蛋白印迹分析仪

AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤很简单的，比较适合初学者。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=113913]AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤[/url]

想了解蛋白印迹仪，哪位手上有资料可以发给我谢谢!xq.shi@126.com

牛奶蛋白质分析仪可以用于检测乳蛋白制品。以下是详细解释和相关信息：　　功能与应用：牛奶蛋白质分析仪是一种专门用于分析牛奶及其制品中蛋白质含量的仪器。它基于先进的生化分析技术，如比色法、光谱法或电化学法等，能够准确、快速地检测样品中的蛋白质含量。　　乳蛋白制品的检测：乳蛋白制品，如奶粉、酸奶、奶酪等，其蛋白质含量是产品质量和营养价值的重要指标。牛奶蛋白质分析仪可以有效地检测这些乳蛋白制品中的蛋白质含量，为生产厂家提供准确的质量控制手段。　　优点与特点：　　准确性高：牛奶蛋白质分析仪具有高灵敏度和高准确性，能够确保测量结果的可靠性。　　快速便捷：该仪器操作简单，使用方便，可以快速得出测量结果，提高检测效率。　　适用范围广：除了牛奶及其制品外，还可以用于其他含蛋白质样品的检测，如豆类制品、肉制品等。　　在乳品工业中的重要性：随着乳品市场的不断扩大和消费者对乳制品质量要求的提高，牛奶蛋白质分析仪在乳品工业中的重要性日益凸显。它可以帮助乳品企业提高产品质量、降低生产成本，同时为消费者提供更加安全、健康的乳制品。　　综上所述，牛奶蛋白质分析仪是一种功能强大、应用广泛的检测仪器，完全可以用于检测乳蛋白制品中的蛋白质含量。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/05/202405271615421543_8284_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

