色谱反相

反相色谱法中有种特殊的模式非水反相色谱法（NARP），色谱柱是非极性（如C18），流动相顾名思义非水全部由有机相组成。非水反相色谱（NARP）中主要用来分离疏水性很强的样品，这些样品的保留能力很强，如脂类、合成聚合物等。非水反相色谱中的流动相是由极性较强的有机溶剂A和极性较弱的有机溶剂B组成。通常A溶剂常用的是乙腈或甲醇，B溶剂是四氢呋喃、异丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或者其他极性较弱的有机溶剂。样品保留是通过改变%B或B溶剂的极性来控制的。反相色谱法的保留机制长久以来都是研究重点。溶质分子在固定相的定位可能有几种形式存在，如疏溶剂作用、吸附作用、分配作用等。疏溶剂相互作用假定了溶质分子与配合基对齐并且附着在它上面。吸附意味着溶质分子并没有渗透到固定相里面而是保留在固定相和流动相液体之间。分配作用为固定相和液体类似，溶质分子溶解在里面。见下图：其中疏溶剂的作用是接受比较广的理论：相对而言，疏水性的溶质分子比较喜欢吸附在疏水性的烷基基团上，因此也叫疏水性保留。反相色谱法中键合的烷基等非极性固定相，流动相为水、有机溶剂、缓冲液等极性溶剂。键合相链越长、疏水性越强，溶质的保留值越大；流动相表面张力越大、介电常数越大、极性越强，溶质与键合相的作用越强，流动相的洗脱能力越差，溶质保留值越大。溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。对于非水反相色谱法，原理和反相色谱法一致。固定相为非极性固定相。样品由于疏水性较强，保留较大，不采用强极性水溶液作为流动相，全部由有机溶剂组成。非水反相色谱法方法优化同反相色谱法，主要通过改变%B或B溶剂的极性来调节，等度或梯度都能使用，同时柱温对样品的分离也有影响。一般采用shou选采用ACN（A）和THF（B）的混合溶剂为作为初始流动相。若用1OO%THF样品保留仍太强，可以用极性较弱B溶剂（如二氯甲烷或氯仿）来替换，但是应考虑使用二氯甲烷或氯仿的检测波长。非水反相色谱法为反相色谱法的一种特殊模式，色谱柱同反相色谱法常用的非极性色谱柱，流动相全为有机相，样品保留是通过改变极性较弱溶剂的极性来控制；主要分离疏水性很强、不溶于水的样品。在平时工作中，遇到类似物质可以考虑使用非水反相色谱法。

贾伟 沃特世科技（上海）有限公司实验中心 对于微量而且复杂的样品，如蛋白质组学样品、蛋白药物中的残留宿主细胞蛋白（HCP）等，不但需要高灵敏的纳升级液相，而且需要更为充分的分离。在线二维纳升分离技术（on-line 2D NanoLC）应运而生，并已成为微量复杂样品液质分析所必不可少的分离手段。 传统的纳升在线二维技术，一般采用强阳离子交换（SCX）作为第一维，反相色谱（RP）作为第二维的分离手段。这种方法是根据样品在盐溶液中的离子特性与疏水性，这两种属性间的正交关系实现的。但是SCX-RP技术在纳升级分离中却困难重重。困难主要来自SCX分离维度。在SCX分离中需要使用浓度较高的盐溶液作为流动相，但含盐流动相易发生盐析或导致样品在管路内沉淀，而纳升液相的管路内径又非常小（25-100微米）。因此，在实际运用SCX-RP分离时，经常出现管路阻塞而导致实验失败。 为此，除提供传统的SCX-RP分离技术外，沃特世创造性地开发了双反相二维分离方法。（RP-RP）。这种RP-RP技术不必使用高浓度盐溶液作为流动相，避免了离子交换分离易造成的管路阻塞问题，从而大大提高了纳升二维液相的系统稳定性和实用性。更令人兴奋的是，经过哈佛医学院的Jarrod A. Marto全面的实验对比发现，较SCX-RP方法， 运用RP-RP分离技术得到的液质分析结果更好（图1）[1] RP-RP双反相二维方法可以帮助科学家得到更多的蛋白质分析结果.这是因为：1、SCX方法使用的盐缓冲液易产生离子噪音背景，从而影响质谱数据质量；2、SCX分离效果取决于多肽所携带的电荷数，而多肽携带电荷数量类别有限，因此第一维SCX分离度较差，造成液质数据信息质量不高。图一R P-R P双反相分离技术在第一、第二维都使用了反相色谱，那么它是如何实现二维分离所必须的分离性质的正交呢？原来，经过研究发现，在不同pH值环境下，多肽的反相保留行为是不一样的（图2）[2]。根据这个性质，沃特世的科学家开发出了独有的RP-RP纳升在线二维系统——nanoACQUITY UPLC® System with 2D-LC。这个系统的分离柱，使用了UPLC一贯的亚二微米颗粒填料，因此具有了UPLC的超高分离度等优点。