蛋白质聚颗粒计

研究蛋白质热稳定性的几种方法蛋白跟核酸不一样，核酸都是由四个碱基组成，只是组成的顺序不一样，但是整体的结构都是类似的双螺旋结构。而蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。所以每个不同功能的蛋白长得样子其实都是不同的。蛋白的高级结构决定其功能，行使功能需要正确折叠。蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。蛋白质在一定的物理和化学条件（加热、加压、脱水、振荡、紫外线照射、超声波、强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基硫酸钠）下，其空间构象容易发生改变而失活，因此研究蛋白的构象和构型变化对其应用有重要的价值。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。热变性是蛋白质变性中最常见的一类现象。蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(meltingtemperature，Tm)来表示，即蛋白质解折叠50%时的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等。目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 01 圆二色谱法（CD）圆二色光谱（简称CD），或红外（傅里叶变换红外（FourierTransformInfrared，FTIR）光谱），是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单的方法。圆二色谱法诞生于20世纪60年代，其原理是利用左、右两束偏振光透过具有手性结构的生物大分子等活性介质，获得的圆二色谱来分析其结构特点，是蛋白质、核酸、糖类等生物大分子二级结构分析的常规手段之一。蛋白由α螺旋和β折叠构成，α螺旋和β折叠在红外和紫外光段有特异的光吸收。蛋白质对左旋和右旋圆偏振光的吸收存在差异，利用远紫外区（190~260nm）的光谱特征能够快速分析出溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别出蛋白质的三级结构类型，变温过程中测量蛋白等物质的圆二色谱，能反映其随温度升高结构变化的趋势。此外，通过测定蛋白质在不同温度下的平均残基摩尔椭圆度[θ]可以获得蛋白质的Tm值。特点：圆二色光谱（CD）适用于测定稀释溶液的热稳定性，操作相对简单，成本较低。但是相关仪器很昂贵，对缓冲液要求也高，要求溶液不能有任何的紫外吸收，也很难做到高通量检测。 02差示扫描量热法（DSC） 蛋白变性时会有温度变化，检测温度变化就能知道蛋白变性程度。差示扫描量热法的应用始于20世纪60年代，是在程序控温下，通过测量输给待测物和参比物的功率差与温度的关系，以获得吸放热量的技术。差示扫描量热法能定量测量热力学参数，可提供与蛋白质热变性过程中构象变化有关的热效应信息。差示扫描量热法（DSC）是一个很经典的一个技术，基于的蛋白变性过程中对热量的吸收。蛋白是有三维结构的，比如氢键，疏水键，范德华力。一旦通过加热然后把结构破坏掉，需要吸收热量。所以可以测量热量变化，就是加热结构变化过程中的热量吸收。通过对参照物和样品同时进行升温或冷却处理，测定两者为保持相同温度所产生的热量差，从而计算蛋白质的Tm值。特点：差示扫描量热法（DSC）能够提供直接的热量变化数据，定量准确、操作简便。但检测通量低、耗时较长，需要的样品体积和浓度比较大。相关仪器中最核心的部件是样品池，对周围环境要求极高。 03 动态光散射法（DLS）动态光散射是基于光学的方法，检测的是蛋白变性之后会发生聚集，导致颗粒的大小发生改变，对散射信号的影响。蛋白在变性过程中，从一个规则高级折叠结构打开，变成一个线性的松散结构。本来外部是亲水的氨基酸，内部是疏水的氨基酸。一旦打开之后，这些疏水的氨基酸会相互就是结合到一起。就是因为疏水的一个相互作用，然后变成一个球状聚集体。此过程会引起这个光的散射的变化。基于动态光散射的信号随着加热的过程的变化就代表粒径的变化，可以计算出蛋白质的Tm值。动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。特点：动态光散射可以做到孔板式的检测，具有比较高的通量。但是对于某些样品的检测有限制，因为并不是所有的蛋白在变异之后都会形成这种聚集体，而有一些可能需要很高的浓度才会提升，浓度较低条件下，就观察不到粒径的变化。 04 外源差示扫描荧光法（DSF）差示扫描荧光（DSF）也被称为热荧光法（ThermoFluor），是一种经济高效且易于使用的生物物理技术，通过检测当温度升高或变性剂存在时荧光发射光谱的相应变化来确定蛋白质的变性温度(热变性温度Tm值或化学变性Cm值)。Pantoliano等最先应用此技术测定了上百种蛋白质的热稳定性。