我所在的实验室今年想买一台蛋白印迹仪，没用过，不知重要的技术参数有哪些呢？请各位高人指点

不知有谁使用过这个机器，是否能提供DU530核酸/蛋白分析仪使用说明书，谢谢！

请教一下各位：用氨基酸分析仪能检测皮革水解蛋白吗？

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq][b][font=Calibri]WB([/font][font=宋体]蛋白质印迹[/font][font=Calibri])[/font][/b][/url][font=宋体]是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面针对[/font][b][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]在实验过程中遇到的问题进行罗列及解答：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]请您检查所使用的封闭液并注意封闭以及洗膜的时间。有两种常用的封闭液：脱脂奶粉或[/font][font=Calibri]BSA[/font][font=宋体]。脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白的封闭，因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合在膜上并与磷酸化特异性抗体结合导致高背景。并且稀释抗磷酸化酪氨酸抗体与脱脂奶粉中的酪蛋白结合后，用于检测的抗体较少导致信号减弱。此外，避免封闭时间过长，否则会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致高背景。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用含[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]，含吐温[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]作为封闭液，请勿使用脱脂奶粉。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？[/font][/font][font=宋体]如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，可能的原因及解决方案如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①可能的原因一：使用了不同的样本。[/font][font=宋体]解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。[/font][font=宋体]②可能的原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。[/font][font=宋体]解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。[/font][font=宋体]③可能的原因三：抗体被污染。解决方案： 旋转小瓶，检查是否有沉淀。[/font][font=宋体]④可能的原因四：二抗失效。解决方案：更换新的二抗。[/font][font=宋体]⑤可能的原因五：蛋白质转膜效率低。解决方案：配置新的转膜液；根据蛋白分子量大小调整转膜时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、如何避免转膜不充分或结果不理想的问题？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于[/font][font=Calibri]180 kDa[/font][font=宋体]，则需要通过以下方式优化转膜条件：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 使用[/font][font=Calibri]20% MeOH[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 加入[/font][font=Calibri]0.05% SDS[/font][font=宋体]转膜缓冲液。[/font][/font][font=宋体]? 增加裂解物的上样量。[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]110 V[/font][font=宋体]恒压转[/font][font=Calibri]150 min[/font][font=宋体]，湿法转膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免进行蛋白免疫印迹法时出现[/font][font=宋体]“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法[/font][font=Calibri]: [/font][/font][font=宋体]? 延长封闭时间，以优化封闭效果。[/font][font=宋体]? 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。[/font][font=宋体]? 在配置封闭液时，确保奶粉完全溶于溶液。[/font][font=宋体]? 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、如何避免印迹上出现“点状”、不均匀的斑点？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免印迹上出现[/font][font=宋体]“点状”或不均匀斑点，请尝试以下几种方法：[/font][/font][font=宋体]? 检查所有缓冲液是否被细菌污染。[/font][font=宋体]? 确保在抗体和清洗孵育过程中膜完全浸入。[/font][font=宋体]? 在转膜时，排除薄膜和凝胶之间的所有气泡。[/font][font=宋体]? 将膜放在摇床上，确保均匀地接触。[/font][font=宋体]? 清洗蛋白免疫印迹所需的设备。[/font][font=宋体][font=宋体]? 过滤[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]结合物，除去任何可能的聚集物。[/font][/font][font=宋体]?减少底物暴露时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、选择什么作为[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]抗体的阳性对照？[/font][/font][font=宋体]为了使您的蛋白免疫印迹抗体中获得最佳性能，请使用技术数据表中推荐的阳性对照。阳性对照将帮助您按照制定的方案，在实验中获得准确的结果。[/font][font=宋体][font=宋体]我们建议将这些裂解物放置在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下长期储存。裂解物非常稳定，它们是细胞制剂，所有酶均变性和灭活。我们做了大量的研究，证实了不同条件下的稳定性。例如，大多数裂解物的完整性和质量不受反复冻融的影响，可在[/font][font=Calibri]25[/font][font=宋体]℃下储存长达[/font][font=Calibri]12[/font][font=宋体]周。但裂解物在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]下[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]周时开始降解。然而，根据裂解物的来源，稳定性可能存在一些轻微差异，因此我们建议将其储存在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、应该分析多少蛋白质？[/font][/font][font=宋体]我们建议：[/font][font=宋体]样本类型[/font][font=宋体]每条泳道[/font][font=宋体]全细胞裂解液[/font][font=宋体][font=Calibri]50 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体]细胞核提取物[/font][font=宋体][font=Calibri]25 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、应该使用多少浓度的丙烯酰胺凝胶来分离蛋白？[/font][/font][font=宋体]为了更好地分离感兴趣蛋白，丙烯酰胺凝胶的百分比应基于蛋白分子量。我们建议：[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白大小（[/font][font=Calibri]kDa[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]丙烯酰胺凝胶百分比（[/font][font=Calibri]%[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri] 80[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7.5[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用硝酸纤维素（[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]）膜。虽然聚偏二氟乙烯（[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]）膜、尼龙膜和[/font][font=Calibri]DEAE[/font][font=宋体]纤维素膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是实验过程中使用山羊多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]10[/font][font=宋体]、应该使用什么封闭缓冲液？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]封闭液的选择与目标蛋白有关，我们建议一般使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]5%[/font][font=宋体]脱脂奶粉、[/font][font=Calibri]0.05%[/font][font=宋体]吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]作为封闭液，在室温下封闭[/font][font=Calibri]30-60[/font][font=宋体]分钟或在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃下封闭过夜。请注意，如果封闭过夜，缓冲液中应不加吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]。如果目标蛋白较特殊（如磷酸化），建议使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]并含有吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]的封闭液，可得到较清晰条带。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]11[/font][font=宋体]、一抗的稀释倍数一般是多少？[/font][/font][font=宋体]请查看各个抗体的数据表，因为这通常记录起始稀释度。如果数据表上没有具体稀释信息，我们建议您对相关的阳性和阴性对照进行连续滴定。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]12[/font][font=宋体]、为什么实际的蛋白免疫印迹条带大小与预期的不同？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白免疫印迹法是根据蛋白质大小分离蛋白的技术。一般来说，蛋白越小，其在[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]凝胶中移动的速度就越快。然而，移动速率也受到其他因素的影响，因此实际条带大小可能与预测不一致。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①翻译后修饰[/font][font=宋体]例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质的大小。[/font][font=宋体]②翻译后切割[/font][font=宋体]大多数蛋白质首先合成为前体蛋白形式，再经切割产生活性形式，例如前体半胱天冬酶。[/font][font=宋体]③剪接变体[/font][font=宋体][font=宋体]可变剪切会产生从同一基因产生不同大小的蛋白质。剪接变体的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件[/font] [font=宋体]。[/font][/font][font=宋体]④亚型[/font][font=宋体]许多蛋白质表达多种不同大小的亚型。相同靶蛋白不同亚型的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件。参照不同的网站，确定特定靶标的亚型。[/font][font=宋体]⑤相对电荷[/font][font=宋体][font=宋体]氨基酸组成（带电[/font][font=Calibri]vs.[/font][font=宋体]不带电）。[/font][/font][font=宋体]⑥多聚体[/font][font=宋体]例如蛋白质二聚化。尽管相互作用可能导致出现较高条带，但在还原条件下需防止该情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]13[/font][font=宋体]、为什么蛋白免疫印迹结果信号微弱或完全没有信号？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①抗体滴定 [/font][font=宋体][font=宋体]应使用多种抗体浓度进行抗体滴定实验，以确定最佳信噪比的合适抗体浓度。一般而言，滴定浓度应在[/font][font=Calibri]0.2-5.0 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/mL[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②组织[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]细胞特异性 [/font][/font][font=宋体]靶蛋白表达取决于待测的细胞或组织。应进行文献检索，确保您正在使用的细胞等条件适用于检测靶蛋白。[/font][font=宋体]③复溶 [/font][font=宋体]在重新溶解冻干抗体时应注意，确保抗体全部溶解。尽管冻干抗体沉淀通常位于试管底部，但有时粉末可能位于管壁上。因此，溶解时应覆盖试管的整个表面，以确保抗体完全溶解。然后进行短暂离心，确保将所有粉末收集在试管底部。[/font][font=宋体]④阳性对照 [/font][font=宋体]在您的蛋白免疫印迹中添加阳性对照泳道是评价抗体是否正常工作和实验条件是否适当的最佳方法。另外，基于文献或实验结果的阳性对照也可以用来评估抗体是否正常发挥作用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]蛋白免疫印迹法常见问题详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服[/b][/url]务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font]

