基成本，并假定在规模放大时，不同工艺没有显著的产率下降。需要指出的是，实验中的灌流速率没有在对数生长期，以细胞特异性为基础，进行良好的优化。相反，在整个培养周期中，将灌流速率固定为1vvd。在不同的培养阶段，对细胞特异性灌流速率进行精细调节，应可进一步降低培养基用量和成本。 /p p 　　当只使用基础培养基时，生产每克抗体的培养基成本在批量和灌流工艺中都很高。加入适量的补料培养基，可降低每克mAb的培养基成本，且即使补料培养基相对较贵，细胞密度和qP的增加相比培养基成本的增加更加显著。 /p p 　　使用N-1灌流的补料分批的培养基成本比常规补料分批工艺低，N-1灌流需要3x基础培养基置换，但因接种密度的提高，继而获得的滴度的增加，抵消了培养基用量的增加。N-1灌流的补料分批和灌流的培养基成本相当，~$10/g mAb。这说明，虽然往常认为由于较高的灌流速率，灌流的培养基用量更高，继而培养基成本更高，但只需要生物反应器产率达到一定的阈值，从培养基成本上来看，还是相当有竞争力的。 /p p 　　CFB工艺的培养基成本与其它操作模式的趋势不同。在只使用基础培养基的条件中，成本与批量和灌流工艺相当，但CFB培养基成本会随补料培养基的使用而增加，其相对较高的培养基成本(& gt $17/g)可能是因为需要较长的细胞生长时间，在培养中，直到第10天，细胞密度达到峰水平，才开始出现显著的产物滴度增加。降低CFB培养基成本的一种方法是优化细胞寿命，延长批次时间，但更长的罐内滞留时间，可能会影响产物质量属性，或是进一步优化培养基，如替换昂贵的成分和优化其滴度。 /p p 　　总生产COG /p p 　　除了培养基成本的不同，使用诸如灌流和CFB之类的工艺，结合一次性设备，在小规模上进行生物制品生产，可显著降低成本投入，从而获得更加灵活的生产策略，当产品需求增加时，可以快速地进行规模扩展(scale out)，而不是规模放大(ScaleuP)。与传统不锈钢设备相关的固定成本，可以转变为“可变”的成本结构。基于此处的案例，灌流工艺的培养基成本实际上低于补料分批工艺。 /p p 　　进行总成本分析时，如下游均以批量模式进行，且认为不同工艺的劳动力成本相当，则本文建模分析结果显示，N-1灌流的补料分批和灌流工艺的下游CoG/g相当，分别为$63/g和$59/g，而标准补料分批和CFB工艺的下游CoG/g稍高，分别为$71/g和$81/g。对于mAb和不稳定的产品，基于灌流的连续工艺都可以提供显著的经济优势。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 总结 /span /strong /p p 　　在本研究中，比较了不同操作模式下，生物反应器的产率，包括补料分批、灌流和CFB工艺。对于研究的细胞系，qP高度取决于所用的培养基，不管采用哪种操作模式，这使得累积细胞密度成为决定产物滴度和生物反应器产率的主要因素。结果显示，补料分批培养生物反应器产率最低(0.39-0.49g/L/day)，而基于灌流的培养方式，由于可维持更高的细胞密度，产率相对较高，灌流为2.29g/L/day，CFB为1.19-2.04g/L/day。灌流的一个显著优势是可以达到并维持极高的细胞密度，用于产物形成。 /p p 　　灌流工艺一个经常观察到的缺点是培养基用量较高，因为需要进行连续的培养基置换，以维持所需的高活细胞密度。这里的研究显示，高产率灌流培养的培养基成本实际上低于补料分批工艺。CFB工艺的培养基成本最高，虽然在18天内达到了36.7g/L的极高滴度，为降低CFB工艺的培养基成本，建议可以精调培养基置换率，以在起始的生长阶段获得更好的培养基利用，或通过培养基优化，提高细胞特异性产率。 /p p 　　 i 小编出于交流目的编译此文，由于水平有限，不当之处，敬请谅解，详细内容，请参看原文。 /i /p p i 　　原文：S.Xu, J.Gavin, R. Jiang, et al., Bioreactor Productivity and Media Cost Comparison for Different Intensified Cell Culture Processes. Biotechnol. Prog., 2017, Vol. 00, No.00. /i /p p br/ /p