蛋白谱原理分析

核酸蛋白检测仪是层析分析的主要装置，核酸蛋白检测仪配上层析柱、恒流泵、部分收集器、层析谱分析系统（根据需要选配）和电脑打印设备即构成一套完整的核酸蛋白检测仪分离层析系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。核酸蛋白检测仪分析系统广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质（样品）对紫外光有明显吸收的特征，实现对样品成份含量比对分析，以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。在生化分析、环保科学、食品研究、毒理研究、新药开发等领域中对核酸、蛋白检测、纯化和提取提供了一种独特的分析手段。

褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤很简单的，比较适合初学者。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=113913]AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤[/url]

[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析（又叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析，凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合，因此，缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率，只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理：不同蛋白等电点差异，分子大小差异，在同一个流动相中电荷密度分布不同，电荷量不等，与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同，在流动相洗脱时保留时间不同，从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高，重复性，选择性好，分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理：疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相，色谱条件温和，生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样，低盐洗脱（高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高，蛋白质天然折叠伸展，暴露出更多内部疏水集团，使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好，盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

牛奶蛋白质分析仪的原理主要基于光学测量技术，特别是光谱分析法。具体地说，它采用红外光谱法来测量牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的含量。首先，将牛奶样品制成透明薄片，然后使用近红外光电传感器和光源对其进行扫描。牛奶中的蛋白质对特定波长的红外光有特定的吸收特性，通过测量这些吸收特性，可以分析出牛奶中蛋白质的种类和含量。此外，仪器会将牛奶光谱与事先建立的标准光谱进行比较，通过复杂的算法处理，从而得出各种蛋白质形态的含量。这种比较和计算过程确保了测量结果的准确性和可靠性。总的来说，牛奶蛋白质分析仪通过光学测量和光谱分析技术，能够快速、准确地测定牛奶中蛋白质的含量和种类，为乳制品生产、质量控制和科学研究提供了有力的支持。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/04/202404291701212298_2595_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

求购 质谱分析的蛋白标准品，MALDI-TOF-MS上用的。 分子量在400--30000da 的或者接近这个质量范围的，如有请联系我。直接给我这个留言就可以，谢谢！

蛋白分析系统在我们选择蛋白分析工具的时候，通常是根据不同的蛋白来选择不同的分析手段，如凝胶电泳、化学荧光染色、质谱等等。但是目前已经研制出的蛋白分析工具的种类繁多，从这一方面也在一定程度上反映了蛋白分析的复杂性。以下是一些近期推出的蛋白分析系统，希望能帮助您轻松完成研究工作。

[font=宋体]蛋白纯化介质主要应用于研究目的蛋白的结构、功用以及相互作用的和过程中。比如：在蛋白纯化过程中，由于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析法[/b][/url]的选择性和结合力较强，分辨率也高。所以，亲和层析法是一种常用的蛋白、抗体纯化方法，天地人和生物多种简单易用的亲和纯化介质，适用于批量或利用重力进行纯化，可以高效、便捷、可靠地从品中分离蛋白和抗体，为下游应用提供有力保证。[/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]亲和层析的操作步骤[/font][font=Calibri]:[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和层析中，蛋白在影响蛋白[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或标签[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]与其配体之间结合的条件下被加载到柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白与固定相之间任何非特异性相互作用的条件下洗涤结合的蛋白。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合，取代目标蛋白，这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]亲和层析配体和洗脱条件[/color][/font][/b][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][/tr][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]需纯化的蛋白[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]配体[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]洗脱条件[/color][/font][/b][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体（抗原特异性）[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗原肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]多聚组氨酸标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Ni2+或Co2+[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]咪唑或游离组氨酸[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG肽或低pH值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]GST标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]还原型谷胱甘肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离谷胱甘肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]低[/font][font=微软雅黑]pH[/font][/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体（类特异性）[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]蛋白[/font][font=微软雅黑]A、G和L或精蛋白[/font][/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]pH极端值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]DNA结合蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]肝素[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]高离子强度[/color][/font][/td][/tr][/table][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体]蛋白过镍柱纯化的原理是利用[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]柱中的氯化镍与有[/font][font=Calibri]HIs[/font][font=宋体]（组蛋白）标签的蛋白特异性结合的能力，同时也能与咪唑结合。具体步骤如下：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①[/font][font=宋体][font=宋体]过柱子前可以选择[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]柱重生，往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行，然后平衡柱子，用你自己的[/font][font=Calibri]buffer[/font][font=宋体]，给蛋白提供最适的环境。[/font][/font][font=宋体]②[/font][font=宋体][font=宋体]平衡[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]个柱长后，蛋白上样，可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些。如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差。也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。[/font][/font][font=宋体]③[/font][font=宋体][font=宋体]挂完之后，按理想来讲，蛋白在[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]柱中与[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]就结合了，杂蛋白多数在烧杯里留下来了。肯定有少量杂蛋白也挂上了。这时候要梯度洗脱，拿咪唑和你的[/font][font=Calibri]buffer[/font][font=宋体]配，一般从[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]20mM[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]40mM......100mM[/font][font=宋体]这样洗脱。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来。[/font][/font][font=宋体]④[/font][font=宋体][font=宋体]洗完之后，可以用[/font][font=Calibri]200mM[/font][font=宋体]咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次。是否选择重生你自己定咯[/font][font=Calibri]~[/font][font=宋体]然后放上[/font][font=Calibri]20%[/font][font=宋体]乙醇保存柱子就可以咯[/font][font=Calibri]~ [/font][font=宋体]过的蛋白用不同的管子收下，然后[/font][font=Calibri]SDS-page[/font][font=宋体]检测在哪个管子里。[/font][/font][font=宋体]以上步骤仅供参考，不同的实验条件可能方法会不同。具体可以查阅专业书籍或者咨询专业人士。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供不同表达系统的[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白纯化服务[/b][/url]，有细菌系统蛋白纯化、[url=https://cn.sinobiological.com/services/transient-protein-expression-service][b]哺乳动物瞬时系统蛋白纯化[/b][/url]、杆状病毒系统蛋白纯化等，具体重组蛋白纯化原理及操作步骤可以查看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service[/font][/font][font=宋体][font=宋体]原核（[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]）蛋白表达服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service[/font][/font]