维纶基牛奶蛋白纤维和维纶基大豆蛋白纤维定性分析的研究维纶基大豆蛋白纤维是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明，在纺织行业得到了快递的发展，广泛的应用，但与维纶基大豆蛋白纤维一样由我国企业自主研发的维纶基牛奶蛋白纤维也申请到专利好几年了，但迟迟没有相关标准的出台，使这一我国自主研发的新型纤维得不到有效利用新型纤维的不断推出，为我们提供了更多的纤维原料，但同时由于国家标准的相对滞后，给检测工作者带来了很大的难题，下面就目前市场上两种新型蛋白复合纤维给予试验，进行定性分析。主要原理是在观察了维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维显微结构和燃烧性状后，研究两者在常用化学试剂中的溶解性。试验结果表明，维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维在88%甲酸和浓硝酸中都能够部分溶解；在沸腾水浴中，维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维能够完全溶解于75%硫酸和98%硫酸牛奶蛋白纤维是再生蛋白质纤维，是以牛奶为原料经脱水、脱脂、分离、纯化、浓缩制成牛奶酪蛋白，与高分子化合物共混、共聚制成纺丝液，再经湿法纺丝而成；牛奶酪蛋白与聚乙烯醇制得的纤维称为维纶基牛奶蛋白纤维；牛奶酪蛋白与纤维素共聚制得粘胶基牛奶蛋白纤维。牛奶蛋白纤维含有多种氨基酸，具有良好的亲肤性和吸湿导湿性，抗菌防蛀，服用性强，受到消费者的青睐。维纶基牛奶蛋白纤维呈浅黄色，是由牛奶酪蛋白和聚乙烯醇大分子共混、共聚、醛化、揉和、脱泡，湿法纺成的纤维，克服了合成纤维吸湿性差和天然纤维强度低的不足，其比电阻介于天然纤维和合成纤维之间，吸湿性也优于聚乙烯醇纤维，在直接染料、弱酸性染料、活性染料和中性染料中都有良好的上染能力。本文在观察维纶基牛奶蛋白纤维和维纶基大豆蛋白纤维显微结构和燃烧性状后，研究两者在常用化学试剂中的溶解性，为纤维检测提供参数。大豆蛋白纤维属于再生植物蛋白纤维类，是以榨过油的大豆豆粕为原料，利用生物工程技术，提取出豆粕中的球蛋白，通过添加功能性助剂，与腈基、羟基等高聚物接枝、共聚、共混，制成一定浓度的蛋白质纺丝液，改变蛋白质空间结构，经湿法纺丝而成. 其有着羊绒般的柔软手感，蚕丝般的柔和光泽，棉的保暖性和良好的亲肤性等优良性能，还有明显的抑菌功能，被誉为“新世纪的健康舒适纤维”。大豆纤维是以脱去油脂的大豆豆粕作原料，提取植物球蛋白经合成后制成的新型再生植物蛋白纤维，是由我国纺织科技工作者自主开发，并在国际上率先实现了工业化生产的高新技术，也是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明。1 试验1. 1试验材料、仪器和试剂纤维细度成分显微分析仪，万分之一电子天平；SHA-C水浴振荡器；鼓风恒温烘箱； 索氏萃取器；酒精灯；具塞三角瓶若干。甲酸（88%）；硫酸（75%）；浓硫酸（98%）；浓硝酸；1MOL/L次氯酸钠溶液;石油醚（馏程为40℃～60℃）。1.2试验方法显微结构试验：用纤维细度成分显微分析仪观察纤维的显微结构。 以下试验维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维同一方法分别做一次燃烧性状试验：点燃酒精灯，用镊子夹取10mg左右纤维束，徐徐靠近火焰，观察试样对热的反应情况。将纤维移入火焰，观察纤维的燃烧情况；然后离开火焰，观察纤维的燃烧情况，并用鼻子闻试样燃烧刚熄灭的气味。最后，待试样熄灭冷却，观察残留物灰分的状态。预处理：取纤维5g左右，用定量滤纸包好，置于索氏萃取器中，用石油醚萃取1h，每小时至少循环6次，待试样中的石油醚挥发后，把试样浸入冷水中浸泡1h，再在（65±5）℃的水中浸泡1h，浸泡过程中时时搅拌。水（mL）与试样（g）之比为100:1。然后抽吸脱水，晾干。溶解性试验：准确称取试样1g置于具塞三角瓶中，加入100mL化学试剂，在搅拌条件下观察不同温度下纤维和试剂随时间的变化情况。待一定时间后，洗涤，抽吸排液，烘干。2 试验结果2.1显微结构在显微镜下观察维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维的横截面呈腰圆形或哑铃形，纵向有沟槽，两种纤维在显微镜下几乎无差别，无法区分这两种纤维。2.2燃烧性状维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维靠近火焰时现象都是熔融并卷曲；进入火焰，熔融、卷曲并燃烧；离开火焰，燃烧，有时会自然熄灭。燃烧过程中散发出蛋白质燃烧时所特有的臭味。纤维燃烧的一端形成黑褐色硬块。两种纤维在燃烧情况下，火焰颜色，气味几乎无差别，无法区分这两种纤维。2.3溶解性取维纶基牛奶蛋白纤维与和维纶基大豆蛋白纤维分别置于88%甲酸、75%硫酸、浓硫酸、浓硝酸和1MOL/L次氯酸钠溶液中进行溶解性试验， 品名/溶液88%甲酸[/ali