此外，它还不需要分流就可以实现精准的纳升流速，可为实验室节省巨大的高纯度流动相购买费用及废液处理费用，而且更加环保。nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC双反相二维系统优点总结如下：■ 较SCX-RP技术，使用RP-RP系统可得到更多的蛋白鉴定结果。■ RP-RP系统较SCX-RP系统更稳定、耐用。■ 与nano HPLC相比，nanoACQUITY UPLC具有UPLC超群的分离效果。■ 不分流实现精准的纳图二nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC双反相在线二维系统结构及分析流程如图3，其中包括三根色谱柱：高pH反相柱、捕获柱、低pH反相柱。在此系统中，第一维色谱柱为高pH色谱柱。样品进入第一维色谱柱后，第一维梯度泵可按使用者要求，自动地阶梯式提高有机相比例，以将样品中不同疏水性肽段分批洗脱下来。从高pH反相柱上洗脱下的多肽会被富集柱捕获。每批次被富集的多肽，将在第二维泵的线性梯度模式下进入低pH反相分析柱，在这里经过充分分离后，样品将到达离子源，进入质谱分析器。 其中左下图为结构示意图。步骤①：样品被自动进样器采集后，在第一维梯度泵的推动下进入高pH色谱柱。步骤②：样品在第一维泵阶梯式梯度作用下，将一部分多肽冲出，后被捕获柱富集。其中第二维梯度泵通过施加9倍于第一维泵的水相流动相，将溶剂稀释为适合捕获柱富集的体系。步骤③：在六通阀切换后，第二维泵通过线性梯度，将多肽样品进行充分分离并送至质谱分析。在执行完步骤①后，步骤②与步骤③交替进行直到完成所需分析。双反相在线二维系统nanoACQUIT Y UP LC System with2D-LC已经在多肽的液质分析方面被广泛应用，帮助研究人员取得了众多极具价值的研究成果。图3. nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC系统结构及分析流程图。参考文献(1) Zhou F, Cardoza JD, Ficarro SB, Adelmant GO, Lazaro JB, Marto JA. Online Nanoflow RP-RP-MS Reveals Dynamics of Multicomponent Ku Complex in Response to DNA Damage. J Proteome Res. 2010, 9, 6242-6255.(2) Gilar M, Olivova P, Daly AE, Gebler JC. Two-dimensionalseparation of peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second separation dimensions. J. Sep. Sci. 2005, 28, 1694–1703. 关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2011年沃特世公司拥有18.5亿美元的收入，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 # # #联系方式：叶晓晨沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部xiao_chen_ye@waters.com周瑞琳(GraceChow)泰信策略(PMC)020-8356928813602845427grace.chow@pmc.com.cn

对于LC-MS/MS色谱柱人们的惯性思维通常是由反相液相色谱柱开始研发, 产生这种惯性思维是因为常规高效液相色谱分析中C18等反相高效液相色谱柱占有统治地位,另一方面是色谱公司不懂LC-MS/MS分析误导用户的结果。这惯性思维是不正确的! 　　LC-MS/MS分析的实用战略和HPLC有很大不同! LC-MS/MS分析的方法的选择性最重要! 　　色谱公司不能简单地将现成的反相液相色谱填料装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用, 但事实上几乎所有色谱公司都是这样做的。这样的反相液相色谱LC-MS/MS柱有三个明显的弱点: 　　(1) 许多极性化合物难以保留，质谱灵敏度差。 　　许多重要的物质，如抗癌药物DTIC, 抗痛药物河豚毒素，污染物质三聚氰胺, 中草药中糖肽等非常极性, 在反相液相色谱柱上没有保留。还有许多的化合物比较极性, 使用少量的甲醇或乙腈就从反相液相色谱柱上洗脱。