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol][b]蛋白纯化[/b][/url]是生物实验室和制药工业中至关重要的技术。它涉及从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，同时保持蛋白质的结构和功能。了解蛋白纯化的原理和步骤不仅有助于提高实验效率，还可以降低实验失败的风险。在本篇文章中，我们将详细介绍蛋白纯化的定义、原理和步骤。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白纯化定义及原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化是生物研究常用的一种技术，是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。如果纯度的要求很高，再增加一个离子交换或疏水作用色谱的额外中间步骤。不过尽量尝试使用尽可能少的步骤，因为步骤增多会降低总蛋白产出量。亲和步骤常用重力柱，有时其他色谱步骤中会使用恒压泵，然而蛋白纯化系统将提供更多的控制，可获得更详细的目标蛋白和杂质信息，并为色谱柱提供更好的保护。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]可溶性蛋白纯化的步骤[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]用于分离可溶性重组或非重组蛋白的分离方法取决于蛋白的内在生理化学特性（被标记蛋白除外）。典型的纯化方案如下所示（使用离子交换色谱法）。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、细胞裂解液[/font][/font][font=宋体]澄清裂解液[/font][font=宋体][font=宋体]离心（[/font][font=Calibri]60000[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]90 [/font][font=宋体]分钟）过滤或脱盐和交换缓冲液[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、澄清裂解液[/font][/font][font=宋体]①用亲和法[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）进行[/font][font=Calibri]DEAE-Sepharose[/font][font=宋体]离子交换[/font][/font][font=宋体]交换缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）进行离子交换[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 弱阳离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]羧甲基[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 强阳离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]甲基磺酸盐[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 强阴离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]季铵盐[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 弱阴离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]二乙氨基乙基[/font][/font][font=宋体]? 磷酸纤维素[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）用其他色谱方法[/font][/font][font=宋体]? 染料基质[/font][font=宋体]? 疏水[/font][font=宋体]? 羟磷灰石[/font][font=宋体]? 层析聚焦[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②浓缩[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③进行凝胶过滤[/font][font=宋体]④无菌过滤[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、经纯化的蛋白[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]包涵体蛋白的折叠与纯化[/b][/font][font=宋体]在大肠杆菌中表达的重组蛋白位于细胞裂解后低速颗粒部分，它们高度聚集。包涵体通常来自于细胞质（或细胞周质，如使用了分泌载体）中的蛋白聚集。如前所述，由于与细菌核酸的相互作用，蛋白也可以位于低速或高速颗粒部分中。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]采用蛋白变性剂提取蛋白，如盐酸胍[/font][font=Calibri](Gu[/font][font=宋体][/font][font=Calibri]HCl)[/font][font=宋体]、尿素或有机酸。使用还原剂二硫苏糖醇[/font][font=Calibri](DTT)[/font][font=宋体]防止人工二硫键形成（尤其是分子间键）。变性后的蛋白可以通过各种方法纯化后再折叠，也可以直接折叠。通常建议在折叠前进行一些纯化（如[/font][font=Calibri]Gu[/font][font=宋体][/font][font=Calibri]HCl[/font][font=宋体]中的凝胶过滤），因为这往往会带来更高的折叠产率。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原文转载：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol[/font][/font]

