蛋白质溶解定仪

[color=#444444]在用蛋白质进液相和凝胶色谱的时候是怎样让蛋白质溶解的啊？我看到用碱液可以让蛋白质溶解，那一般多少ph的碱液或者说多少浓度的碱液可以让蛋白质溶解呢，谢谢[/color]

请问一般在带皮的豆粕中检测出氢氧化钾蛋白质溶解度的值为140多是正常的吗?国家标准里是大于等于70%

一，蛋白质（包括酶）的提取　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。1、pH值　　蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。2、盐浓度　　稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法　　一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

最近在做一个蛋白质的纯化，实在是太难溶了。包涵体表达的，用8M尿素溶解都只能溶解到1-2mg/ml，去掉尿素用其它去污剂（Triton，Tween）就析出，实在太费劲了。又不能用SDS，这个实在太难去除了，因为它（SDS）会影响后续实验。等我把它真正溶解后再说说用的是什么溶剂配方。如果大家也有类似的经历，可以一起来分享分享。

（一）蛋白质的盐析 取1.5mL蛋白质溶液，加入等体积饱和硫酸铵溶液（浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合均匀后，静置数分钟，球蛋白即析出呈絮状沉淀（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵），用滤纸滤取上清液，滤液中再加入固体硫酸铵粉末至不再溶解，析出的即为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 （二）蛋白质的沉淀 1．用重金属盐沉淀蛋白质 取三支试管，各加1mL蛋白质溶液，分别各加3滴6%醋酸铅溶液、3滴2%硫酸铜溶液和3滴1%硝酸银溶液，观察蛋白质沉淀的析出。 2．用有机酸沉淀蛋白质 取二支试管，各加1mL蛋白质溶液，并加5%醋酸溶液使之呈酸性（该沉淀反应最好在弱酸中进行）。然后分别滴加饱和苦味酸、饱鞣酸溶液，直至沉淀产生为止。 用10%三氯醋酸溶液、3%磺柳酸溶液进行类似实验（用量同前），观察现象。

再传些上来[em09510][img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=183555]蛋白质.doc[/url]方法3这个方法（通常称为布拉德福德法）是基于当蛋白质与酸性蓝90燃料结合时在波长470nm-595nm之间有一个吸收峰。酸性蓝90燃料很容易与蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的残基结合导致对于不同蛋白质试验具有特异的反应。因此作为参考物的蛋白质必须测定的蛋白质相同。有相对较少的干扰物，但是最好避免试验样品中的洗涤剂和两性电解质。强碱性样品可能会干扰酸性试剂。使用标准蒸馏水来配置此方法中用到的缓冲液和试剂。试验溶液.将待测蛋白质的参考物质溶解在描述的缓冲溶液中配制成浓度在标准曲线范围内的溶液。参考溶液.用描述的缓冲溶液溶解待测蛋白质的参考物质。用相同的缓冲溶液来稀释这个蛋白质溶液制的不少于5个参考溶液，溶液的蛋白质浓度在一个合适的范围内均匀分布在0.1mg/ml和1mg/ml之间。空白.用使用的缓冲溶液来制备测试溶液和参考溶液。酸性蓝90试剂.溶解0.10g酸性蓝90标准试剂在50ml标准酒精溶液中。加入100ml磷酸标准溶液，用标准蒸馏水稀释至1000ml，混匀。过滤此溶液，室温条件下储存在棕色瓶中。储存期间，燃料发生缓慢的沉淀。使用前过滤试剂。步骤.每个测试溶液和空白的参比溶液取0.100ml，加5ml酸性蓝90试剂。倒转混匀。防止发泡，发泡会导致重复性较差。测定标准溶液和待测溶液595nm处的吸光度（2.5.25），把空白作为补偿液体。不要使用石英（二氧化硅）分光光度计比色皿，因为石英会和这些染料结合。计算.吸光度与蛋白质浓度的关系是非线性的；然而，假如，制备标准曲线的浓度范围足够小，后者将接近线性。以标准溶液的吸光度对蛋白质的浓度作图，再线性回归得到标准曲线。从标准曲线和待测溶液的吸光度来计算得到待测溶液的蛋白质浓度。方法4这个方法（通常被称为喹啉酸法或者BCA法）这个基于蛋白质与铜离子反应生成亚铜离子。喹啉酸试剂用于检测亚铜离子。很少物质会干扰这个反应。当存在干扰物质的影响时可以通过稀释来最小化干扰，但必须使得待测的蛋白质的浓度足够精确测量。或者，在方法2中给出的蛋白质凝结的的程序可能被用于去除干扰物质。因为不同的蛋白质种类可能给出不同的颜色反应强度，参考蛋白质和待测蛋白质必须相同。使用蒸馏水R来制备此法中用到的所有缓冲溶液和试剂。测试溶液.用描述的缓冲溶液溶解适宜数量的待测物质制得浓度在参考溶液浓度范围内的溶液。参考溶液.用描述的缓冲溶液溶解蛋白质的参考物质。用同一缓冲稀释部分该溶液制得不少于5个参考溶液，制的的溶液蛋白质浓度均匀分布在10μg/ml-1200μg/ml之间的合适的范围内。空白.使用缓冲溶液来制备测试溶液和参比溶液。BCA试剂.溶解10g的二钠试剂R，20g碳酸钠一水合物R，1.6g酒石酸钠R，4g氢氧化钠R，和9.5g碳酸氢钠R在蒸馏水（R）中。如果有必要，用氢氧化钠溶液R或者碳酸氢钠溶液R调节pH至11.25，用蒸馏水R稀释至1000ml，混匀。步骤.分别将0.1ml的参比溶液，待测溶液，和空白溶液与铜-BCA试剂混合。在37℃条件下反应30min，注意时间，允许混合物冷却至室温。在反应中点60min内，562nm处用石英比色杯测定参考物质和待测物质的吸光度（2.2.25），用空白溶液作为补偿溶液。待溶液冷却至室温后，颜色强度逐渐加深。计算.吸光度对蛋白质的浓度的关系不是线性的。然而，假如，制备标准曲线的浓度范围足够小，后者将接近线性。以参比溶液的吸光度对蛋白质的浓度作图，再线性回归得到标准曲线。从标准曲线和待测溶液的吸光度来计算得到待测溶液的蛋白质浓度。方法5这个方法（通过常称为缩二脲法）基于铜离子与蛋白质在碱性溶液中的反应而引起的545nm处的吸光度的变化。这个试验在IgG与白蛋白之间差异不大。氢氧化钠和缩二脲试剂的加入作为一个联合试剂，在氢氧化钠加入后不充分的混合，或者在氢氧化钠溶液的加入和缩二脲试剂的加入之间额外的时间将会使得IgG样品比白蛋白样品较高的反应。三氯酸原理用于减小干扰物质，也可以用于测定待测溶液中蛋白质的含量，在浓度小于500μg/ml的情况下。使用蒸馏水R来制备所有此试验中用到的缓冲溶液和试剂。待测溶液.用9g/l的氯化钠溶液R溶解适宜数量的待测物质制的浓度在参比溶液浓度范围内的溶液。参比溶液. 用9g/l的氯化钠溶液R溶解待测蛋白质的参比物质。用9g/l的氯化钠溶液R稀释部分此溶液制的不少于3个参比溶液，这一列溶液的蛋白质浓度均匀分布在0.5mg/ml-10mg/ml之间的适宜范围内。空白.使用9g/l的氯化钠溶液R。缩二脲试剂.用10ml的蒸馏水溶解3.46g的硫酸铜，冷却（溶液A）。用80ml的热蒸馏水溶解34.6g的柠檬酸钠R20.0g的无水碳酸钠R。冷却（溶液B）。混合溶液A和溶液B，用蒸馏水R稀释至200ml假如试剂发生浑浊或者包含任何沉淀，不要使用此试剂。步骤.在一个待测溶液中加入等体积的60g/l的氢氧化钠R，混合。立刻加入相当于0.4倍体积待测溶液的缩二脲试剂，迅速混匀。在15℃-25℃的条件下放置不少于15min。90min内加入缩二脲试剂，在最大吸收波长545nm处测定参比溶液和待测溶液的吸光度（2.2.25），用空白溶液作为补偿液体。在蛋白质浓度计算中，任何产生混浊或者沉淀的溶液都是不被接受的。计算.吸光度对蛋白质浓度的关系接近线性在参比溶液指定的蛋白质浓度范围内。以参比溶液的吸光度对蛋白质浓度作图，利用线性回归做标准曲线。计算标准曲线的相关系数，一个好的系统产生的标准曲线的相关系数不少于0.99.从标准曲线和待测溶液的吸光度来测定待测溶液中的蛋白质浓度。干扰物质.为了家少干扰物质的影响，蛋白质可以按以下步骤进行沉淀：加入0.1倍体积的500g/l三氯酸溶液R到1倍体积待测样品溶液中，取走上清液，用较小体积的0.5M的氢氧化钠溶解沉淀。用制得的溶液来制备待测溶液。方法6荧光法是基于o-邻苯二醛对蛋白质的化学衍生反应。它与蛋白质的伯胺基发生反应（N-末端氨基酸和θ-氨基的赖氨酸残基）此法的灵敏度可以通过在加o-邻苯二醛之前按水解蛋白质来增加。水解可以使组成氨基酸的α-氨基可以和邻苯二醛试剂反应。此法需要非常少量的蛋白质。伯胺，例如三（羟甲基）氨基甲烷和氨基酸缓冲溶液，与邻苯二醛反应的必须避免或者替换。高浓度的氨水与邻苯二醛反应。氨与邻苯二醛反应产生的荧光不稳定。自动化程序的使用来标准化这个程序可以增加测试的准确性和精密度。待测溶液.用9g/l氯化钠溶液R溶解适宜数量待测物质制的浓度在参比溶液浓度范围内的溶液。在加邻苯二醛试剂之前调节8-10.5。参比溶液.溶解蛋白质的参比溶液杂9g/l的氯化钠溶液R中。用9g/l氯化钠溶液R稀释部分此溶液制的不少于5个参比溶液，参比溶液蛋白质浓度均匀分布在10μg/ml和200μg/ml之间的适宜范围内。在加邻苯二醛试剂之前调节8-10.5。空白溶液. 用9g/l氯化钠溶液R。硼酸盐缓冲液.用蒸馏水R溶解61.83g的硼酸R，用氢氧化钾R调节pH10.4，用蒸馏水稀释至1000ml，混匀。邻苯二醛储备溶液.用1.5ml的甲醇溶解1.20g的邻苯二醛试剂R，加入100ml的硼酸缓冲溶液，混匀。加0.6ml300g/l 十二烷基醚聚乙二醇23溶液R，混匀。室温下储存，3星期内使用。邻苯二醛试剂.在5ml的邻苯二醛储存溶液中加入15μl的2-巯基乙醇R。至少在使用前30min内植被。24h内使用。步骤.将0.1ml的邻苯二醛试剂与10μl待测溶液和每个参比溶液混合，室温摁下放置15min。加入0.5M的氢氧化钠3ml混匀。在激发波长340nm和发射波长440和455nm处测得参比溶液和待测溶液的荧光强度（2.2.21）。因为照射荧光强度降低，对一个给定的样品的荧光强度只测定一次。计算.荧光强度与蛋白质浓度的关系是线性的。用参比溶液的荧光强度对蛋白质浓度作图，线性回归得到标准曲线，根据待测溶液的荧光强度得到待测溶液的浓度。