在药物代谢研究中, 观察到许多化合物自己疏水, 但代谢产物亲水的情况。甲醇或乙腈含量低, 离子化程度低, 质谱灵敏度差。所谓水相C18柱在LC-MS/MS分析中没有价值。 　　(2) 用常规反相色谱填料装成2.1mm内径的色谱柱在LC-MS/MS和LC/MS应用中常陷入记忆效应(Carryover Effect)的“陷阱” 　　LC-MS/MS和LC/MS应用中另一个重大问题是记忆效应(Carryover Effect)。记忆效应是指在进样后, 再进一针空白在同样的保留时间仍然观察到化合物峰。记忆效应的副作用是明显的: 它可能人为地增加下一样本的MRM信号, 影响定量分析的精密度和准确度。US FDA Bioanalytical Regulatory Guidances限制最高校准标准(highest calibration standard) 的记忆效应不能超过20 %最低校准标准(lowest calibration standard)MRM信号的20%。 　　由于大部分色谱公司都使用现成的反相液相色谱填料简单地装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱, 在许多情况下，使记忆效应强, 校准标准曲线范围必须人为缩短, 或不得已在进样后, 再进一针甚至两针空白最小化记忆效应, 然后进下一个样品。所有这些严重地降低了生产效率。 　　(3) 峰形拖尾或扭曲 　　因为活性硅醇基无法完全封闭, 许多碱性化合物在几乎所有色谱公司的反相液相色谱柱上面有明显的峰形拖尾。这种峰形拖尾是记忆效应的一个重要的根源。 　　另一方面，使用不正确方法过分封闭致使一些酸性和两性化合物分离效果不佳, 特别是出现峰失真和分裂现象。 　　Chrom-Matrix公司认为LC-MS/MS色谱柱和色谱方法的第一选择是亲水色谱(Hydrophilic Interaction)! 亲水色谱使用乙腈作为弱溶剂和水为强溶剂, 彻底解决质谱灵敏度差, 记忆效应等问题。疏水化合物首先流出, 然后是亲水化合物。不仅彻底解决极性化合物难以保留的问题, 而且同时分析了疏水化合物, 也提高了疏水化合物质谱灵敏度。峰形拖尾问题也获得彻底解决。此外，乙腈提取液不需要蒸发和重新溶解，从而节省了大量的时间。另一方面, 反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法仍然重要, 不仅是一些重要的中性化合物如抗癌药物紫杉醇, 抗免疫器官植入药物FK 506和雷帕霉素(rapamycin), 降脂药等必须使用反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法, 还因为大多数客户习惯于反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法。即使这样反相液相色谱填料也必须通过处理才能装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用。Chrom-Matrix公司研发出InnovationTM 反相液相色谱填料通过超临界流体技术封端最大程度封闭活性硅醇基, 非常好的解决了碱性化合物峰形拖尾的问题,然后通过特殊处理最大程度消除了记忆效应。 　　Chrom-Matrix公司成功研发了三种亲水LC-MS/MS色谱柱和五种反相LC-MS/MS色谱柱, 而且为客户成功研发了数百个LC-MS/MS应用。Chrom-Matrix公司至成立起，就凭着领先一代的观念、技术和产品赢得美国FDA、美国能源部、美国农业部、国际禁毒组织、许多欧美制药集团、第三方检测机构、大学及研究机构等顾客的由衷欢迎。 　　Chrom-Matrix公司的目标就是帮助客户开发, 验证和应用先进, 正确, 精确, 真实, 像岩石一般坚实, 同时又灵敏, 快速, 便宜的LC-MS/MS定量分析方法。

在高效液相色谱（HPLC）或超临界流体色谱（SFC）分析中，挑选合适的色谱柱是关键一步。因此，我们特别邀请您参加由Teledyne LABS色谱专家Todd Anderson主讲的网络研讨会。Todd将围绕这一复杂议题提供实用的解答，助您作出明智的选择。在研讨会中，Todd会深入探讨反相和正相分离中不同固定相的特性及其差异，并讨论流动相条件对这些固定相的影响。虽然C18通常是反相分离的首xuan，但Todd还会向您展示一些独牛寺的选项，这些可能对您未来的分离工作大有裨益。此外，Todd将展示这些固定相在SFC色谱中的表现，并为您提供可能会亲自遇到的新型案例。接着，他将分享自己最推崇的四种SFC固定相，以适应蕞广泛的化合物种类。他还将把SFC与常规及反相色谱部分中使用的某些色谱条件进行对比关联。JOIN US特别福利！只要参与本次网络研讨会，您便有机会获得一个特别的优惠，我们相信这对您来说是非常有价值的。具体详情将在研讨会中揭晓，敬请期待！诚邀您加入我们，请选择蕞适合您的时间。