最近做了几个毛角蛋白红外定性分析可是出的红外图谱看不是很懂~

[font=宋体][b]蛋白纯化的原理：[/b][/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]蛋白纯化实际操作：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]理想情况下，最终的纯化过程包括样品制备，其中包括在需要时进行萃取和澄清，然后进行上述三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]分析纯化通常利用三个特性来分离蛋白。首先，蛋白可以通过[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]梯度凝胶或离子交换柱，根据其等电点进行纯化。其次，根据蛋白大小或分子量，可以通过体积排除色谱法分离或通过[/font][font=Calibri]SDS-PAGE([/font][font=宋体]十二烷基硫酸钠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]聚丙烯酰胺凝胶电泳[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]分析。通常采用[/font][font=Calibri]2D-PAGE[/font][font=宋体]对蛋白进行纯化，然后进行肽质量指纹图谱分析，以确定蛋白的特性。这对于实现科学目的非常有用，目前蛋白的检测限非常低，纳克级的蛋白足以用于分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]如何应用纯化原则：[/b][/font][font=宋体]①纯化技术的选择和组合：[/font][font=宋体]这种组合的目的是发展出一条最快的方法来获得所需纯度的产品。对于任何色谱分离来说，不同的技术在回收率、分辨率、速度和容量方面的表现都各不相同。我们可以对一种技术进行优化，使其专注于其中一个参数；例如分辨率要在速度和容量两个参数之间达到最佳。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分辨率是通过技术的选择和色谱基质产生窄峰的效率来实现的。一般来说，此时目标蛋白和杂质具有非常相似的性质，分辨率是最难实现的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②标签蛋白的纯化[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在蛋白中添加标签可以使蛋白具有它本来不具有的结合亲和力。通常重组蛋白是混合物中唯一具有这种亲和力的蛋白，有助于蛋白分离。最常见的标签是对镍或钴离子有亲和力的组氨酸标签（[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签）。因此，我们通过将镍离子或钴离子固定在树脂上，可以创建与组氨酸标签蛋白特异性结合的亲和介质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③评估纯化产量：[/font][font=宋体][font=宋体]通常使用[/font][font=Calibri]SDS PAGE[/font][font=宋体]监测纯化过程中的不同步骤。这一方法只能粗略地测量混合物中不同蛋白的量，并且无法区分具有相似分子量的蛋白。为了评估多步纯化的过程，必须将特定蛋白的量与总蛋白的量进行比较。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白表达纯化实验中注意事项有哪些？[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]融合表达时在选择外源[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]菌液[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值要小于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]，否则细胞太浓太老，不易破碎，且质粒易丢失。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]诱导时间最好做一个梯度，不同蛋白诱导时间需摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]诱导温度适当摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. IPTG[/font][font=宋体]浓度：一般在[/font][font=Calibri]1 mM [/font][font=宋体]以内，可适当摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]7. [/font][font=宋体]超声条件可视实际情况改变，只要使菌体裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。[/font][font=宋体][b]义翘神州提供[/b][url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]原核蛋白纯化服务[/b][/url][b]，服务内容包括：[/b][/font][font=宋体]①基因合成及密码子优化[/font][font=宋体]②载体构建[/font][font=宋体]③表达鉴定和可溶性分析[/font][font=宋体][font=宋体]④放大表达和[/font][font=Calibri]1-2[/font][font=宋体]步纯化[/font][/font][font=宋体]⑤大量表达及纯化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service[/font][/font]

最近在做几个酸性蛋白的CIEF。贝克曼的方法比较适用于中性和偏碱性的蛋白分析，对于酸性蛋白分析效果不太理想。氨水迁移法比较适合酸性蛋白，但是据说很伤柱子，做不了几个样品。讨论一下，有没有人遇到同样的问题，是怎么优化方法的呢?我尝试调整占位剂的配比，暂时也没有得到理想的结果。

[font=宋体]重组蛋白的表达（尤其是使用细菌载体和宿主）是一项成熟的技术。难点在于如何将其以活化形式分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]蛋白标签[/b][/url]是一种可以提高重组蛋白的溶解度、简化蛋白纯化的简单有效的工具，并通过简单的方法跟踪蛋白表达和纯化过程。此外，蛋白标签是追踪活细胞中蛋白和进程的一种有效工具，可以通过显微镜直接跟踪或者通过[/font][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]、免疫沉淀或免疫染色间接进行跟踪。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白纯化的原理：[/b][/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification]蛋白纯化[/url]操作步骤：[/b][/font][font=宋体]理想情况下，最终的纯化过程包括样品制备，其中包括在需要时进行萃取和澄清，然后进行上述捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供不同表达系统的蛋白纯化服务，有细菌系统蛋白纯化、哺乳动物瞬时系统蛋白纯化、杆状病毒系统蛋白纯化。详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font]

http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378379551.jpg 氨基酸是蛋白质的基础组成单位，通过研究蛋白质中氨基酸的性质和组成来预测蛋白质的结构和功能，蛋白质氨基酸残基组成分析主要是通过氨基酸分析仪来完成的，本文推荐了2个基于氨基酸组成进行蛋白质预测软件。基于氨基酸组成的蛋白质预测软件根据组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质可以辨析电泳等实验中的未知蛋白质，也可以分析已知蛋白质的物化性质。ExPASy工具包包涵的程序：AACompIdent：与把氨基酸序列在SWISS-PROT库中搜索不同，AACompIdent工具利用未知蛋白的氨基酸组成去确认具有相同组成的已知蛋白。该程序分析时需提交的相关信息包括：蛋白质的氨基酸组成、等电点pI和分子量(如果知道)、正确的物种分类及特别的关键词。此外，用户还需在六种氨基酸“组合”中作出选择，这影响到分析如何进行。例如，某种“组合”会把残基Asp/Asn(D/N)和Gln/Glu(Q/E)组合成 Asx(B)和Glx(Z);或者某种残基会在分析中被完全除去。对数据库中的每一个蛋白序列，算法会对其氨基酸组成与所查询的氨基酸组成的差异打分。由电子邮件返回的结果被组织成三级列表：第一张列表中的蛋白都基于特定的物种分类而不考虑pI和分子量;第二张列表包含了不考虑物种分类、pI和分子量的全体蛋白;第三张列表中的蛋白不但基于特定物种分类，并且将 pI和分子量也考虑在内。虽然计算所得结果各不相同，但零分表明了该序列与提出的组成完全相符。AACompSim：AACompIdent的一个变种，AACompSim提供类似的分析，但与前者以实验所得的氨基酸组成为依据进行搜索不同，后者使用SWISS-PROT中的序列为依据。有报道称，氨基酸组成在物种之间是十分保守的(Cordwell等，1995)，并且通过分析氨基酸的组成，研究者能从低于25%序列相似性的蛋白之间发现弱相似性(Hobohm和Sander，1995)。因此，在“传统的”数据库搜索基础上辅以组成分析，能为蛋白质之间关系提供更多见解。PROSEARCH：PROPSEARCH也提供基于氨基酸组成的蛋白质辨识功能。用144种不同的物化性质来分析蛋白质，包括分子量、巨大残基的含量、平均疏水性、平均电荷等，把查询序列的这些属性构成的“查询向量”与SWISS-PROT和PIR中预先计算好的各个已知蛋白质的属性向量进行比较。这个工具能有效的发现同一蛋白质家族的成员。可以通过Web使用这个工具，用户只需输入查询序列本身。分子量搜索(MOWSE)分子量搜索(MolecularWeightSearch，MOWSE)算法利用了通过质谱(MS)技术获得的信息。利用完整蛋白质的分子量及其被特定蛋白酶消化后产物的分子量，一种未知蛋白质能被准确无误地确认，给出由若干实验才能决定的结果。由于未知蛋白无需再全部或部分测序，这一方法显著地减少了实验时间。MOWSE的输入是一个纯文本文件，包含一张实验测定的肽段列表，分子量范围在0.7到4.0Kda之间。计算过程基于在OWL非冗余蛋白质序列库中包含的信息。打分基于在一定分子量范围内蛋白中一个片段分子量出现的次数。输出的结果是得分最佳的30个蛋白的列表，包括它们在OWL中的条目名称、相符肽段序列、和其它统计信息。模拟研究得出在使用5个或更少输入肽段分子量时，准确率为99%。该搜索服务可通过向mowse@daresburg.ac.uk发送电子邮件实现。为获得更多关于查询格式的细节信息，可以相该地址发送电子邮件，并在消息正文中写上“help”这个词。蛋白质氨基酸组成分析用盐酸在110 ℃将蛋白或多肽水解成游离的氨基酸，用氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量。采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通HPLC相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化(例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等)通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统(钠盐系统)和游离氨基酸分析系统(锂盐系统)，利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好;锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度(即最低检测限)比HPLC柱前衍生方法稍低以外(HPLC：0.5 pmol;氨基酸分析仪：10 pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。蛋白质氨基酸残基组成分析的主要步骤包括：首先是蛋白被水解为氨基酸，其次是采用离子色谱等方法进行游离的氨基酸含量和组成的分析。总之利用蛋白可以分析氨基酸，利用氨基酸也可以研究蛋白质。