[size=3]选择材料及预处理 　　以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 　　微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 一，蛋白质（包括酶）的提取 　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。[/size]

有奖问答’对错题：二组分纤维混纺含量分析时，大豆蛋白复合纤维与其他纤维混纺产品的含量分析，用碱性次氯酸钠法溶解蛋白质纤维？（ ）

蛋白质组学研究的一般工具与方法随着人类基因组计划取得巨大的成功和许多物种基因组测序的完成，仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象是远远不够的，因此，研究重心已经开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上，生命科学已实质性地跨入了后基因组时代。 　　尽管现在已经有多个物种的基因组被测序，但这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组研究中所采用的策略，如微阵列法（microarray）（Wodicka et al., 1997）、基因芯片（gene chips）（Ramsay et al., 1998）、基因表达序列分析（SAGE）（Velculescu et al., 1995）等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的。但事实上，从DNA、mRNA到蛋白质存在三个层次的调控，mRNA自身也存在着贮存、转运和降解等问题，从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。蛋白质复杂的翻译后修饰，蛋白质的亚细胞定位或迁移，蛋白质-蛋白质相互作用则几乎无法从mRNA水平来判断（曾嵘，夏其昌，2002）。新生肽链合成后存在多种加工、修饰过程，蛋白质间也存在类似于mRNA分子内的剪切、拼接，研究证明基本元件“intein”广泛存在于蛋白质中（Perler et al., 1997）。基因与其编码产物蛋白的线性对应关系只存在于新生肽链而不是最终的功能蛋白质中。 　　蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制；蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究（钱小红，贺福初，2003）。 　　 　　蛋白质组学研究中常用的技术体系 　　方法学上，二维凝胶电泳－质谱仍然是目前最流行和可靠的技术平台（Rabilloud et al., 2000）。其一般过程是：细胞或组织样品——样品制备——二维凝胶电泳（2D－PAGE）分离蛋白质——计算机辅助分析2D－PAGE图象——对感兴趣的蛋白质进行酶解——质谱分析——数据库检索——蛋白质鉴定——分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。 　　2-D PAGE 　　样品制备 　　2D－PAGE 的操作流程基本上实现了程序化。但是，样品制备是一个非常关键与复杂的过程。成功的2D－PAGE取决于对样品中蛋白质有效的抽提和它的溶解性。与核酸不同，目前没有一种通用的方法适用于所有的蛋白质，来源不同的蛋白质都受到自身蛋白质制备方法的挑战。 　　正确的样品制备方法从收集样品开始时就要防止样品的裂解和被蛋白水解酶降解（Rabilloud et al., 2000）。要尽可能溶解更多的蛋白，并且在2D－PAGE过程中保持它的溶解性，阻止蛋白质的人为修饰。在样品制备过程中，各个实验室也通过实验建立了更为可行的方法。目前通过建立分步提取方法可以有效地提取出更多的蛋白质（兰彦等，2001）。另一种对蛋白质采用预分离的方法称为“多间隔电解法(multi-compartment-electrolyser)”，采用这种方法后，分辨率和胶的质量均明显改善（Herbert et al., 2000）。 　　但是，由于生物样品的多样性和复杂性，目前所采用的样品制备方法具有局限性。其它物质对蛋白质样品制备存在干扰。核酸通过与蛋白质结合，增加样品黏度而干扰等点聚焦（IEF）分离的效果。当然，通过实验探索，采取一些措施可以减轻它的干扰。例如，在样品制备过程中加入非特异性的核酸酶或RNase与DNase的混合物，在等电聚焦时将每个胶条的电流限制在50mA以内通常可以消除其影响。脂类物质的影响可以通过利用有机溶剂的方法将其去除，但是这常常会导致蛋白质的不可逆沉淀。除了蛋白质的降解之外，糖基化是蛋白质的最重要的人工修饰，样品中的尿素在这一过程中起着非常重要的作用。样品中的尿素在降解的过程中会形成能够与蛋白质的氨基反应的氰酸盐，这种结果会导致蛋白质带有更多的正电荷。所以，在2D－PAGE中要用新鲜的尿素溶液，在等电聚焦过程中要控制温度不能太高（Beranova-Giorgianni, 2003）。但是，目前还没有一种简单有效的方法来去除样品中的多糖。 　　样品分离和分析 　　样品制备完成后运用IEF和SDS-PAGE电泳对它进行分离，常采用银染和考马斯亮兰染色即可观察到具有许多蛋白质斑点的凝胶图像。等电聚焦电泳与SDS-PAGE的具体操作步骤已经实现了程序化，均有详细操作流程参考，但是由于样品的不同，不同样品的具体条件还需要试验探索。第二相SDS-PAGE运行结束，染色完毕后，利用计算机软件对凝胶图像进行分析，如PD-QUEST软件，LIPS，HERMES，GEMINI等，对凝胶图像上的蛋白质斑点进行匹配，对图像进行数字化处理等分析（贾宇峰等，2001），对感兴趣的蛋白质采用质谱分析。 　　低丰度蛋白质的检测 　　低丰度蛋白在蛋白质组学研究中常常是人们非常感兴趣的，因为细胞或组织中的一些生物活性物质，如细胞分泌的一些活性物质，受体等表达量都非常低。按照一般电泳的上样量，这些小分子是根本看不到的，但如果单纯地增加上样量，细胞或组织中的大量表达的蛋白就会将其覆盖，而且上样量过大也会影响电泳结果。所以对这些低丰度的样品可以进行富集，富集的方法可以通过层析，如亲和层析，离子交换层析等方法，还可以通过利用样品等电点性质等方法将pH范围相近的蛋白质富集（Santoni et al., 2000; Beranova-Giorgianni, 2003）。