在液相色谱分析中，极性和亲水化合物的有效保留和分离是一个难点和热点。常见的应对手段是使用亲水分离模式（HILIC），但该模式平衡时间较长、作用机理复杂以及分离能力有限。反相（RPLC）是应用最多的一种分离模式：1.优异普适性；2.柱效高，重现性好；3.平衡时间快。目前常见的C18色谱柱对极性化合物的保留较弱，导致分离能力有限。开发一款能够有效提升极性和亲水化合物保留和分离的C18色谱柱，具有重要的应用价值。因此，纳谱分析研发团队凭借深厚的专业知识以及对色谱分析技术领域的不懈的创新精神，经过精心研发与严格测试，推出了全新的ChromCore T3色谱柱！下面跟着小编，一起来目睹下纳谱分析的这款重磅新品吧！纳谱分析ChromCore T3色谱柱基于孔道结构特殊设计的单分散、多孔、硅胶微球，表面键合十八烷基，优化装填而成，适用于反相模式下极性和亲水化合物的保留和分析。 对极性和亲水化合物表现优异的反相保留耐受100%水相柱流失低，质谱兼容性良好柱间一致性佳由以上测试数据和应用案例可知，ChromCore T3色谱柱表现出良好的100%水相耐受性和批次间一致性，能够有效实现极性和亲水化合物保留，对三种中药配方颗粒的分析结果完全满足国家标准要求，表面该款色谱柱在极性和亲水化合物在内的小分子化合物分析方面具有广阔的应用前景。产品名称粒径(µ m)柱长(mm)内径 (mm)4.6ChromCore T3 5250A711-050012-04625S150A711-050012-04615S100A711-050012-04610S50A711-050012-04605SGuard Cartridge510A711-050012-04601SGuard Holder (Stand-alone)/10 Guard-04601S-C1*更多产品详情，欢迎咨询我司当地销售人员或拨打400 808 3822服务热线，纳谱分析将竭诚为您服务。

国家卫生健康委员会、国家市场监管总局联合发布了85项食品安全国家标准和3项修改单的公告，其中包括了GB 5009. 296-2023《食品安全国家标准 食品中维生素D的测定》（以下称新标准）。新标准代替GB 5009.82-2016《食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》中第三法“食品中维生素D的测定液相色谱串联质谱法”和第四法“食品中维生素D的测定高效液相色谱法”。新标准最大的变化便是增加了在线柱切换反相液相色谱法。在此背景下，为了进一步促进维生素D检测工作的交流与合作，仪器信息网特别发起“维生素D新标准解读与应对”话题。本文邀请到科诺美（北京）科技有限公司液相色谱产品经理公敬欣分享相关的技术及解决方案。 01 引言维生素D是机体维持正常代谢和调节机能所必须的脂溶性维生素，主要包括维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇），具有促进肠道对钙、磷的吸收和在骨骼中沉积，维持骨骼的正常生长与发育的作用，因此维生素D的准确测定对于产品质量控制具有重要的意义。在维生素D的测定中，由于添加量相对较低，且样品基质复杂，存在脂肪、蛋白等干扰物。现行标准GB 5009.82-2016中第四法中，在对样品进行皂化、提取、洗涤、浓缩后，通过正相液相色谱净化，浓缩复溶后再通过反相色谱法分离检测。该方法分析单个样品的时间较长，降低了分析效率，并且过于繁琐的前处理操作，也会对回收率的结果产生较大影响。因此，在即将生效的《GB 5009.296-2023食品国家安全标准 食品中维生素D的测定》中，将在线柱切换-反相液相色谱法作为该标准的第二法，优化了样品前处理流程，提升检测灵敏度，更快速地获取分析结果，提高了样品的检测效率。面对新标准的即将实施，科诺美的技术应用团队制定了符合标准要求的解决方案。本方案采用Chromai Lotus C8作为一维色谱柱，Lotus PAH作为二维色谱柱，基于Chromai Leaps双三元二维液相色谱平台，建立了在线柱切换-反相液相色谱测定食品中维生素D的方法，并通过实际样品的测试，确认该方法稳定可靠。 