在原核蛋白表达体系中，如E.coli（大肠埃希菌）系统，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，本文详细讲述了常用诱导剂IPTG 对外源蛋白诱导表达的原理以及实验步骤。

牛奶蛋白质分析仪可以用于检测乳蛋白制品。以下是详细解释和相关信息：　　功能与应用：牛奶蛋白质分析仪是一种专门用于分析牛奶及其制品中蛋白质含量的仪器。它基于先进的生化分析技术，如比色法、光谱法或电化学法等，能够准确、快速地检测样品中的蛋白质含量。　　乳蛋白制品的检测：乳蛋白制品，如奶粉、酸奶、奶酪等，其蛋白质含量是产品质量和营养价值的重要指标。牛奶蛋白质分析仪可以有效地检测这些乳蛋白制品中的蛋白质含量，为生产厂家提供准确的质量控制手段。　　优点与特点：　　准确性高：牛奶蛋白质分析仪具有高灵敏度和高准确性，能够确保测量结果的可靠性。　　快速便捷：该仪器操作简单，使用方便，可以快速得出测量结果，提高检测效率。　　适用范围广：除了牛奶及其制品外，还可以用于其他含蛋白质样品的检测，如豆类制品、肉制品等。　　在乳品工业中的重要性：随着乳品市场的不断扩大和消费者对乳制品质量要求的提高，牛奶蛋白质分析仪在乳品工业中的重要性日益凸显。它可以帮助乳品企业提高产品质量、降低生产成本，同时为消费者提供更加安全、健康的乳制品。　　综上所述，牛奶蛋白质分析仪是一种功能强大、应用广泛的检测仪器，完全可以用于检测乳蛋白制品中的蛋白质含量。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/05/202405271615421543_8284_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

[font=宋体][font=宋体]膜联蛋白（[/font][font=Calibri]Annexin[/font][font=宋体]）是一类分布广泛的钙依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Calibri]PS[/font][font=宋体]）能特异性结合，参与一系列[/font][font=Calibri]Ca2+[/font][font=宋体]依赖型的膜相关的过程，包括细胞的胞吐和内吞作用、囊泡运输、调节血液凝固以及炎症反应等多种生物学事件，在许多人类疾病的发病机制或进展中起着非常重要的作用。膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Annexin V[/font][font=宋体]）染色是检测细胞凋亡的常用方法。[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色原理及应用[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]一、膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色原理[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色，也称为[/font][font=Calibri]Annexin V[/font][font=宋体]染色，是一种用于检测细胞凋亡的方法。其核心原理基于细胞凋亡过程中的一种生物化学变化。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Calibri]PS[/font][font=宋体]）只分布在细胞膜脂质双层的内侧。然而，当细胞开始凋亡时，这一分布会发生改变，磷脂酰丝氨酸会从细胞膜内侧翻到外侧。膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]是一种能够与这种外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合的蛋白。通过结合荧光物质，这种结合可以被检测和观察，从而确定哪些细胞正在经历凋亡。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色的应用[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①流式细胞术：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色常用于流式细胞术中，以检测和分类正常细胞和凋亡细胞。通过流式细胞仪，可以快速分析大量细胞，并准确地识别出凋亡细胞。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②光学显微镜成像：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色也可用于光学显微镜成像技术，这使得研究者能够在显微镜下直接观察细胞的形态变化，从而对凋亡过程有更深入的理解。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③与其他染色方法的结合：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色可以与其他染色方法如碘化丙啶[/font][font=Calibri](PI)[/font][font=宋体]染色结合使用。[/font][font=Calibri]PI[/font][font=宋体]是一种能够进入凋亡晚期细胞核的染料，因此可以用于区分凋亡早期和晚期细胞。这种联合使用的方法能提供更全面的细胞凋亡信息。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④临床应用：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色在许多临床领域中都有应用，例如肿瘤学、血液学和药理学等。它可以帮助研究者深入理解疾病的发展过程，评估新药物对细胞凋亡的影响，以及监测疾病的进展和治疗的效果。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]总的来说，膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色是一种强大的工具，可以帮助科学家们更好地理解细胞凋亡的过程，从而为疾病的治疗和药物研发提供有价值的信息。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]更多关于膜联蛋白详情可以关注[url=https://cn.sinobiological.com/][b]义翘神州[/b][/url]！[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加 稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