[font=宋体][font=宋体]蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。[/font] [font=宋体]一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白纯化[/b][/url]要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化主要的方法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]） 根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤（一种柱层析）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]） 利用溶解度差别分离：等电点沉淀法（由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小）；盐溶与盐析（利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]） 根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]） 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]） 根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]　低温有机溶剂沉淀法[/font][font=Calibri]: [/font][font=宋体]用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化注意事项：[/font][font=宋体]在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，有一些通用的注意事项需要牢记，它们包括：[/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、不要太稀，蛋白浓度维持在μ[/font][font=Calibri]g/mL[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]mg/mL[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、合适的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]避免与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相同，防止蛋白质的沉淀。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]酶，降解[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，防止[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]对蛋白的污染。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、在缓冲溶液中加入[/font][font=Calibri]0.1~1mmol/LDTT[/font][font=宋体]（二硫苏糖醇）[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或β[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、加[/font][font=Calibri]1~10mmol/LEDTA[/font][font=宋体]金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、使用灭菌溶液，防止微生物生长。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注义翘神州重组蛋白纯化详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font]

以猕猴桃籽粕为研究对象,根据溶解性的不同,从中分离出了水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白及碱溶性蛋白,并对各蛋白组分抗氧化活性进行了研究。结果表明:猕猴桃籽中主要蛋白为水溶性蛋白和碱溶性蛋白,分别占其总蛋白质的 32.06%和 32.26%,其次是醇溶性蛋白和盐溶性蛋白,分别占总蛋白质的 1.45%和 1.04%。4 种不同溶解性的猕猴桃籽蛋白均具有一定的体外抗氧化作用,各蛋白质组分的总抗氧化能力呈现较好的量效关系:4 种蛋白抗氧化活性由强到弱的顺序依次为醇溶性蛋白﹥水溶蛋白、盐溶性蛋白﹥碱溶性蛋白 在 0.02~1mg/mL 范围内,除醇溶蛋白外,其余 3 种蛋白对 DPPH 自由基的清除能力均呈现良好的量效关系,且水溶性蛋白﹥盐溶性蛋白﹥碱溶性蛋白。因此,猕猴桃籽蛋白质可作为一种潜在的天然抗氧剂进行深入研究。

请问肉制品在加工过程中蛋白质降解指数一定不断增大吗？比如腊肉和火腿。非蛋白氮含量先降后增，总氮含量持续增大，最终结果是蛋白质降解指数先降低后增大，这样可以吗？看文献里有解释是水分含量降低使得总氮在肉制品中的占比增大。

一、样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：1. 减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。2. 空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋 内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3. 冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液 用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。4. 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。5. 超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵 压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1381571714_small.jpg 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。二、干燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。三、贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

请问一下：）为什么核磁中蛋白质溶液的配制中不是完全用重水，而是20%-30%的重水和水呢？ 这样对水峰压制的要求不就提高了吗？ 是不是重水粘度相对大不利于蛋白质的溶解啊！ 还有对于一个分子量为4万多的糖蛋白而言，碳谱中at和d1的设置怎么样会比较合理? 谢谢

如题，我想用C8的色谱柱跑液相色谱看一下发酵液中的蛋白质变化，但是发酵液里面较复杂，如何前处理纯化蛋白质，来达到能够上机的要求？ 如果用三氯乙酸或有机相使蛋白质变性沉淀，弃去上清，还能否将沉淀溶解？我看到这类方法多用在电泳上面，那液相色谱该用上面方法呢？期待高手指点~

纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。浓缩、干燥及保存一、样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：1. 减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。2. 空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3. 冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。4. 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。5. 超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。二、干燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。三、贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。1. 样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。2. 一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。3. 贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法 　　亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。细胞的破碎1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS

蛋白质折叠病 ▲许多疾病，如阿兹海默症(Alzheimer's)，疯牛病(Mad Cow, BSE)，可传播性海绵状脑病(CJD)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，还有帕金森氏症(Parkinson's)等正是由于一些细胞内的重要蛋白发生突变，导致蛋白质聚沉或错误折叠而造成的。因此，深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。 ▲基因组序列的发展使我们得到了大量的蛋白质序列，结构信息的获得对于揭示它们的生物学功能是十分重要的。依靠现有手段（X-ray晶体衍射、NMR及电镜）测定蛋白质的结构需要较长的时间，因此结构解析的步伐已落后于发现新蛋白的步伐。而结构预测的方法虽然速度较快，但可靠性并不高，只有当我们对于维持蛋白质结构，驱动蛋白质折叠的理化因素更为了解，这一方法才可能有根本的改进。另外，我们对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系的研究也有赖于蛋白质折叠机制的阐明。【蛋白质折叠与“折叠病” 】 人们对由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况已有所了解，即所谓“分子病”，如地中海镰刀状红血球贫血症就是因为血红蛋白分子中第六位的谷氨酸突变成了颉氨酸。现在则发现蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病，那就是所谓“构象病”，或称“折叠病”。 大家都知道的疯牛病，它是由一种称为Prion的蛋白质的感染引起的，这种蛋白质也可以感染人而引起神经系统疾病。在正常机体中，Prion是正常神经活动所需要的蛋白质，而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同，只是空间结构不同。这一疾病的研究涉及到许多生物学的基本问题。一级结构完全相同的蛋白质为什么会有不同的空间结构，这与Anfinsen原理是否矛盾？显然这里有蛋白质的能量和稳定性问题。 从来认为蛋白结构的变化来自于序列的变化，而序列的变化来自于基因的变化，生命信息从核酸传递到蛋白。而致病Prion的信息已被诺贝尔奖获得者普鲁辛纳证明不是来自基因的变化，致病蛋白Prion导致正常蛋白Prion转变为致病的折叠状态是通过蛋白分子间的作用而感染！这种相互作用的本质和机制是什么？仅仅改变了折叠状态的分子又如何导致严重的疾病？这些问题都不能用传统的概念给予满意的解释，因此在科学界引起激烈的争论，有关研究的强度和竞争性也随之大大增强。 由于蛋白质折叠异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位所引起的疾病还有老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤等等。由于分子伴侣在蛋白质折叠中至关重要的作用，分子伴侣本身的突变显然会引起蛋白质折叠异常而引起折叠病。随着蛋白质折叠研究的深入，人们会发现更多疾病的真正病因和更针对性的治疗方法，设计更有效的药物。现在发现有些小分子可以穿越细胞作为配体与突变蛋白结合，从而使原已失去作战能力的突变蛋白逃逸“蛋白质质量控制系统”而“带伤作战”。这种小分子被称为“药物分子伴侣”，有希望成为治疗“折叠病”的新药。 新生肽的折叠问题或蛋白质折叠问题不仅具有重大的科学意义，除了上面提到的在医学上的应用价值外，在生物工程上具有极大的应用价值。基因工程和蛋白工程已经逐渐发展成为产值以数十亿美元计的大产业，进入21世纪后，还将会有更大的发展。但是当前经常遇到的困难，是在简单的微生物细胞内引入异体DNA后所合成的多肽链往往不能正确折叠成为有生物活性的蛋白质而形成不溶解的包含体或被降解。这一“瓶颈”问题的彻底解决有待于对新生肽链折叠更多的认识。