02 实验方法2.1 仪器Chromai Leaps高效液相色谱系统（1）一维、二维泵：Leaps双三元梯度泵（P60）（2）自动进样器：Leaps标准型自动进样器（带制冷）（A10C）（3）柱温箱：Leaps 标准加热型柱温箱（1个两位六通+1个两位10通）（C10V6）（4）检测器：Leaps紫外-可见检测器（D10）Leaps紫外二极管阵列检测器（D20）2.2 色谱柱一维色谱柱：Chromai Lotus C8（4.6*100 mm, 5 μm）二维色谱柱：Chromai Lotus PAH（4.6*150mm, 5 μm）富集柱：Chromai Louts TC C1（4.0*10mm，5 μm）2.3 软件Eyoulab CDS企业版2.4 色谱条件流动相一维流动相：A：水，B：乙腈/甲醇（75/25,V/V)，梯度洗脱，流速：1mL/min二维流动相：A：乙腈/水(95/5,V/V)，B：甲醇，等度洗脱，流速：0.6 mL/min梯度洗脱及阀切换程序一维梯度洗脱程序二维等度洗脱阀切换程序检测波长264 nm进样量100 μL 03 实验结果3.1 标准曲线的测定将不同浓度的标准系列工作溶液分别进样100 μL，得到维生素D2和维生素D3标准曲线结果见表3。在2.5 -100 μg/L浓度范围内，维生素D2和维生素D3线性良好，线性相关系数均大于0.999。表3 维生素D2和维生素D3标准曲线测定结果图1 维生素D2和维生素D3标准曲线图图2 维生素D2和维生素D3标准溶液（2.5 ng/mL）二维液相色谱图3.2 实际样品测定参考GB 5009.296-2023第二法对样品进行皂化、液液萃取等前处理操作，得到样品溶液后上机分析，计算得到样品含量结果见表4。图3 某婴配粉样品1和2测定二维液相色谱图表4 某婴配粉样品测定结果 04 结论本解决方案采用科诺美自主研发的Leaps双三元液相色谱系统，参考GB 5009.296-2023第二法在线柱切换-反相液相色谱法，实现了维生素D测定中高效的样品前处理，检测效率显著提高。Leaps双三元液相色谱系统模块式组装，仅使用一个双三元泵就可以实现二维液相操作，避免了两组泵模块组装占地面积大或者仪器系统高度过高、操作不便的弊端，该系统可作为维生素D测定的首选配置。对于需要一次进样实现样品中维生素A、维生素D及四种维生素E异构体的同时测定分析，科诺美也可以提供在线前处理—二维液相色谱的完整解决方案。该方案灵敏度高、专属性强，可以有效去除样品中的杂质对维生素A、D、E的分析干扰。供稿人：科诺美（北京）科技有限公司液相色谱产品经理 公敬欣科诺美（英文：Chromai），是中国领先的从事分析检测仪器与医疗诊断研发、生产、销售和服务的高科技技术企业。是中国仪器仪表学会、中国分析测试协会、中国医疗器械行业协会会员。公司旗下设立北京研发中心、苏州供应链中心等多家子公司。科诺美公司一直致力于脂溶性维生素测定方法的研究与应用，除了食品中维生素的测定外，Chromai二维液相色谱系统已经取得二类医疗器械注册证（苏械注准20222222069），该系统已经成功应用于血清中脂溶维生素的测定。

安捷伦科技发布有助于加快蛋白质高级结构表征的亚二微米反相UHPLC色谱柱 2011 年6 月28 日，安捷伦科技公司（纽约证交所：A）发布了用于UHPLC 系统的ZORBAX RRHD 300SB-C18 1.8 微米色谱柱。该产品为反相硅胶柱，可实现对完整蛋白质和蛋白质酶解物更高级结构的反相色谱表征。 安捷伦生物色谱柱产品经理Linda Lloyd 介绍说：&ldquo 越来越多的研究者开始转向超高压液相色谱仪（UHPLC）分析，以期获得更快、更可靠的分析结果。有了这些新型超高压快速高分离度色谱柱，研究人员现在可以充分利用最新液相技术的优势，包括1260 生物惰性HPLC以及耐 1200 bar 高压的安捷伦1290 Infinity UHPLC。该色谱柱的问世扩展了安捷伦针对蛋白质一级结构分析的产品线。&rdquo 该新型色谱柱采用ZORBAX StableBond 固定相填充，在pH 低至1 时同样具有高稳定性，可以放心使用三氟乙酸和甲酸洗脱液。该色谱柱在温度高达90 ℃时依然非常稳定，耐久性不会有丝毫损害。 如需了解更多信息，请访问：www.agilent.com/chem/BioRPUHPLC。 关于安捷伦科技 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是全球领先的测量公司，同时也是通信、电子、生命科学和化学分析领域的技术领导者。公司的18500 名员工为100 多个国家的客户提供服务。在2010 财政年度，安捷伦的业务净收入为54 亿美元。要了解更多安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn。