维纶基牛奶蛋白纤维和维纶基大豆蛋白纤维定性分析的研究维纶基大豆蛋白纤维是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明，在纺织行业得到了快递的发展，广泛的应用，但与维纶基大豆蛋白纤维一样由我国企业自主研发的维纶基牛奶蛋白纤维也申请到专利好几年了，但迟迟没有相关标准的出台，使这一我国自主研发的新型纤维得不到有效利用新型纤维的不断推出，为我们提供了更多的纤维原料，但同时由于国家标准的相对滞后，给检测工作者带来了很大的难题，下面就目前市场上两种新型蛋白复合纤维给予试验，进行定性分析。主要原理是在观察了维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维显微结构和燃烧性状后，研究两者在常用化学试剂中的溶解性。试验结果表明，维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维在88%甲酸和浓硝酸中都能够部分溶解；在沸腾水浴中，维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维能够完全溶解于75%硫酸和98%硫酸牛奶蛋白纤维是再生蛋白质纤维，是以牛奶为原料经脱水、脱脂、分离、纯化、浓缩制成牛奶酪蛋白，与高分子化合物共混、共聚制成纺丝液，再经湿法纺丝而成；牛奶酪蛋白与聚乙烯醇制得的纤维称为维纶基牛奶蛋白纤维；牛奶酪蛋白与纤维素共聚制得粘胶基牛奶蛋白纤维。牛奶蛋白纤维含有多种氨基酸，具有良好的亲肤性和吸湿导湿性，抗菌防蛀，服用性强，受到消费者的青睐。维纶基牛奶蛋白纤维呈浅黄色，是由牛奶酪蛋白和聚乙烯醇大分子共混、共聚、醛化、揉和、脱泡，湿法纺成的纤维，克服了合成纤维吸湿性差和天然纤维强度低的不足，其比电阻介于天然纤维和合成纤维之间，吸湿性也优于聚乙烯醇纤维，在直接染料、弱酸性染料、活性染料和中性染料中都有良好的上染能力。本文在观察维纶基牛奶蛋白纤维和维纶基大豆蛋白纤维显微结构和燃烧性状后，研究两者在常用化学试剂中的溶解性，为纤维检测提供参数。大豆蛋白纤维属于再生植物蛋白纤维类，是以榨过油的大豆豆粕为原料，利用生物工程技术，提取出豆粕中的球蛋白，通过添加功能性助剂，与腈基、羟基等高聚物接枝、共聚、共混，制成一定浓度的蛋白质纺丝液，改变蛋白质空间结构，经湿法纺丝而成. 其有着羊绒般的柔软手感，蚕丝般的柔和光泽，棉的保暖性和良好的亲肤性等优良性能，还有明显的抑菌功能，被誉为“新世纪的健康舒适纤维”。大豆纤维是以脱去油脂的大豆豆粕作原料，提取植物球蛋白经合成后制成的新型再生植物蛋白纤维，是由我国纺织科技工作者自主开发，并在国际上率先实现了工业化生产的高新技术，也是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明。1 试验1. 1试验材料、仪器和试剂纤维细度成分显微分析仪，万分之一电子天平；SHA-C水浴振荡器；鼓风恒温烘箱； 索氏萃取器；酒精灯；具塞三角瓶若干。甲酸（88%）；硫酸（75%）；浓硫酸（98%）；浓硝酸；1MOL/L次氯酸钠溶液;石油醚（馏程为40℃～60℃）。1.2试验方法显微结构试验：用纤维细度成分显微分析仪观察纤维的显微结构。 以下试验维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维同一方法分别做一次燃烧性状试验：点燃酒精灯，用镊子夹取10mg左右纤维束，徐徐靠近火焰，观察试样对热的反应情况。将纤维移入火焰，观察纤维的燃烧情况；然后离开火焰，观察纤维的燃烧情况，并用鼻子闻试样燃烧刚熄灭的气味。最后，待试样熄灭冷却，观察残留物灰分的状态。预处理：取纤维5g左右，用定量滤纸包好，置于索氏萃取器中，用石油醚萃取1h，每小时至少循环6次，待试样中的石油醚挥发后，把试样浸入冷水中浸泡1h，再在（65±5）℃的水中浸泡1h，浸泡过程中时时搅拌。水（mL）与试样（g）之比为100:1。然后抽吸脱水，晾干。溶解性试验：准确称取试样1g置于具塞三角瓶中，加入100mL化学试剂，在搅拌条件下观察不同温度下纤维和试剂随时间的变化情况。待一定时间后，洗涤，抽吸排液，烘干。2 试验结果2.1显微结构在显微镜下观察维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维的横截面呈腰圆形或哑铃形，纵向有沟槽，两种纤维在显微镜下几乎无差别，无法区分这两种纤维。2.2燃烧性状维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维靠近火焰时现象都是熔融并卷曲；进入火焰，熔融、卷曲并燃烧；离开火焰，燃烧，有时会自然熄灭。燃烧过程中散发出蛋白质燃烧时所特有的臭味。纤维燃烧的一端形成黑褐色硬块。两种纤维在燃烧情况下，火焰颜色，气味几乎无差别，无法区分这两种纤维。2.3溶解性取维纶基牛奶蛋白纤维与和维纶基大豆蛋白纤维分别置于88%甲酸、75%硫酸、浓硫酸、浓硝酸和1MOL/L次氯酸钠溶液中进行溶解性试验， 品名/溶液88%甲酸[/ali