在发明蛋白质印迹法（Western Blot）出现了30多年之后，这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白质印迹法）”的命名者，他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年发明的一项技术，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列）、Northern Blotting（随后发明出的相似策略，用于鉴定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski实验室三者之意。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201309/22/095234xzm2pso06fsmtbof.jpgBurnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来，当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此，这个名称还是沿袭了下来，而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。工作原理蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳（Gelelectrophoresis）按照大小分离蛋白质，然后通过将膜置于胶上，将蛋白质转移到膜上（通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水纸，然后将这套堆层放在缓冲溶液中，这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。另外两项技术是干法和半干转印法，这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整，但是对于高分子量蛋白质而言，效率更低。对于半干转印方法来说，膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间，将这些都夹在阴极和阳极之间，电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中，干法转印最快，但转印效率也最低。转印结束后，膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱，再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。最后一步是检测，通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中，与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应，可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中，抗体探针被荧光集团所标记。荧光检测方法的主要优势在于，它可以同时检测多个蛋白质，并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比，也更有利于量化研究。不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化，期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点，让研究人员能够随时监测实验进展，甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化，从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。加速免疫检测过程转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间，EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程，使用真空装置通过膜推入试剂，而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟，Hatler表示。她解释说：“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走，只是加了一个真空装置。”Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶（8.5×13.5厘米）和迷你凝胶（7.5×8.4厘米），之前则只能用迷你凝胶。“这一设备很便宜，操作也很简便，但切实提高了实验效率，节省了实验时间。” Hatler说。伯乐公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器，能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方，特殊的过滤材料和增强的电流强度（由一个集成电源调节），这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印，并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间，而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。增加验证点以缓解忧虑蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧，尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术，”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说，“我们对用户调查时发现，一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”Short还说：“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶，利用其ChemiDoc MP胶成像系统，使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上，进而确证高质量的蛋白质转移，便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计，能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。这些验证点“真的很有用”，在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我们可以成像这些免染的凝胶，不用加入额外的染料，而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像，如果其中任何一个步骤出现问题，我们都可以在这一点上停止实验进程。”成像和软件提高定量性当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时，世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统，这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力，争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统，其大小可在实验台上操作。Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi，分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统，并配有GeneSys成像软件。2012年10月，赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像仪，使用紫外和可见光透射法，专业的滤镜和电荷耦合器件（CCD）摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。