各有关单位、相关专家：由北京农学院、北京中农弘科生物技术有限公司、河北弘科荣达生物技术有限公司、安琪酵母股份有限公司、安徽东方新新生物技术有限公司、北京大北农科技集团股份有限公司、中国农业大学、铁骑力士食品有限责任公司共同起草的团体标准《酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定 反相高效液相色谱法》已完成征求意见稿。根据《中关村量子生物农业产业技术创新战略联盟团体标准管理办法》的有关要求，现公开广泛征求意见。请各有关单位和专家认真审阅团体标准《酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定 反相高效液相色谱法》征求意见稿及编制说明，并于2023年9月25日前将《征求意见表》反馈给联系人。同时欢迎与该项团体标准有关的高等院校、科研机构、相关企业、行业从业者等加入本标准的研制工作，若有意参与该项团体标准研制工作请与中关村量子生物农业联盟联系。联系人：刘运平联系方式：15011406045电子邮箱：uabi2007@163.com 中关村量子生物农业产业技术创新战略联盟2023年8月25日关于征求《酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定 反相高效液相色谱法》（征求意见稿）意见的通知.pdf1.团体标准-《酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定 反相高效液相色谱法》（征求意见稿）.pdf2.团体标准-《酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定 反相高效液相色谱法》（征求意见稿）编制说明.pdf3.团体标准-《酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定 反相高效液相色谱法》征求意见表.docx

各有关单位：根据国家标准化管理委员会、民政部关于印发《团体标准管理规定》（国标委联[2019]1号）的规定和《中关村量子生物农业产业技术创新战略联盟团体标准管理办法（试行）》的有关要求，由北京农学院牵头申报的《反相高效液相色谱法测定酿酒酵母培养物中甘露聚糖含量》团体标准经联盟标准化工作委员会及相关专家评审，符合立项条件，现批准立项。请各起草单位按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定和要求，严把质量关，加强组织协调，增强本标准的适用性和有效性，确保标准高质量，按期完成标准编制工作。同时欢迎与本标准有关的高校、科研机构、相关企业、使用单位等加入本批标准的起草制定工作。有意参与标准起草制定工作的请与联盟秘书处联系。联系人：刘运平，电话：15011406045电子邮箱 ：uabi2007@163.com通讯地址：北京市海淀区苏家坨镇翠湖南路澄湾街19号院。中关村量子生物农业产业技术创新战略联盟2023年04月26日

Matthew A. Lauber、 Stephan M. Koza 和 Kenneth J. Fountain目的证明ACQUITY UPLC M-Class系统和配套的色谱柱进行微升级2D-RP/ RP肽段色谱的性能和重现性。背景信息微升级LC-MS方法在蛋白质组学领域得到了日益广泛的应用。近来此方法作为Elisa免疫分析的互补技术，在分析生物药品中残留宿主细胞蛋白质（HCP）上也得到了关注和应用。采用如300 μm窄内径色谱柱能够从相对少量的样品中获得丰富的信息。同时，在此类工作中需要进行高峰容量的肽段分离，因为更高的分离效率才能更容易检出待测物。 通过多维色谱可以提高肽段分析的峰容量，二维正交的色谱分离方法相结合可提供更好的分离能力。反相/反相（2D-RP/ RP）二维色谱具有特殊的优势，通过使用具有卓越的化学稳定性和机械稳定性的亚乙基桥杂化硅胶颗粒固定相（BEH Tec hnology），第一维进行高pH反相分离，随后经过在线富集后得肽段混合物在亚2 μm颗粒的分析柱进行第二维低pH反相梯度分离（具体操作请参考以前的应用资料）。 使用配置2D-RP/RP功能的ACQUITY M-Class系统和配套的色谱柱进行复杂肽段分析，峰容量更高，重现性更好。 在本简报中，我们通过使用ACQUITY UPLC M-Class系统和ACQUITY UPLC M-Class 300 μm内径的分析柱，进一步拓展了此技术的应用和性能。通过测试不同色谱柱组和使用寿命可以看到，此系统不仅具有卓越的分离能力，还实现了绝佳的重现性和可靠性。使用ACQUITY UPLC M-Class系统和色谱柱的2D RP/RP在线二维色谱分离将是一种进行复杂样品研究肽段混合物如残留宿主细胞蛋白的理想方法，峰容量高，性能稳定可靠。下载完整应用纪要请点击: http://www.waters.com/waters/library.htm?lid=134779299&cid=511436