[font=宋体][font=宋体]在生物细胞的世界里，膜蛋白是一个不可或缺的角色。它们不仅参与细胞的识别、信号转导和物质运输等重要功能，还成为了药物研发的重要靶点。动物细胞的膜脂主要有[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]种，而膜蛋白的种类繁多，虽然多数膜蛋白分子数量较少，但它们赋予了细胞膜至关重要的生物学功能。[/font][/font][font=宋体]根据与脂分子的结合方式和分离难易程度，膜蛋白主要分为外在膜蛋白和内在膜蛋白两大类。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）外在膜蛋白为水溶性蛋白，通过离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合。因此，通过改变溶液的离子强度或提高温度，就可以轻松地从膜上分离出来，而不会破坏膜的结构。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般只有用去垢剂[/font][font=Calibri](detergent)[/font][font=宋体]使其膜解后才可分离出来。[/font][/font][b][font=宋体]膜蛋白提取方法：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1)[/font][font=宋体]膜蛋白色谱[/font][font=Calibri](Chromatography of Membrane Protein,CMP)[/font][font=宋体]：[/font][font=Calibri]CMP[/font][font=宋体]分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体]）溶解膜蛋白后形成[/font][font=Calibri]SDS-[/font][font=宋体]融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（[/font][font=Calibri]P-[/font][font=宋体]端），又具有阳离子钙（[/font][font=Calibri]C-[/font][font=宋体]端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体]结合量。利用原子散射法研究[/font][font=Calibri]cAMP[/font][font=宋体]的分离机制发现，样品与[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体]结合后在离子交换柱上存在[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体]分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2)[/font][font=宋体]顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用[/font][font=Calibri]Tris[/font][font=宋体]碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的沉淀用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3)[/font][font=宋体]离心蛋白提取法（[/font][font=Calibri]centrifugal protein extraction[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体]原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶胀破裂后，超高速离心[/font][font=宋体][font=Calibri]4)detergent-based[/font][font=宋体]：提取时先用裂解液裂解胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器[/font][font=Calibri](ER)[/font][font=宋体]，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的[/font][font=Calibri]DEBRIS[/font][font=宋体]就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。[/font][/font][font=宋体]总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]除了上述的提取方法，还有其他一些方法可以用于提取膜蛋白。例如，可以采用超声波破碎法或反复冻融法来破坏生物膜的结构，从而使膜蛋白释放出来。此外，还可以使用一些特殊的分离技术，如超离心或凝胶电泳，来分离和纯化膜蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]值得注意的是，不同的膜蛋白具有不同的性质和稳定性，因此需要采用不同的提取方法。在选择提取方法时，需要考虑的因素包括目标膜蛋白的分子量、溶解度、稳定性以及生物膜的组成和性质等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，提取和纯化膜蛋白是一项具有挑战性的任务，需要综合考虑多种因素。通过对不同方法的了解和比较，我们可以根据实际需求选择合适的方法来提取和纯化目标膜蛋白，为进一步的研究和应用奠定基础。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/multi-pass-transmembrane-protein][b]多次跨膜蛋白开发技术平台[/b][/url]，详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/multi-pass-transmembrane-protein[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

http://img3.17img.cn/bbs/upfile/images/20100518/201005181701392921.gif多肽蛋白等生物大分子药物分析色谱柱的选择讲座时间：2014年12月19日 10:00主讲人：金琦芸赛默飞世尔公司专业色谱耗材部产品市场经理，在赛默飞一直致力于色谱耗材方面的产品应用支持，在固相萃取，液相，气相色谱柱在制药、食品和环境中的应用，积累有丰富的经验。http://img3.17img.cn/bbs/upfile/images/20100518/201005181701392921.gif【简介】1、多肽蛋白等生物大分子药物分析色谱柱的选择2、生物大分子药物质量控制要求3、增强核技术色谱柱在多肽分离中的应用4、聚合物技术色谱柱在多肽蛋白分析中的应用 * 我们会在线上的听众中随机抽取5名幸运观众，赠送USB mini 办公/车载加湿器，报名后请记住讲座时间，别错过我们可爱的小礼品~！-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名并参会用户有机会获得100元手机充值卡一张哦~3、报名截止时间：2014年12月19日 09:304、报名参会：http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/12625、报名及参会咨询：QQ群—231246773

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=58042]色谱法在胶原蛋白分离分析中的应用[/url]希望能帮助大家。