蛋白质与多肽蛋白质粉 人类的营养物质有许多种类，最为重要的为蛋白质，碳水化合物和脂肪，其它则是微量营养物质，如维生素、电解质和微量元素等。虽然每一种营养物质对人体来说都是不可或缺的，但绝大多数的营养学家都会有充分的理由认为，真正最重要的营养物质是蛋白质。一、蛋白质是构成人体的基本物质。 蛋白质是由氨基酸通过肽链相连而构成的，它是人体包括骨骼、肌肉、皮肤和脑的重要物质基础，同时氨基酸也是生成核酸的基本物质。我们知道，核酸既形成遗传密码，也是体内储存能量的基本物质。因而从根本上说，人体是由蛋白质组成的。构成人体蛋白质的生理功能概括有如下三个方面：1）人体组织的主要构成成份：如肌肉、骨骼、血液、皮肤、神经、肝、心等等。2）具有特殊生理功能：可以这样说，人类的一切生理活动都与蛋白质有关。如酶蛋白能催化机体的一切化学反应，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物的消化等；载脂蛋白运送脂肪；血红蛋白运送氧；激素蛋白调节代谢与生理活动包括情感；血浆白蛋白调节渗透压、运输金属离子、胆红素和抗生素等。3）供给机体能量：成年人每日约需要更新400g蛋白质，每克蛋白质彻底分解能释放出约4 Kcal的热量。4）为机体提供氮原料：人体内所必需的嘧啶、嘌呤、肌酸、胆碱、肾上腺素、肉碱、牛磺酸等，都是以多肽、氨基酸为原料的。表1. 世界粮食组织（FAD）和世界卫生组织（WHO）根据中国人的体质和膳食结构推荐的中国人蛋白质的摄入量（RNLs）。年 龄蛋白质RNL（g/d） 初生—6个月 1.5-3 1岁 35 3岁 45 5岁 55 7岁 60 9岁 65 10-16岁 75-85 成年女性 65 成年男性 75 妊娠 +15 乳母 +20 根据统计资料：由于贫困、工作紧张、精神压力、减肥节食、以及肠胃疾病、癌症、贫血、肾病、各种结核病、肝硬化、腹水、烧伤、失血等，以及老龄人均不同程度地存在着蛋白质的摄入不足。 上世纪80年代以来，我国营养学家对7个省18个贫困地区，1万名学龄前儿童进行了为期4年的连续调查，发现营养不良现象非常严重，其中蛋白质的摄入量不足WHO规定的60%。近年社会医学工作调查，在发达地区由于生活节奏加快，精神压力异常增加，以及办公室白领阶层的减肥节食，也导致蛋白质摄入不足，代谢异常的人群增加。二、蛋白质缺乏的体征和临床症状 单纯的蛋白质营养不良又叫加西长病，这或许是来源于非洲的单词，单纯的能量不足时叫消瘦；临床上通常把这两种现象叫单纯性蛋白质能量营养不良症或PEM。单纯的PEM症在临床上较少见到，但在慢性消耗性疾病患者中则常见，尤其是在癌症患者和艾滋病的患者中几乎占到90%以上。 现代都市和贫困地区存在着相当数量的蛋白质营养不良族群，他们的临床表现主要是能量损失或不足，如体力不支、睡眠不安、怕冷、怕热、性冷淡、无法进行正常的体力劳动和运动，其次为肌肉组织萎缩、皮肤松驰；腿部、脸部易水肿、脂肪肝、无名皮疹、伤口愈合不良、记忆力下降、视力减弱等。再者免疫力低下易感冒、感染。在做血检时通常会发现这些族群的血浆蛋白处于正常值的下限，其中白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合前体蛋白和视轴蛋白（retinol-binding protein）均处于低水平时，患者易于感染各种疾病并且出现早衰症状，如果是儿童则感染后死亡率增加30%-40%，对于这类人群WHO的专家最好的建议就是迅速补充优质（或全价）的蛋白质。三、优质蛋白质和劣质蛋白质的区别。 要弄清楚何为优质蛋白质？何为劣质蛋白质？我们要引入什么是必需氨基酸的概念。营养生理学家、生化学家发现构成人体蛋白质的氨基酸共有21种，而这些氨基酸中其中有4种是可以由体内含碳和含氮底物自己合成的，被称为非必需氨基酸，还有10个必需的氨基酸，是人类机体无法制造需要从饮食中摄取的，另有7个是介于这两者之间的被称为条件必需氨基酸。表2. 必需、条件必需和非必需氨基酸 必需氨基酸条件必需氨基酸 非必需氨基酸 亮氨酸牛黄酸 丙氨酸 异亮氨酸酪氨酸 谷氨酸 缬氨酸甘氨酸 天冬氨酸 赖氨酸丝氨酸 天冬酰胺 苯丙氨酸（酪氨酸）脯氨酸 蛋氨酸（半胱氨酸）谷氨酰酸 苏氨酸 胱氨酸 色氨酸 组氨酸 精氨酸 虽然蛋白质广泛存在于许多动物性和植物性食物中，但是必需氨基酸的构成异差很大，WHO把“蛋白质其组成恰好符合人体需要”的蛋白质称为理想蛋白质，在自然界这种理想的蛋白质普遍认为是鸡蛋蛋白，因此就把鸡蛋蛋白作为衡量蛋白质优劣的参照蛋白，科学家把它作为一把尺子来衡量各种蛋白质，并制定出标准，以4种必需氨基酸为最低限来决定其优劣，即色氨酸、苏氨酸、赖氨酸或者蛋氨酸（半胱氨酸）。 通过比较科学发现，肉、鱼、蛋、牛奶、乳酪含有优质蛋白，大豆、花生、豌豆也含有较多的高质量蛋白。进一步研究发现它们都不够完美，因而要求大家对优质的动物性蛋白和植物性蛋白进行了科学搭配才是最完美的全价蛋白质（complete protein）。表3. 部分高质量蛋白

公司有部分产品是冻干品，主要成分是蛋白质。想用库伦滴定法测冻干品的水分，用的仪器是卡尔费休水分测定仪。之前是用甲醇溶解的，发现有点溶解不完全，不知道哪位高手有没有类似经历，用的是什么试剂复溶冻干品比较好呢？尽可能不要破坏蛋白质

我用凯氏定氮法来做的，检测螺旋藻。取0.2-2克的螺旋藻和0.2克硫酸铜，6克硫酸钾，20ml硫酸消化，泡沫消失后直接变成了碳状物质，根本就不会出现蓝绿色透明液体，我都是直接用蒸馏水溶解后过滤的。不知道怎么回事？还有蒸馏后滴定时，颜色还是指示剂的蓝色（用的是甲基红和亚甲基蓝2：1来配置的），看不见滴定终点，不知道哪出了问题？？？？郁闷的很。我以前都没有做过蛋白质这个实验，很多地方不懂，大家指点下。谢谢了

我用凯氏定氮法来做的，检测螺旋藻。取0.2-2克的螺旋藻和0.2克硫酸铜，6克硫酸钾，20ml硫酸消化，泡沫消失后直接变成了碳状物质，根本就不会出现蓝绿色透明液体，我都是直接用蒸馏水溶解后过滤的。不知道怎么回事？还有蒸馏后滴定时，颜色还是指示剂的蓝色（用的是甲基红和亚甲基蓝2：1来配置的），看不见滴定终点，不知道哪出了问题？？？？郁闷的很。我以前都没有做过蛋白质这个实验，很多地方不懂，大家指点下。谢谢了

我将需要浓缩的蛋白质溶液在-20℃下冷冻20h后在室温下冷却，结果蛋白质形成絮状析出，而且析出的蛋白质能用砂芯过滤器过滤得到比较干的滤饼。这样等到的蛋白质变性了吗？低温可使蛋白质浓缩凝胶析出，这样的蛋白质与之前没处理的蛋白质溶液相比变性了吗？

蛋白质纯化及复性 重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）高效表达时，往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体，即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0mol/L盐酸胍、8.0mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。 目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是：（1）复性效率低。传统的复性方法稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍，甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5~20%，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化。（2）工艺路线烦琐，生产周期长。在传统的重组蛋白质分离纯化工艺中，大多采用经典的软凝胶分离介质，由于这种介质的颗粒较大，分离效率较差，因此常常需要采用多种不同模式的色谱操作联用对目标蛋白质进行纯化，才能得到纯度符合一定标准的目标蛋白质。另外，这种色谱介质的耐压性很差，只能在流速较低的情况下进行操作，分离纯化时间较长。分离纯化步骤多和分离时间长使得蛋白质的质量回收率和活性回收率很低。而且在传统的重组蛋白质生产工艺中，蛋白质的复性和纯化是生产过程中两个独立的单元操作，也在很大程度上制约着生产效率。（3）生产成本高，设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高。随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。 1991年耿信笃教授首先将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性，很好的解决了上述问题，现已成功用于重组人干扰素-g(rhIFN-g)、重组人干扰素-a(rhIFN-a)、人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人胰岛素原(proinsulin)、重组牛朊病毒(prion)等重组蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等标准模型蛋白的复性与同时纯化中。目前，排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也已用于蛋白质的复性和同时纯化中。与传统的稀释法及透析法比较，用色谱法进行蛋白复性的优点是：①在进样后可很快除去变性剂；②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附，可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生，从而提高蛋白质复性的质量和活性回收率；③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；④便于回收变性剂，以降低废水处理成本。简言之，色谱法复性可以提高蛋白质的活性和质量回收率，将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成，缩短了操作步骤和生产时间，减少了设备投资，使生产成本大大降低，已经引起了全世界范围内许多生化研究者和重组蛋白药物生产厂家的关注。由于高效液相色谱（HPLC）分离效率高，往往在一步操作中便可得到纯度符合要求的蛋白质，而且分离速度快，在应用方面具有更大的优势。

请教：双缩脲反应测定蛋白质含量时，绘制标准曲线时需要标准蛋白溶液，标准蛋白溶液要用什么蛋白质？我见有用酪蛋白的，可以用胶原蛋白吗？谢谢……

工厂生产时,怀疑盐酸溶液中有蛋白质,我应该怎么判定和测定呢?