牛奶蛋白质分析仪的原理主要基于光学测量技术，特别是光谱分析法。具体地说，它采用红外光谱法来测量牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的含量。首先，将牛奶样品制成透明薄片，然后使用近红外光电传感器和光源对其进行扫描。牛奶中的蛋白质对特定波长的红外光有特定的吸收特性，通过测量这些吸收特性，可以分析出牛奶中蛋白质的种类和含量。此外，仪器会将牛奶光谱与事先建立的标准光谱进行比较，通过复杂的算法处理，从而得出各种蛋白质形态的含量。这种比较和计算过程确保了测量结果的准确性和可靠性。总的来说，牛奶蛋白质分析仪通过光学测量和光谱分析技术，能够快速、准确地测定牛奶中蛋白质的含量和种类，为乳制品生产、质量控制和科学研究提供了有力的支持。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/04/202404291701212298_2595_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378379551.jpg 氨基酸是蛋白质的基础组成单位，通过研究蛋白质中氨基酸的性质和组成来预测蛋白质的结构和功能，蛋白质氨基酸残基组成分析主要是通过氨基酸分析仪来完成的，本文推荐了2个基于氨基酸组成进行蛋白质预测软件。基于氨基酸组成的蛋白质预测软件根据组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质可以辨析电泳等实验中的未知蛋白质，也可以分析已知蛋白质的物化性质。ExPASy工具包包涵的程序：AACompIdent：与把氨基酸序列在SWISS-PROT库中搜索不同，AACompIdent工具利用未知蛋白的氨基酸组成去确认具有相同组成的已知蛋白。该程序分析时需提交的相关信息包括：蛋白质的氨基酸组成、等电点pI和分子量(如果知道)、正确的物种分类及特别的关键词。此外，用户还需在六种氨基酸“组合”中作出选择，这影响到分析如何进行。例如，某种“组合”会把残基Asp/Asn(D/N)和Gln/Glu(Q/E)组合成 Asx(B)和Glx(Z);或者某种残基会在分析中被完全除去。对数据库中的每一个蛋白序列，算法会对其氨基酸组成与所查询的氨基酸组成的差异打分。由电子邮件返回的结果被组织成三级列表：第一张列表中的蛋白都基于特定的物种分类而不考虑pI和分子量;第二张列表包含了不考虑物种分类、pI和分子量的全体蛋白;第三张列表中的蛋白不但基于特定物种分类，并且将 pI和分子量也考虑在内。虽然计算所得结果各不相同，但零分表明了该序列与提出的组成完全相符。AACompSim：AACompIdent的一个变种，AACompSim提供类似的分析，但与前者以实验所得的氨基酸组成为依据进行搜索不同，后者使用SWISS-PROT中的序列为依据。有报道称，氨基酸组成在物种之间是十分保守的(Cordwell等，1995)，并且通过分析氨基酸的组成，研究者能从低于25%序列相似性的蛋白之间发现弱相似性(Hobohm和Sander，1995)。因此，在“传统的”数据库搜索基础上辅以组成分析，能为蛋白质之间关系提供更多见解。PROSEARCH：PROPSEARCH也提供基于氨基酸组成的蛋白质辨识功能。用144种不同的物化性质来分析蛋白质，包括分子量、巨大残基的含量、平均疏水性、平均电荷等，把查询序列的这些属性构成的“查询向量”与SWISS-PROT和PIR中预先计算好的各个已知蛋白质的属性向量进行比较。这个工具能有效的发现同一蛋白质家族的成员。可以通过Web使用这个工具，用户只需输入查询序列本身。分子量搜索(MOWSE)分子量搜索(MolecularWeightSearch，MOWSE)算法利用了通过质谱(MS)技术获得的信息。利用完整蛋白质的分子量及其被特定蛋白酶消化后产物的分子量，一种未知蛋白质能被准确无误地确认，给出由若干实验才能决定的结果。由于未知蛋白无需再全部或部分测序，这一方法显著地减少了实验时间。MOWSE的输入是一个纯文本文件，包含一张实验测定的肽段列表，分子量范围在0.7到4.0Kda之间。计算过程基于在OWL非冗余蛋白质序列库中包含的信息。打分基于在一定分子量范围内蛋白中一个片段分子量出现的次数。输出的结果是得分最佳的30个蛋白的列表，包括它们在OWL中的条目名称、相符肽段序列、和其它统计信息。模拟研究得出在使用5个或更少输入肽段分子量时，准确率为99%。该搜索服务可通过向mowse@daresburg.ac.uk发送电子邮件实现。为获得更多关于查询格式的细节信息，可以相该地址发送电子邮件，并在消息正文中写上“help”这个词。蛋白质氨基酸组成分析用盐酸在110 ℃将蛋白或多肽水解成游离的氨基酸，用氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量。采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通HPLC相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化(例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等)通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统(钠盐系统)和游离氨基酸分析系统(锂盐系统)，利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好;锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度(即最低检测限)比HPLC柱前衍生方法稍低以外(HPLC：0.5 pmol;氨基酸分析仪：10 pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。蛋白质氨基酸残基组成分析的主要步骤包括：首先是蛋白被水解为氨基酸，其次是采用离子色谱等方法进行游离的氨基酸含量和组成的分析。总之利用蛋白可以分析氨基酸，利用氨基酸也可以研究蛋白质。