差示扫描荧光法分为添加外源荧光染料与不添加荧光染料两种方式，都是利用加热使蛋白内部疏水基团暴露这一特点进行检测Tm值。传统DSF经常使用350/330比值法来进行数据分析根据荧光源不同分为内源荧光DSF和外源荧光染料DSF。基于外源染料荧光的DSF其原理是利用能与蛋白内部疏水基团相互作用的染料为荧光源。蛋白质加热变性后疏水基团暴露，疏水基团与亲和性染料结合产生荧光信号，检测荧光强度变化测定蛋白质的Tm值。特点：借助荧光定量PCR适用于高通量筛选，信号强度可控，灵敏度和准确性都较高。但添加的外源染料可能会对蛋白质结构和功能产生影响，且操作较复杂，不适用于所有蛋白研究。比如做膜蛋白研究时，溶液环境中需要添加双亲性的分子，一端疏水一端亲水。这种情况荧光分子会直接结合到疏水端，导致直接产生荧光信号。并且染料种类的选择、浓度的选择也很繁琐。外源荧光染料DSF也可能会产生背景荧光以及非特异吸附等假阳性结果。 05 内源差示扫描荧光法（inDSF）内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时(如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。以色氨酸为例，在蛋白质疏水的内核微环境中，其内源荧光最大发射波长在330nm左右，而在亲水的极性微环境中，色氨酸的内源荧光最大发射波长则出现在350nm左右。蛋白质热变性或者化学变性通常会导致色氨酸残基周围微环境的极性发生变化，使通常被包埋于蛋白质疏水内核的色氨酸逐渐暴露于亲水的环境中，从而导致发射内源荧光最大发射波长发生红移(RedShift)，即向更大的波长区域移动。特点：内源差式扫描荧光DSF无需复杂的样品处理或标记步骤，实验过程简单方便。但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，所以对于部分样品检测灵敏度不够，且检测可能会受其他基团影响。 06 技术对比总结总得来说，DSF和DLS法在样品用量及测定效率上更有优势，比较适合进行高通量筛选。但DSF法需要样品含有色氨酸、酪氨酸或额外添加荧光染料，这可能会对样品测量范围带来一定限制，DLS对样品浓度有要求。DLS还可以获取聚集体粒径大小的信息。DSC法虽然在样品用量与检测效率上不及DSF，但作为量热的经典方法仍是不可缺少的Tm值测量手段，在进行批量样品的热稳定性筛选时，可以使用DSF法初筛，DSC法复筛。此外，DSC能测定蛋白质变性过程中的热容变化ΔCp、焓变ΔH、解折叠自由能ΔG、玻璃态转变温度、分子流动临界温度等其他重要热力学参数。CD作为检测蛋白二级结构的经典方法，在Tm值测定方面具有其独特优势和一定的局限性，也是研究加热过程中蛋白结构改变的重要方法。蛋白质Tm值测定具有重要的实际应用价值，例如辅助生物药物开发、生产和质量控制，评估生物相似性、优化蛋白药物配方等，还可以作为探索蛋白质高级结构的手段之一指导蛋白质工程，如比较不同突变对蛋白质稳定性的影响，研究结构域改变与功能活性改变关联性等。比较不同Tm值测定方法，全面了解技术特点及测量效果对于Tm值测定的实际应用具有一定的指导意义，在科研或生产工作中可以灵活选用或联用多种技术来阐明不同条件下的结构变化特点。 07 国产蛋白稳定性分析仪PSA-16 北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产蛋白稳定性分析仪，该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16是一款无需荧光染料、高通量、低样品消耗量的检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。 多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16在各学科的研究中都有重要的意义。1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）4. 抗体偶联药物（ADC）研究5. 多结构域去折叠特性研究6. 物理和化学条件强制降解研究7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）10. 蛋白纯化条件快速优化等