一、植物组织蛋白质提取方法（summer）1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法 (summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜 （newinbio）目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000 g，10min，4度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次沉淀中加入100％乙醇 2ml充分振荡混匀，置室温20 min离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。四、lysis solution:（yog）Protein extraction buffer (Camiolo buffer):100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g(0.3M) NaCl 1.753g(0.1M) L-arginine basic salt 1.742g(0.01M) EDTA-HCl 0.292g(0.25%) Triton X-100 250. ulup to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then 0.2 um filter.1. Freeze tissue in liquid nitrogen.2. Rinse in PBS then mince.3. Add 1 ml Camiolo extraction buffer per 100 mg of tissue.4. Homogenize for 1 minute at 4\'C.5. Spin at 3,000. rpm/15 minutes/4\'C.6. Remove supernatant and save in another tube.7. If necessary, dialize the supernatant against PBS with50mM/L Tris-HCl pH 7.4.五、植物材料：水稻苗，叶鞘，根（ynibcas）1、200 毫克样品置于冰上磨碎2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min 取上清3、重复离心5minlysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

[align=center]蛋白质热稳定性的研究机理[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]食品事业部:魏娜[/align] 疏水作用被认为是决定蛋白质结构的主要作用力。蛋白质的天然结构是由以下类型的共同作用力维持其结构的热稳定性（例如，H键，离子键和范德华力）。德国专家Dil回顾了支持这一理论的证据：（一）非极性溶剂使蛋白质变性 （二）疏水残基可以很典型的把核心部位分开，在其核心部位他们在很大程度上避免了与接触水 （三）在蛋白质核心部位的残基和疏水基团比任何其他一种残基具有更坚固的保守区和结构（核心部位疏水残基的取代物一般比任何一种代替物更具有破坏性）。（四）蛋白质展开涉及大量增加的热容量。给定的疏水作用的中心对在蛋白质折叠也有一定的影响，很容易以为疏水作用还是负责蛋白稳定性的主要动力。在过去20年里，序列、结构和诱变等信息的积累证实了疏水作用，事实上，更是蛋白质稳定性的主要动力。两个观察报告指出常温的和极端嗜热的微生物的同源体具有相同的最基本的稳定性，这种稳定性由保守的蛋白质核心提供：（1）疏水相互作用以及中心残基所影响的二级结构比特征区域表面更保守。（2）在有溶解能力的被暴露的区域发现了大量稳定的代替物（可以在常温及极端嗜热蛋白质结构的比较以及在蛋白质定向突变的实验中观察到）。常温以及嗜热蛋白质同源体的核心具有高度的相似性，这些性质表明常温蛋白质尽可能高效的与那些在核心外部的没有太多空间稳定性的蛋白质进行折叠。极端嗜热蛋白质稳定的相互作用经常在蛋白质的不保守区被发现。如下所示，如表面离子对减少了溶剂暴露疏水面，和与之稳定结合（即N和C末端以及氨基酸循环）的蛋白质表面似乎有助于极端嗜热蛋白质的热稳定性。 在近年来足够的实验证据（如序列，诱变，结构，和热力学）被积累，但没有一个单一的机理可以解释极端嗜热蛋白质的显著的稳定性。增加的热稳定性可以在数量很少的精确突变中找到，这样的突变常常不遵循任何一种固定的法则。[b] 氨基酸组成和内在倾向[/b]蛋白质的氨基酸组成长期以来被认为与其热稳定性有关。第一个数据分析对比了常温和极端嗜热蛋白质的氨基酸组成，发现趋向于Gly→Ala，Lys→Arg的替换，嗜温蛋白质的组成中含有大量Ala,主要是由于Ala最易于螺旋结构的形成。随着更多实验数据的积累（尤其是，全基因组序列的测序 ），通常的嗜热适应规则不能依据显著性差异来定义蛋白质中氨基酸的组成已经变得越来越明显了。通过对8个常温和7个极端嗜热微生物的基因组序列的对比得出常温和极端嗜热蛋白质的残基存在这种趋势的差异（如表4所示）。另外发现，极端嗜热蛋白质比常温蛋白质带有更多的带电残基（多3.24%），以及较少的极性未荷电残基（-4.98％ 特别是谷氨酰胺，-2.21％）。嗜热蛋白质比常温蛋白质还含有更多的疏水残基和芳香残基。从基因组测序中获得的这些数据不能普遍化，在极端嗜热的微生物基因组中自身存在着很多的突变。敏捷气热菌实际上比在表4中列出的嗜温菌含有有更少的带电残基（23.64％），更少的大体积的疏水残基（27.29％），以及更少的芳香性残基（7.42％）。相反，敏捷气热菌含有较多的Ala，Gly，Pro，Ser，和Thr残基。因此，极端嗜热蛋白质的氨基酸组成可能经常和突变性有关，而不是与其适应高温的指标有关。蛋白质中氨基酸残基的分布与其相互作用比氨基酸残基的组成对蛋白质的热稳定性更相关。这两种同源蛋白酶解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN9和普通高温放线菌嗜热蛋白酶包含数量相同的带电残基，但嗜常温酶的嗜热蛋白酶包含比八个更多的离子对。有关的想法，蛋白质的稳定性取决于稳定的紧密包裹的疏水内核，个别残基的固有倾向是参与螺旋或链结构，这作为一个潜在的稳定机制被研究。比较嗜温和嗜热蛋白结构，Facchiano等人观察到嗜热蛋白质的螺旋结构通常比的嗜温蛋白质更稳定。他们检测到的唯一的趋势是在嗜热蛋白质的螺旋（二支链残基没有得到很好的耐受性螺旋线性残留有）中C[sub]β[/sub]分支残基的减少（Val，Ile，和Thr）。许多实例存在于未遵循这一趋势。该P.球菌和T. litoralisGDHs包含更多数量的Ile。如果将Leu和Ile残基进行比较，这两个残基具有最高的（和等同的）部分特定卷。在蛋白质中，Leu侧链最常发现两种旋转异构体的构象（180°和300°×1），但不是在一个与X1 =60°。在Ile侧链频繁采用四种不同的旋转异构体的构象，以及三个X1值被发现。随着这种构象的柔性，Ile可能能够更好地填补在蛋白质内核折叠时出现的空缺。Dil还指出，环境的影响（例如，盐桥的形成，芳烃相互作用，疏水表面的包埋，以及填充膜腔）可以作为重要内在的螺旋倾向。在许多情况下，二级结构在蛋白质结构不对应于所找到的二级结构预测的内在倾向，表明该固有倾向不足以解释蛋白质中α-螺旋的稳定性。Arg残基的几个特性表明，他们将比Lys残基更好地适应高温：该Argδ-胍基部分由于其高的pKa和共振稳定而降低的化学反应活性。δ-胍基部分比Lys氨基为带电的相互作用提供了更多的表面积。Arg参与多种非共价相互作用的能力。因为在Arg侧链比Lys少一个亚甲基，它具有开发较少不利触点的电位与溶剂。最后，因为它的pKa值（约12）是Lys的1倍以上（11.1），在温度升高的时候，精氨酸更容易保持离子对和净正电荷（因为温度的增加，pKa值下降）（252，354）。在嗜温菌的蛋白质池和在表中列出超嗜4（0.73+ - 0.37和0.87+ - 0.60，分别）平均精氨酸/赖氨酸的比率与大标准偏差相关。（其中超嗜热，精氨酸/赖氨酸的比率范围从Aquifex0.52超嗜热菌蛋白到2.19敏捷气热菌。）这些结果表明，如果增加精氨酸确实会变得稳定，这种机制是不能够普遍使用于极端嗜热菌中。[b] 二硫键 [/b]二硫键被认为主要是通过降低蛋白质裂解状态的熵维持蛋白质的稳定。当两个半胱氨酸键断裂时，二硫键的熵效应成比例地以对数方式增加残基的数量。 因为在高温下，半胱氨酸和二硫键的敏感性遭到破坏，，100℃被认为是蛋白质维持二硫键稳定性的上限。这一概念是基于这样一个事实，早期的研究描述蛋白质活性的研究机理，在那个时期仅形成了一种可利用的酶：常温酶。这些研究确定了所有蛋白质研究，研究包括的二硫键在100℃时β-消除有相同的速率。这个速率不依赖于蛋白质的结构并且在pH=8.0（半衰为1小时）比在pH =6.0（半衰期为12.4小时）时速度快。这些研究的限制是在100℃时所有蛋白质是在展开状态时进行研究的。在最近包括二硫键的蛋白质的描述中，在100℃时这些蛋白质具有最大的活性和稳定性，表明在100℃时二硫键维持了这些蛋白质的稳定性并且构象环境和溶剂可被决定因素保护，防止破坏二硫键。当描述大肠杆菌时，S.solfataricus 5’-甲硫腺苷磷酸化酶形成了不正确，不稳定的二硫键。这一观察间接反映了，二硫键在天然酶中表现出的稳定性。嗜火液丝氨酸蛋白酶被描述为包含8半胱氨酸（无存在于枯草杆菌蛋白酶BPN'）。处理二硫苏糖醇从半衰期为90 小时 85℃，减少到少于2小时。在高温下二硫苏糖醇不稳定进一步表明这种酶的确含有二硫键并且它们是高度不稳定的。这种酶在半衰期为6小时 温度为105℃ pH=9.0时，要比它在蛋白质展开中pH=8.0 半衰期为1小时二硫键计算的长，表明这种酶的二硫键通过蛋白质中二硫键的无法靠近以保护二硫键不被破坏。因此，不是所有的二硫键对热稳定破坏具有相同的易感性。[align=center][b]疏水作用[/b][/align] 在极端嗜热蛋白质中，疏水作用是蛋白质热稳定性的一个机理。