p 　　在液相色谱方法开发时选择合适的有机溶剂需要考虑几大关键因素(见最后的表格)。其中，黏度是重要因素之一，因为高黏度溶剂会产生高背压，因而可能会对仪器系统带来限制。 /p p 　　其它重要的溶剂特征还包括UV截止波长和极性指数：UV截止波长较高会导致UV/Vis检测的灵敏度不佳，而溶剂的极性指数较低则往往会导致化合物洗脱较快，因而通常用于色谱柱的清洗。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 优选溶剂： /strong /span /p p 　　 strong 乙腈、甲醇、丙酮 /strong /p p 　　乙腈 毫无疑问是优选的有机溶剂，因为其在与水的混合体系中产生的系统背压极低，而且UV截止波长也很低，因此UV/Vis检测的灵敏度更高。 /p p 　　甲醇 是另一种常用的有机溶剂，它的洗脱强度与乙腈相当，UV吸收相对其他溶剂也较低，而且价格比乙腈便宜得多。甲醇的主要缺点是粘度较大带来的高背压，尤其是在使用小粒径的HPLC色谱柱时更为明显。 /p p 　　虽然丙酮 的UV吸收较高，但如果分析物在较高的UV波长进行检测，或者使用其它类型检测器，如质谱或ELSD，则丙酮也可以进行有效的使用。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 次选溶剂： /strong /span /p p 　　 strong 乙醇、异丙醇/正丙醇、四氢呋喃 /strong /p p 　　一般不建议使用乙醇，因为其在与水的混合体系中产生很高的背压。但是有时乙醇对于针对成品的制备方法来说是优先选择，因为它可以避免溶剂残留。 /p p style=" text-align: center " img title=" 323232323.png" alt=" 323232323.png" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/39ef5903-af71-41c8-9d68-a8acd994b380.jpg" / /p p 　　异丙醇和正丙醇 的洗脱强度较高，也是色谱柱进行低流速清洗最常用的溶剂，但是它们同样会产生较高的背压。另外，它们是很好的助溶剂，在分析完整蛋白时经常被使用。 /p p 　　四氢呋喃 的洗脱强度与正丙醇相当，但由于较昂贵所以不太常用。但是，它可以作为脂肪或高色素样品的清洗或再生溶剂。 /p p style=" text-align: center " img title=" 4444444.jpg" alt=" 4444444.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/87678caa-6756-44d6-83a2-949df7b60abc.jpg" / /p p /p

在介绍反相离子对试剂之前，我们先回忆一下离子对色谱法（Ion-pair chromatography，IPC），离子对色谱法可被看作是以分离离子样品为目的的反相色谱法（Reversed-phase chromatography，RPC）的改良形式。IPC与RPC唯yi不同的条件是IPC在流动相中添加了离子对试剂，这些试剂能在平衡过程与酸性化合物的A-或者碱性化合物的BH+发生相互作用。“ 关于离子对试剂 ”离子对试剂是由强亲水离子形成，反作用于样品分子的中性离子对。因此，可用于同时分离带电分子和非带电分子。反相离子对色谱法是把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电荷的中性离子，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。”一般情况下，在建立HPLC分离方法的时候，我们推荐由RPC开始，接着添加离子对试剂（仅当有需要时）。