大家好，本周分享一篇发表在ACS central science上的文章，题目是Redirecting RiPP Biosynthetic Enzymes to Proteins and Backbone-Modified Substrates，通讯作者是来自UC伯克利分校的Matthew B. Francis教授和Alanna Schepartz教授。核糖体合成和翻译后修饰多肽 (RiPP，Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides) 是肽衍生的天然产物，具有强效的抗菌、抗病毒和抗癌特性。RIPP 生物合成始于核糖体合成的多肽，其 N 端先导序列 (~20–110 aa) 会招募一种或多种能够对相邻 C 端底物序列进行多种翻译后修饰 (PTM) 的内源酶。环化脱水酶和脱氢酶是其中研究得非常充分的 RiPP 酶。这些酶共同催化分子内环化和随后的芳构化反应，在多肽链中安装恶唑啉/恶唑和噻唑啉/噻唑杂环。Naismith 及其同事设计了一个环化脱水酶家族，先导肽与脱水酶催化剂的 N 端而不是与底物多肽的N端相融合。这些酶，尤其是LynD Fusion (LynD-F)和 MicD Fusion (MicD-F)，以不依赖先导肽的方式发挥作用，以促进含有 C 末端上Ala-Tyr-Asp (AYD) 识别序列的多肽环化脱水。此外， Schmidt 和同事证明了两种脱氢酶 ArtGox 和 ThcOx 也接受无先导肽底物。总而言之，与基于嵌合先导肽或先导肽交换的方法不同，这些酶代表了一种完全无先导的途径得到安装噻唑和恶唑键的多肽。在本文中，作者报告了使用 MicD-F和 ArtGox共同作用来处理含有多种翻译相容的氨基苯甲酸衍生物和 β-氨基酸的多肽底物，得到含恶唑啉/恶唑和噻唑啉/噻唑杂环的骨架。作者在测试中发现，MicD-F 和 ArtGox 在 +1 位点（环化反应位点前一个残基）和-1位点（环化反应位点后一个残基）均接受具有不同结构的底物，且-1 位点对非α-氨基酸单体的耐受性低于 +1 位点。作者进一步实验证明，RiPP 生物合成酶可以重定向到完整的折叠蛋白。他们发现MicD-F 和 ArtGox 可以在蛋白质loop和linker安装杂环骨架，而不会破坏天然的三级折叠。即使插入的 CAYD 序列在mCherry（一种大的 β-桶蛋白）的C 末端，或是嵌入在二聚体 α-螺旋束蛋白 Rop中的loop区，仍然可以得到折叠完好的球蛋白产物，其中含有构象受限的、完全非天然的杂环骨架。作者认为他们的研究代表了第一个在环化位点旁边含有多种非α-氨基酸单体的多肽中进行无前导azol(in)e生物合成的例子，以及第一个含有翻译后安装的杂环的折叠蛋白。作者还通过计算揭示了这些杂环限制构象空间的程度；它们还在合成中消除了肽键——这两种特征都可以提高稳定性或增加接头序列的功能，这在新兴的生物治疗药物中很常见。作者认为这项工作提出了一种扩展蛋白质组的化学多样性的一般策略。本文作者：Cyao责任编辑：LDY原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscentsci.1c01577文章引用：DOI：10.1021/acscentsci.1c01577

《自然-方法学》：蛋白质结构分析新技术创测定速度纪录 　　过去需几年时间完成的工作现在仅用几天即可完成 　　据美国物理学家组织网7月20日报道，隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进程。 　　结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要。 　　为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进光源(ALS)。他们运用一种称为小角度X射线散射(SAXS)的技术，对处于自然状态下(如在溶液之中)的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米(1埃米等于1/10纳米)，足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。 　　为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白质样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究。他们还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了火球菌的40组蛋白质结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15%的信息量来说，这是十分巨大的进步。 　　高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。 　　但这种技术也有不足之处，追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。但这并不妨碍该技术的应用前景，因为并不是所有的研究都需要超高精度成像。对于结构基因组学研究来说，有时只要知道一种蛋白质与另一种蛋白质具有相似的结构，就可以了解其功能。而且，小角度X射线散射技术能够提供溶液中蛋白质形状、结构及构造变化等方面的精确信息，足以弥补其在成像精度方面的不足。 　　该研究成果刊登在7月20日《自然—方法学》杂志网络版上，美国斯克利普斯研究所和乔治亚州大学的科学家亦参与了该项研究。