平均增加1.3千卡/摩尔（±0.5）的稳定性对于增加甲基埋在蛋白质折叠（取决于腔产生突变，这种突变中，大的脂族残基被替换为一个较小的脂族残基）。当突变产生了往往需要局部重排的不利的范德华力作用时，突变试图填充凹处往往是更不稳定的。疏水性相互作用在蛋白质结晶中的热稳定作用的，实验证据是可用于确认所述极端嗜热蛋白质中疏水作用的区域。存在于沃氏甲烷球菌和M.jannaschiladenylate激酶中的这种酶嵌合体的结构的稳定部分表明，更大和更具极端嗜热酶疏水酶核心（这是由于增加的脂肪族残基含量和脂族侧链体积）可能是负责分枝詹氏甲烷球菌的腺苷酸激酶的热稳定性。该从嗜热栖热菌3-异丙基苹果酸脱氢酶热包含亚基间的疏水相互作用的没有在大肠杆菌中酶存在。嗜三异丙基脱氢酶Leu246Glu/ Val249Met和大肠杆菌Glu256Leu/Met259Val突变衍生物构建了动摇并稳定在栖热和大肠杆菌酶，分别的突变体和野生型的聚丙烯酰胺凝胶电泳在尿素的存在下酶表明，疏水性相互作用使二聚体解离更有抵抗力。[b]氢键[/b]由于氢键的作用使得核糖核酸酶T1趋于稳定。核糖核酸酶T1平均长度86 H键。他们的核糖核酸酶T1稳定（约贡献110千卡/摩尔，如通过诱变和展开实验确定），H键贡献（307）1.3千卡/摩尔能力。因为识别H键的高度依赖于距离截止和因为一批超嗜热蛋白质结构没有被细化到足够高的分辨率，通过结构研究的热稳定性H键的作用分析没有提供明确的答案。一项研究由唐纳等人完成的。H键使得蛋白质的热力学稳定：（i）关联的去溶剂化罚与掩埋诸如H键小于去溶剂化罚掩埋离子对的（即包括两个电荷的残基），和（ii）一个充电中立H键的焓奖励是大于由于中性中性H键的电荷 - 偶极相互作用。chargedneutral之间的这种相关性H键和GAPDH稳定性表明的作用在稳定蛋白质电荷的残基可以不限于形成离子对。带电中性h的人数增加债券还发现了T. maritima的铁氧还蛋白（表5）。这些H键或者稳定转弯或锚的结构变为另一个。[b]离子对[/b]因为离子对通常存在于在少量蛋白质和因为它们不是高度保守的，它们是不驱动在蛋白质折叠的力。去溶剂化作用8筒体螺旋A8和A1）还通过测试SDM。在85.5°C，突变Arg241Ala增加酶变性率几乎3.酶的EA的一个因素展开在85℃下降3.2千焦耳/摩尔，这表明Arg241-Glu73对参与的动力学稳定这种酶。在P.球菌确定的离子对网络，P. kodakaraensis，和T. litoralis的GDH的结构进行了研究由SDM。这三种酶是83至87％相同，但它们的thermostabilities减小的方向P.球菌GDH。P. kodakaraensis GDH。T. litoralis的GDH。它们都含有相同的18离子对网络在它们的六聚体界面。突变Glu158Gln，其中去掉2离子对的该网络的中心，显著不稳定P. kodakaraensisGDH的。一个离子，包括六对网络被控残留物只存在于P.球菌GDH。相同的离子对网络在P.kodakaraensis GDH和T. litoralis的创建GDH由SDM。这两种酶是由新稳定的介绍离子对网络（280，348）。这些研究证实离子对网络在巴斯德球菌，P的作用kodakaraensis和T. litoralis的GDH thermostabilities。 Lebbink等。 （203）介绍了16个残基的离子对网络的在T. maritima的GDH亚基界面来创建一个界面类似于在体育球菌的GDH在18离子对网络。该三不稳定的突变组合产生了三重突变酶（Ser128Arg-Thr158Glu-Asn117Arg），这是稍微更稳定和嗜热比野生型酶。这个结果示出合作的高级别存在这种离子对网络的不同成员之间。该结果还支持18个残基的离子对的作用网络中的P.球菌GDH稳定。在早先的研究中，Tomschy等。（337）已拆除2位于两个α-螺旋在T. maritima的表面上的离子对GAPDH。由于这些突变不影响所述酶稳定性，作者得出结论认为，表面离子对不能被认为是热适应的总体战略。选择在本研究Bothion对分别螺旋内的离子对。这些2双可能已经位于蛋白质领域的人过约束，而不是蛋白质的地区之一最容易展开。与此相反，在其它实施例上述说明的热稳定效果非本地离子对和离子对网络，连接不相邻的残基（和二级结构）的序列中。离子配对中的作用的附加的，间接的证据热稳定性是来自基因组测序。与嗜热蛋白质带电残基相比，常温蛋白，主要是在不带电荷的极性为代价残留物。[b]脯氨酸及脯氨酸展开过程中的熵的减少[/b]Matthews等人提出已知的蛋白质三维结构可以通过展开时他们的熵的减少维持稳定。在展开状态下，甘氨酸是带有最高构象熵的残基，没有C[sub]β[/sub]。脯氨酸，可以采用只有几个配置并限制允许前述残余物的配置（313），具有最低的构象熵。因此，该突变Gly3Xaa或Xaa3Pro应该减少熵及的蛋白质的展开状态稳定的蛋白质，只要作为改造的残留不引入不利菌株中的蛋白质的结构。这一技术已被用来工程师酶是热力学更稳定。例如，杆状stearothermophilus中性蛋白酶失活通过自溶，其中针对特定柔性表面环（残基63到69）（93）。脯氨酸在循环中引入使其不易展开。只有定位65至69是适合脯氨酸替换。在其他位置，一脯氨酸将消除非共价相互作用，产生构象株，或有不恰当的扭转角度。许多嗜热和嗜热蛋白也利用这个稳定机构（255）。Pro177和Pro316在两个N个末端螺旋和Pro24中的B-转弯位置2被证明是稳定（215）。（脯氨酸分别在相应的引入地点在拜氏梭菌的酶。）至少有其中仅发生在嗜热芽孢杆菌脯氨酸22位置寡聚1,6-葡糖苷酶。其中大多数脯氨酸是在位置2的溶剂暴露B-圈（七个脯氨酸的），在循环内的线圈（9人），或在N帽一个螺旋在桶结构（其中四个）。脯氨酸是在嗜温的相应位置引入蜡状芽孢杆菌寡-1,6-葡糖苷酶。热稳定性一般随着引入脯氨酸的数量。稳定性增长最为显著时添加的脯氨酸位置两个B-转弯或在一个螺旋瓶盖ñ 。少稳定的突变可能引入不利范德范德华相互作用或删除稳定H键（361）。在那不勒斯栖热袍木糖异构酶包含两个脯氨酸在参与亚基间的相互作用是一个循环。这些脯氨酸缺席在不太稳定的Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes酶。动力学稳定性两个T的性能thermosulfurigenes木糖异构酶突变体Gln58Pro和Ala62Pro说明如何重要突变位置为SDM（313）的结果。两Gln58和Ala62有骨干二面角这使得为脯氨酸，既不参与非共价稳定相互作用，以及Asp57和Lys61不得不二面角那允许前面的脯氨酸残留。的构象在Gln58侧链非常接近的脯氨酸吡咯烷酮环，并且因此没有构象菌株由临介绍 突变Gln58Pro稳定的蛋白质主要是通过降低展开的熵。相反，突变Ala62Pro之间创建一个卷的干扰脯氨酸吡咯烷酮环（镉原子）和Ly61侧链（CB原子），这可能导致不稳定的构象变化。突变Ala62Pro降低了酶的T1 /2为85℃下的10倍。[b] 构象应变作用力的作用[/b]左手螺旋构象的残基（Φ=40至60°，Ψ=20〜 80°）有着末端构象稳定性除非它们通过分子内的非共价相互作用来稳定。（左旋螺旋构象非甘氨酸残基被认为比右旋结构少0.52.0千卡/摩尔而不太稳定）。在左手螺旋构象的残基中，β- 碳和羰基氧的紧密相连在蛋白质结构中产生了一个局部的构象张力。左手螺旋构象的两个残基，谷氨酸15在枯草芽胞杆菌的DNA结合蛋白HU和赖氨酸95大肠杆菌核糖核酸酶H1，在旋转区域，是通过在嗜热酶的相应部分甘氨酸残基取代。突变体谷氨酸15甘氨酸和赖氨酸95甘氨酸分别在枯草杆菌DNA结合蛋白HU和大肠杆菌RNA酶H1，消除在左旋螺旋构象中由残基产生的构象张力，以及两种蛋白质的热力学稳定性的显著增加。在这两个例子中，由于构象张力的释放增加的蛋白质的稳定，通过它的稳定性影响二级结构的相互作用被加强。大肠杆菌核糖核酸酶H1包含两个额外左旋螺旋构象的非甘氨酸残基。残基色氨酸90和天冬酰胺100，而相比之下，赖氨酸95，酶内部的点，并且它们弥补了极性或疏水的相互作用。左旋螺旋构象中，常温的铁氧还蛋白含有三个残基在他们簇结合区域。在海栖热袍菌和T. litoralis的同系物中，簇结合区域的空间位阻通过具有三个甘氨酸残基的左旋螺旋构象的残基取代物被释放。这三个甘氨酸残基都涉及了拥有硫原子簇的H键。其他类型的构象张力释放作为稳定机制已经被提及。例如在α-螺旋中，具有低螺旋倾向的残基可以通过具有高螺旋倾向的残基被替换。这样的替代物通常发生在残基的侧链没有得到很好的安置的α-螺旋时。位于α-螺旋的一个特殊取代物是C末端（或C帽）。因为它缺乏了的支链以允许它采用没有张力的左手螺旋构象，并且由于主链羰基氧可以与溶剂分子形成氢键，所以在C帽甘氨酸是最有利的残基。该P.furiosus柠檬酸合成酶至少包含了7个具有C-帽的甘氨酸螺旋。他们的对稳定性的影响仍是未知的。虽然，在一般情况下，这些构象张力释放的类型不被期望提供显著的稳定性，并且它们在极端嗜热蛋白结构中没有扮演细致的角色。他们还与其他稳定机制相竞争（如倾向疏水相互作用，H键，或离子对）。[b] 螺旋偶极作用力对结构稳定的作用[/b]螺旋偶极可以通过邻近N-末端带负电荷的残基，以及邻近C-末端带正电荷的残基维持稳定。在S.solfataricus吲哚-3-甘油磷酸合成酶中，螺旋的偶极。也被稳定在杆状stearothermophilus和海栖热袍菌PGKs中：常温酶只有9 N帽和12 C帽（猪PGK）和10 N帽9 C帽（酵母PGK）通过相反的电荷被稳定。嗜热脂肪芽孢PGK数量稳定的N和C帽提高到16 N帽和13 C和在海栖热袍菌的PGK的提高到17 N帽和14C帽。尼克尔森等人展示N帽可通过约0.8千卡/摩尔增加酶的△Gstab。虽然，在一般情况下，N和C帽子和其他稳定的以及不稳定机制相竞争（例如，倾向H键或离子对）。[b]金属键对稳定性的影响[/b]长久以来，金属键以稳定和激活酶而众所周知。木糖异构酶连接两个金属离子（选自Co[sup]2+[/sup]，Mg[sup]2+[/sup]和Mn[sup]2[/sup][sup]+[/sup]）。一种阳离子是直接参与催化 第二种主要是结构。