[font=宋体][b]亲和层析技术的原理：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和分析是利用生物聚合物与基础可逆结合的原理，通过共价键将基础与载体牢固结合而成的分析系统。这种可逆结合的作用主要取决于生物聚合物对其基础的空间结构的识别。受体蛋白、载体蛋白、外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体、核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。它具有高效、简单、快速的优点，是目前分离纯化蛋白质最理想的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和色谱中，在影响蛋白质（或标签）与其配体结合的情况下，将蛋白质装载在柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白质与固定相互作用的情况下，清洗组合蛋白质。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合，取代目标蛋白，这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和色谱配体和条件[/b][/font][font=宋体]需纯化的蛋白[/font][font=宋体]配体[/font][font=宋体]洗脱条件[/font][font=宋体]抗体（抗原特异性）[/font][font=宋体]抗原肽[/font][font=宋体]游离肽[/font][font=宋体]多聚组氨酸标签蛋白[/font][font=宋体][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]Co2+[/font][/font][font=宋体]咪唑或游离组氨酸[/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]肽或低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体]还原型谷胱甘肽[/font][font=宋体]游离谷胱甘肽[/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]低[/font][font=Calibri]pH[/font][/font][font=宋体]抗体（类特异性）[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]L[/font][font=宋体]或精蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]极端值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]结合蛋白[/font][/font][font=宋体]肝素[/font][font=宋体]高离子强度[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和纯化蛋白的注意点：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]a. Ni[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：[/font][font=Calibri]NH4[/font][font=宋体]，甘氨酸，精氨酸，等等；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]各种缓冲液中不能有强螯合剂，如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]EGTA[/font][font=宋体]，等等；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]，防止二价[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]被还原；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4) [/font][font=宋体]不能含离子型的去垢剂，比如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体]，防止[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]流失；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如[/font][font=Calibri]0.1-1mM[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PMSF[/font][font=宋体]，防止目的蛋白被降解；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]v/v[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](7)[/font][font=宋体]应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](8)[/font][font=宋体]缓冲液里[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度应在[/font][font=Calibri]300mM[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]之间；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](9)[/font][font=宋体]可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]），尿素（最高可[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](10)[/font][font=宋体]可加入非离子型去垢剂，如[/font][font=Calibri]Triton[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]Tween[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]NP40[/font][font=宋体]等，最高[/font][font=Calibri]2%[/font][font=宋体]，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]b. gst[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]在细胞裂解时，加入终浓度[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]可以显著提高[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的结合效率， 在[/font][font=Calibri]Binding Buffer[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]，可以提高蛋白纯度，但是会导致其产率降低[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与介质结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于[/font][font=Calibri]6.5[/font][font=宋体]或高于[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]结合效率会降低，使用前需用[/font][font=Calibri]pH6.5[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]如[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]进行平衡；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]增大[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调至[/font][font=Calibri]pH 8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]可以提高洗脱效率而不需要增加[/font][font=Calibri]glutathione[/font][font=宋体]的浓度；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]增加[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的离子强度。加入[/font][font=Calibri]0.1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.2 M NaCl[/font][font=宋体]能提高洗脱效率；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入[/font][font=Calibri]0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside[/font][font=宋体]可以显著增加洗脱效率[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]c. proteinA[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]介质的选择[/font][font=Calibri]A,G or [/font][font=宋体]其他，其结合能力的选择[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]上样流速尽量小，让[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和抗体有充分的结合时间[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值洗脱后，快速中和。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]长时间保存加入[/font][font=Calibri]0.02-0.05[/font][font=宋体]％叠氮钠；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]抗体纯度不够，杂蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service]重组蛋白表达服务[/url]，包含[/font][font=Calibri]VLP[/font][font=宋体]形式的膜蛋白表达服务、原核（[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]）蛋白表达服务、哺乳动物细胞瞬时表达服务、杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达服务、稳定细胞系构建服务等，想咨询蛋白纯化服务的用户，可以直接[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]