传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费

最近在做几个酸性蛋白的CIEF。贝克曼的方法比较适用于中性和偏碱性的蛋白分析，对于酸性蛋白分析效果不太理想。氨水迁移法比较适合酸性蛋白，但是据说很伤柱子，做不了几个样品。讨论一下，有没有人遇到同样的问题，是怎么优化方法的呢?我尝试调整占位剂的配比，暂时也没有得到理想的结果。

传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。

蛋白质分析仪的校准

蛋白分析系统在我们选择蛋白分析工具的时候，通常是根据不同的蛋白来选择不同的分析手段，如凝胶电泳、化学荧光染色、质谱等等。但是目前已经研制出的蛋白分析工具的种类繁多，从这一方面也在一定程度上反映了蛋白分析的复杂性。以下是一些近期推出的蛋白分析系统，希望能帮助您轻松完成研究工作。

把蛋白完全水解成氨基酸，可以在pmol到nmol水平上分离和定量。虽然氨基酸的序列信息已经无法得到，但是组成蛋白的氨基酸种类及含量信息可以得到,利用氨基酸的指纹信息可以鉴定蛋白。

几种常用的蛋白鉴定方法传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费3～4$。 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。 然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。 当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10～20个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。 选择BLAST程序，可与数据库相配比。 目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。3 与质谱（mass spectrometry）相关的技术质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。 它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。 其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。 近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器（ion reflectron）和延迟提取（delayed ion extraction），可达相当精确的分子量。 在ESI-MS中，纳米级电雾源（nano-electrospray source）的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱（tandem MS）联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。 甚至可在attomole水平进行。 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）由Henzel等人于1993年提出。 用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），这一技术能够完成的肽质量可精确到0。1个分子量单位。 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的）。 配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。(2)肽片段（peptide fragment）的部分测序肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。 为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。 用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。 另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。 化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在质谱仪内应用源后衰变（post-source decay， PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation， CID），目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。 因此，允许推断肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。 首先进行肽质指纹鉴定。 之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。 在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 但经常产生不完全的片段。 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。 在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。 与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。 由此，序列可被推测。 由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。 这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。4 氨基酸组分分析1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术。 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签。 Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在15

大家好，氨基酸分析仪与蛋白质测序仪有主要区别在什么地方呢？目前实验室需要进行氨基酸的测序分析，究竟买一台蛋白质测序仪好呢，还是氨基酸分析仪好呢？价格大概有多少呢？这些仪器有没有国产的呢 QQ：2392795357

褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

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我的硕士研究课题是乳制品中非乳蛋白的检测，主要针对于研究植物水解蛋白和动物水解蛋白，想请教有谁做过皮革，羽毛等动物水解蛋白的蛋白质成分分析，这方面的文献很少，希望得到大家的帮忙！正在焦急中[em30] [em06] [em53]

采用CEX分析蛋白电荷异质性，与主峰的相对保留时间差十分钟左右的是酸性或碱性峰么？通常情况下是不是酸性峰中性峰碱性峰三者挨着？谢谢

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