两种金属结合位点具有不同的特异性，并且一种阳离子与另一种阳离子的替换经常显著的改变酶的活性，底物特异性，热稳定性。存在和不存在于地衣芽孢杆菌木糖异构酶的金属键其酶稳定性的研究稳定结果表明的演变动力学稳定性遵循的热力学稳定性以及这两种类型的稳定性是金属呈现出的固有的功能。这些观察表明，主要稳定力与呈现在全酶中的金属相连。 对于金属在极端嗜热蛋白质中的稳定性起的作用的间接证据是在酶中除去金属遇到困难。α-淀粉酶特殊结合Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]。α-淀粉酶催化位点位于两个领域的分裂结构之间（具有8管和一个回路）。属于这两个领域的配体相调整，Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]配体对酶的催化活性和热稳定性是必不可少。巴斯德球菌胞外α-淀粉酶最初描述为Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]无关的酶，因为室温下EDTA处理对其活性没有任何影响。进一步鉴定表明，这种酶包含至少两个Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]阳离子，这种阳离子在70℃以下不能被EDTA去除。在90℃下处理EDTA30分钟除去大约60％至70％的结合的Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]。Thermococcus profundusα-淀粉酶做出类似的观察结果（约80％相同的P.furiosua,胞外α-淀粉酶）。这种酶被激活并通过Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]使其稳定，但室温处理EDTA对活性没有任何影响。 一些嗜热和极端嗜热酶曾被描述为含有金属原子，这些原子不出现在它们同源的常温酶中。来自于Sulfolobus sp.de 铁氧化还原蛋白张力7包含一个额外的40残基的N-末端延伸，这个延伸通过Zn结合位点被连接到核心蛋白上。锌原子通过N-末端结构域的三个组氨酸残基与核心结构域的1个天冬氨酸残基相连接。这种结构（N-末端延伸加锌结合位点）是不存在于真细菌同源微生物中的但是被保存在所有其他的嗜热嗜酸菌中 。逐行N末端缺失和两三个定向突变的配体表明，N端延伸和这两个锌原子对热力学稳定性很重要。虽然，它们的存在或缺失没有任何影响，但是影响着铁氧还蛋白功能。锌原子是负责9°C增加Tm值。它是如此的紧密结合在蛋白质内，在没有移除这两个FeS时锌原子不能被移除。普通嗜热放线菌枯草杆菌蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的嗜热蛋白酶包含了三个Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]结合位点 它们中的一个不出现在其常温酶同系物中（331）。嗜热酶的嗜热同系物，芽孢杆菌AK1蛋白酶比嗜热酶包含更多的Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]，并且它比在嗜热酶中出现的Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]具有更显著的动力学稳定（半衰期为15小时80℃下与19分钟为嗜热酶）。因为Ca[sup]2[/sup][sup]+[/sup]优先与羧酸盐以及其他含氧等配体结合（它是最有可能被位于蛋白质表面上的金属配位体），这种金属比其他金属在蛋白质稳定性可能扮演更显著的稳定作用。[b] 蛋白质翻译后的修饰作用[/b] 蛋白质糖基化广泛存在于真核生物的酶上，以及一些细菌的胞外酶被糖基化。只有几个例子是公知的被糖基化的极端嗜热蛋白，并且它们的碳水化合物部分还没有被广泛表征。虽然，大多数的酶被糖基化（细菌，古细菌和真核微生物），但在细菌中仍然保留了其催化作用和稳定性。一些研究使用天然糖基化的真核生物蛋白质表明，糖基化可能在不影响蛋白质折叠的方式或它们的构象下造成显著地热稳定作用。较高倾向去糖基化的酶在热失活下聚集，表明糖基化也可以防止部分折叠或来自于聚合蛋白质的展开。牛科胰核糖核酸酶A和核糖核酸酶B区别仅在于连接核糖核酸酶B的Asn34部分的碳水化合物不同。这碳水化合物解释说明了核糖核酸酶B更高的动力学以及热力学稳定性。先进的碳水化合物部分的假说表明，稳定性的不同是由于在第一个糖单元连接到Asn34。 糖基化对热稳定性的影响两个杆菌β-葡聚糖酶在大肠杆菌和酿酒酵母的表达。这两个之一酶在70℃时，通过糖基化有强烈的动力学稳定性，其最佳动力学稳定活性温度更高。对热稳定水平比对糖基化的程度更依赖于碳水化合物部分在蛋白质中的位置。虽然在自然界中糖基化可能不是大众的热稳定方法，上述被引用的几个例子表明，对于酶的热稳定或是溶解，糖基化可能代表了一种替代方法。 翻译后赖氨酸甲基化（形成于 N-ε-单甲基赖氨酸）已经描述为许多硫化的蛋白。天然的小的来自的 S.嗜酸热的DNA结合蛋白Sac7d（单甲基化赖氨酸 Lys5和Lys7）在100℃下发生可逆地变性（pH为7.0）。该重组Sac7d在92.7℃下变性。天然和重组的Sac7d之间的Tm 7°C的区别已被归因于赖氨酸的甲基化，赖氨酸的甲基化不存在于重组蛋白之中。由于Sso7d的稳定性（在S.Sulfolobus中是Sac7d的同系物）是不依赖于甲基化的，赖氨酸的甲基化在Sulfolobales是否是一般的热稳定机制。[b]盐离子的稳定性[/b]无机盐稳定蛋白有两种方式：（ⅰ）通过特定的影响，其中，金属离子于一个构象方式的蛋白质相互作用（参见“金属键”），（ii）通过一般盐的影响，主要影响水活性。 Thauer以及他的同事研究了盐对热稳定性的影响以及5种如甲烷噬热菌产甲烷的酶的活性（36，37，181，224，225）。然而这5种酶通过盐被激活以及机械的被稳定，盐影响的程度是酶的依赖性。 K[sup]+[/sup]和NH[sup]4[/sup][sup]+[/sup]通常比其他阳离子更有效地稳定酶。所有的阴离子，SO4[sup]2[/sup][sup]-[/sup]和HPO4[sup]2[/sup][sup]-[/sup]有最强的激活效应。酶盐的要求并不总是由细胞内盐浓度满足。分枝如甲烷噬热菌细胞内的盐浓度（大于1M钾加1M的环状2,3-二磷酸甘油酸）似乎对MkCH活性有利（最大浓度为1.5M盐）在其稳定（最佳浓度低于0.1M盐）。盐对来自于如甲烷噬热菌，M.thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus以及Methanosarcinabarkeri的CHOtetrahydrormethanopterin（H4MPT）甲酰基转移酶的影响进行比较。通过盐在甲酰基转移酶活性的不同是与在不同的生物体细胞内cDPG浓度直接相关。通过盐按照MkFT的活性分析了MkFT的结构。两种功能被提出相关的性质：（一）在疏水性表面MkFT呈现出下降的趋势，以及亚基间的界面在很大程度上是疏水的 和（ii）四聚体表面呈现与24个基本过量的负电荷残基（48个残基）。酸性残基可以形成较强的氢键和多H键的水分子，确保这些残基与无机阳离子或水竞争。所有的残基中，谷氨酸具有结合水分子的最高容量。48个表面带负电荷的，33个是谷氨酸和15是天冬氨酸。高易溶的盐浓度被认为由于在负电荷残基表面增加的无机阳离子增加了表面离子作用，并且间由于盐析的影响提高了亚基疏水相互作用效果。MkFT寡聚物构象显示出了需要比磷酸钾更高的NaCl浓度（更强易溶的盐），表明在MkFT热稳定中盐析的影响起主导作用。这种蛋白质可能有演变为最佳地稳定性表现在高的胞内盐浓度中。 当在98℃时，如甲烷噬热菌细胞中含有约的1M cDPG。cDPG中的钾盐，2,3-DPG以及磷酸盐在激活如甲烷嗜热酶环化酶中同样有效。然而，在同等离子浓度cDPG比在稳定的MkFT中更有效。在如甲烷噬热菌中，cDPG浓度对MkCH和MkFT的活性以及稳定性是最佳的。合成CDPG需要4 分子ATP。在这个合成的最后反应是唯一一个能够放出足够的能量来驱使合成cDPG而非其前体2,3-DPG。此外，在pH=7.0，cDPG是三阴离子，而2,3-DPG是五阴离子 因此cDPG比2,3-DPG在离子强度方面有更小的影响。[color=#ff0000] [/color]M. fervidus[color=#ff0000] [/color]磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）本质上动力学稳定仅达到75℃。通过盐来研究这种酶的热稳定性表明，相对于盐的效果—K[sub] 3[/sub] PO[sub] 4[/sub]Na[sub]3[/sub]PO[sub]4[/sub][sub] [/sub]K[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]Na[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]KCLNaCL—都与他们保持一致各自的能力以减少酶在水溶液中的溶解度。它们的盐析影响了他们活性的分布。 M. fervidus GAPDH可能由cDPG被稳定在体内，它以约为0.2〜 0.3M出现在生物体中。有趣的是，其他的M.fervidus酶是唯一依赖于低于生物体的最佳生长温度的以维持稳定，这表明在该生物体中通过盐的稳定性是共同的机制。 [b]压力的影响[/b] 因为许多高温环境同样也是高压环境并且因为微生物无法逃避压力和温度，所有的大分子细胞成分必须能适应高的压力。因此，并不奇怪的是找到极端嗜生物体也是嗜压微生物（如嗜热barophilus），并发现通过高压使这种酶被稳定以及被激活（例如，M。詹氏甲烷球菌的蛋白酶和氢化酶）。通过压力这种稳定性背后的理论说明压力有利于体积最小的结构。蛋白质主要通过疏水被稳定因此，预计在高呀下被稳定，而通过离子相互作用被稳定的蛋白质应该是不稳定的。例如，P.furiosus 红素氧还蛋白主要是由静电相互作用稳定。这种酶在高压力不稳定。由于许多化学反应在高温高压进行的，在高压下酶的稳定性可能很大程度上对生物催化作用有利。