采用CEX分析蛋白电荷异质性，与主峰的相对保留时间差十分钟左右的是酸性或碱性峰么？通常情况下是不是酸性峰中性峰碱性峰三者挨着？谢谢

[font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白纯化原理：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]-S-[/font][font=宋体]转移酶[/font][font=Calibri](GST)[/font][font=宋体]是一个由[/font][font=Calibri]211[/font][font=宋体]个氨基酸组成的大小为[/font][font=Calibri]26kDa[/font][font=宋体]序列，它是另一种广泛使用的可提高靶蛋白的溶解度亲和标签。[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签与固定化的谷胱甘肽具有亲和力，常用于原核表达。它可以与一个蛋白的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端或[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端融合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽亲和是一种有效的一步纯化[/font][font=Calibri]GST([/font][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]转移酶[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]标签蛋白的方法。[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]可作为一种可溶性蛋白在大肠杆菌细胞质中大量表达，并具有完全的酶活性。此外，许多在大肠杆菌中表达时不溶的真核蛋白，在表达为[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白时被证明至少部分可溶。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]转移酶（[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]）的应用：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]转移酶（[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]）是具有多基因、多功能的[/font][font=Calibri]II[/font][font=宋体]相代谢酶家族成员，广泛存在于动物、植物、昆虫、真菌、酵母和各种细菌中。能够催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物进行亲核加成反应，从而使其极性提高，易于从尿液中排出。因此，[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]家族蛋白是一类在外源化合物生物转化、保护机体免受过氧化作用损害和药物代谢过程中的一类极为重要的多功能蛋白质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在生物研究领域，来源于日本血吸虫的谷胱甘肽巯基转移酶（[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]）标签，是目前应用最为广泛的融合标签之一。融合标签技术是利用[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]重组技术将某种标签编码基因融合于目的基因的[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]′端或[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]′端，再通过适宜的宿主来表达融合蛋白。表达的融合蛋白可以通过其融合标签与包被在固相基质上的特异性配基结合，从而纯化出融合蛋白。[/font][font=Calibri]1988[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Smith[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Johnson[/font][font=宋体]首次提出[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的亲和纯化法，此后广泛使用。目前，国内外纯化[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的主要方法是亲和纯化法。[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白亲和纯化，其配基通常是[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]的底物谷胱甘肽（[/font][font=Calibri]GSH[/font][font=宋体]），通过酶与底物的特异性结合来实现[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]蛋白的分离纯化。其原理是：在固相基质上通过巯基结合一个谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间的特异性作用力，使得带[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签的融合蛋白与基质上的谷胱甘肽结合，达到分离纯化的目的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]自[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白亲和纯化法问世以来，[/font][font=Calibri]GST-pull down[/font][font=宋体]技术也随即成为一种研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的热门手段。该技术的原理是：利用重组技术将诱饵蛋白与[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签融合表达，融合表达的蛋白经纯化后与待测蛋白共同孵育，并用[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]琼脂糖凝胶或[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]琼脂糖磁珠将其分离下来，再通过[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]鉴定待测蛋白与诱饵蛋白的相互作用。这种方法简单易行，操作简单。此外，[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签还有助于对目标蛋白的检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression]GST[/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression]标签蛋白纯化[/url]常见问题解答：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为什么使用[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签来表达和生产蛋白？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在蛋白[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端添加[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签有利于通过[/font][font=Calibri]GSH[/font][font=宋体]亲和树脂对其进行检测、分离和纯化。更重要的是，由于[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]是具有很好的溶解性的高表达的蛋白，将难以表达的蛋白与[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签相融合，有时可以显著提高重组蛋白的表达量和溶解性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]纯化后如何裂解[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在某些应用（如蛋白的结晶）中需要去除[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签。为了裂解[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签，需要在标签和蛋白之间设计一个蛋白酶裂解位点。在 [/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签后面的[/font][font=Calibri]EK[/font][font=宋体]裂解位点[/font][font=Calibri](GST-EK[/font][font=宋体]位点[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]蛋白结构[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]可以使[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签和裂解位点完全去除，在[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签的特异裂解后不留下任何额外的氨基酸。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签纯化蛋白的优劣势？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]适用范围广，可在不同宿主中表达；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]增强外源蛋白可溶性；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]可用不同的蛋白酶进行去除；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]有助于保持蛋白的抗原性与生物活性，提高外源蛋白的稳定性；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]特异性好，纯化方便且温和。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]仅能纯化可溶性蛋白，若蛋白不可溶，则很难用变性的方法纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：义翘神州[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression[/font][/font]

[color=#444444]最近在做乳铁蛋白HPLC分析，标准品从sigma买的，纯度85%，用biobasic c4柱，流动相0.1%TFA的乙腈和0.1%TFA的水，梯度洗脱，280nm检测，没有检测到标准品色谱峰（1mg/ml），各位有经验的可以分享一下么？谢谢[/color]

[font=宋体]蛋白质是生物体的基本组成部分，参与各种生物过程。为了更好地理解和操控这些过程，科学家们开发了多种技术来分离和纯化蛋白质。其中，标签蛋白沉淀技术是一种非常有效的方法，它通过将特定的标签连接到目标蛋白上，利用标签的特性将其与其他蛋白分离开来。这项技术的优点在于其高特异性和高纯度，使得研究人员能够获得高质量的蛋白质样品，以进行进一步的分析和研究。在生物科学领域，[b]标签蛋白沉淀技术[/b]已成为一项关键技术，它有助于我们更好地理解生命的基本过程以及开发新的治疗方法。标签蛋白沉淀技术步骤：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①这一技术的核心在于对目标蛋白进行巧妙的改造。我们通过在蛋白编码序列中嵌入特定的标签或标记（例如[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression][b]谷胱甘肽[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression][b]S-[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression][b]转移酶[/b][/url]，[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/poly-his-tag-protein-expression][b]His[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/poly-his-tag-protein-expression][b]标签[/b][/url]，[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/flag-tag-protein-expression][b]FLAG[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/flag-tag-protein-expression][b]标签[/b][/url]等），使目标蛋白在表达时能与标签紧密结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②我们将携带标签蛋白编码序列的表达载体导入适合的宿主细胞。在适当的培养条件下，宿主细胞高效地表达出目标蛋白。随后，通过细胞破碎技术释放出蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③核心环节——沉淀。利用标签与亲和配体间的特异性结合力，我们使用具有亲和性的树脂、磁珠或柱子将目标蛋白从混合物中分离出来。不同标签有其独特的亲和性，确保了蛋白的高纯度分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④在成功沉淀目标蛋白后，我们通过洗涤步骤去除其他杂质和未结合的蛋白。最后，只需特定的洗脱条件，目标蛋白便能从亲和树脂上完全洗脱下来。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤经过这一系列步骤，我们获得的蛋白纯净度极高，可进行各种后续分析，如[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、质谱等。而这些高纯度蛋白在科学实验、药物研发、生物工程等领域具有广泛的应用前景。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]值得注意的是，选择合适的标签和亲和树脂是这项技术的关键。同时，标签的引入可能会对蛋白的结构和功能产生影响，因此在实验设计时必须慎重考虑。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总的来说，[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]标签蛋白[/b][/url]沉淀技术以其精准、高效的特性，为蛋白质研究领域带来了革命性的突破。随着科学技术的不断进步，我们有理由相信这一技术将继续为生命科学领域带来更多突破性的发现。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]蛋白标签[/b][/url]详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag[/font][/font]