现在，在实验研究基础上，借助多方面的生物信息学方法，可以快速高通量的预测和进行蛋白质鉴定蛋白翻译后修饰。分泌蛋白和膜相关蛋白附着于细胞膜上的或将被排泄出去的蛋白质是由细胞内质网膜上附着的核糖体合成。附着有核糖体的内质网被称为糙面型内质网。这类蛋白质都含有一个N-末端（或氨基端），我们称之为信号序列或信号肽。这个信号肽通常情况下含有13-36个主要疏水性残基，同时它含有多蛋白复合物，我们称之为信号识别粒子(SRP)。这种信号肽在通过内质网膜之后会被去除。信号肽的去除过程是在信号肽酶催化作用下完成的。含有一个信号肽的蛋白质被称为前蛋白，有别于原蛋白。然而，某些用于分泌的蛋白在分泌之后会进一步被蛋白水解，因此包含有原蛋白的序列。这类蛋白质被称为前原蛋白。蛋白水解性裂解许多蛋白质在翻译之后会经历水解性裂解过程。其中最为简单的形式是去除起始蛋氨酸。许多蛋白质合成了不活跃的前体细胞，这些细胞只能在合适的生理条件下通过限制性蛋白水解过程产生活性。在凝血过程中使用到的胰腺酶和酶类就是后者的例证。多肽去除时产生活性的不活跃的前体蛋白，我们称之为原蛋白。前原蛋白的翻译后加工过程的一个复杂的例子就是脑垂体分泌合成的前阿黑皮素原的裂解过程（有关前阿黑皮素原的讨论，见肽类激素页）。这类前原蛋白经过复杂的裂解，根据合成的前阿黑皮素原的细胞定位而不同，其路径也有所不同。另一个前原蛋白的例子就是胰岛素。由于胰岛素是由胰腺分泌的，因此它有一个前肽。随着含24个氨基酸的信号肽的裂解，这类蛋白也折叠成了胰岛素原。胰岛素原进一步分裂，产生活跃的胰岛素，它包含两个肽链，由二硫键进行连接。但仍有其他的蛋白（酶类）被合成为非活跃的前体细胞，被称为酶原。酶原在蛋白水解性裂解时会产生活性，在凝血串联蛋白质链的若干蛋白质中都会发生这种现象。甲基化作用蛋白翻译后的甲基化过程主要发生在氮原子和氧原子上。活性甲基供体是活性腺苷甲硫胺酸(SAM)。最常见的甲基化作用发生在赖氨酸残基的ε-amine上。脱氧核糖核酸组蛋白中赖氨酸残基的甲基化作用可调节核染色质结构，因此可调节其转录活性。赖氨酸原本被认为是一种常设共价标记，可提供长期信号，甚至包括转录记忆时的组蛋白依赖机制。然而，最近的临床研究表明赖氨酸甲基化作用与其他共价修饰体相似，作用时间短，并能通过反脱甲基化活动进行动态调节。最近的组学研究发现表明，赖氨酸残基的甲基化作用不仅发生在核染色质层面，而且还通过修订转录因子影响基因表达。组氨酸的咪唑环，精氨酸的胍基部分以及谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组酰胺（R-group amides ）上，都发现了额外的氮甲基化作用。谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组羧化物也会发生氧甲基化作用并形成甲基酯。蛋白可能在半胱氨酸的R[