举个例子，当我们已知某个峰是对应一个酸性物质、碱性物质或中性物质时，我们便能准确地预测出添加的IPC试剂对溶质保留的影响。因此，当改变RPC的其他条件仍不能达到合适的分离度时，我们可以通过使用IPC试剂不断改变酸性溶质和碱性溶质的保留行为从而改善他们的分离效果。那么，IPC在什么时候或者应用于什么物质的分离会是比较合适的分离方法呢？在样品出现以下特点时我们就可以考虑使用离子对试剂：（1）在反相色谱柱上不保留或保留弱；（2）化合物带有强离子官能团，如羧基、铵基、氨基等；（3）化合物在反相体系流动相中有足够的溶解度。使用离子色谱法可令样品的保留行为产生类似于改变流动相的pH的变化，但是离子对色谱法能更好的控制酸性溶质或碱性溶质的保留行为，而且无须使用极端的流动相pH（如，pH＜2.5或pH＞8.0）。“常见的离子对试剂”常见的离子对试剂主要包括如下几类：阴离子对试剂：四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵等碱性试剂，适用于结构式中含磺酸基、羧基等的极性化合物。阳离子对试剂：甲烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠等，适用于结构式中含铵基、氨基等的极性化合物。其他离子对试剂：高氯酸钠、三氟乙酸、七氟丁酸等。

在色谱分析中，反相色谱柱C18以其广泛的适用性及良好的选择性被普遍使用。但分离性能优良的色谱柱往往具有很高的价格，令人望而却步，低廉价格的色谱柱又不能实现成功的分离，让人无从选择。 为满足您对于反相色谱柱价格与优异的分离性能兼顾的需求，迪马科技最新推出Luster&trade C18&mdash 超高性价比通用型反相色谱柱，最大限度满足各种HPLC应用。该色谱柱使用＞99.999%的超纯硅胶，具有超长的使用寿命，优异的批次重现性和极高的性价比。 Luster C18色谱柱的特点： &bull 使用超纯硅胶（＞99.999%） &bull 超高的性价比 &bull 超长的使用寿命 &bull 通用型反相色谱柱，满足大多数色谱分析 &bull 优异的批次重现性 超长的使用寿命 每一款通用型反相色谱柱在日常的色谱分析中分离性能的差异不会特别明显，但使用寿命却各有不同。一款能够长时间使用的色谱柱不仅减少了频繁更换色谱柱带来的重新进行方法验证、条件摸索等工作，还大大节约了使用成本。迪马科技Luster&trade C18色谱柱全部使用具有极为光滑的表面和规则的球体外型的硅胶填料，最大程度上减少了键合和装填过程中出现颗粒划伤及损伤的几率，先进的填装技术及工艺使柱床更稳定，从本质上保证了Luster&trade C18较长的使用寿命。实验结果表明：连续600次进样后色谱柱依然表现出良好地分离性能。 色谱柱：Luster&trade C18 150 × 4.6 mm, 5 &mu m 流动相：甲醇：0.1%三氟乙酸水溶液=30:70 流速：1.0 mL/min 柱温：室温 检测器：UV 230 nm 样品： 1．头孢他啶 2．头孢羟氨苄 3．头孢唑林 4．头孢克洛 5．头孢氨苄 6．头孢西丁 7．头孢拉定 优异的批次重现性 批次重现性是衡量在不同时间购买的同一款色谱柱是否具有相同的使用效果的重要指标。迪马科技Luster&trade C18每一根色谱柱都经过了严格的生产管理和质量检测，根本上保证不同批次的填料具有相同的分析结果。从而解除用户购买不同批次色谱柱不能实现相同分析效果的顾虑，减少用户售后服务。我们随机选取了5个不同批次的填料，测试结果表明：5个批次的填料在选择性方面性能保持一致，具有优秀的批次重现性。 Luster&trade C18&mdash 超高性价比通用型反相色谱柱兼具优异的分离性能与低廉的价格产品优势，适合常规分析及QC检测，助您的分析工作一臂之力！

万物更生，新岁开启，春天沐浴温暖的阳光 ，正是踏青好时节，赶快拿出相机记录美好时光。今天让我们来讲讲新手如何选择高质量的镜头？镜头的透过率直接决定了成像质量的高低，因此，评价镜头的透过率至关重要。数码单镜头反光式相机即我们所说的数码单反相机，利用单个镜头反光进行取景。相比普通相机，其优势是可以更换不同种类的镜头，满足不同的拍摄需求，以数码数据的格式记录成像。▼镜头反光进行取景▼- 本次测量了长焦镜头和镜头保护滤镜的透过率 -看看它们的表现如何吧？▼-01-应用数据样品：长焦镜头、镜头保护滤镜仪器条件：UH4150紫外-可见-近红外分光光度计、大镜头测量附件、透射支架（紧密贴附）▼镜头测量附件和透射支架▼使用大镜头测量附件分析长焦镜头，附件可以按照下图（1）所示进行上下移动，（2）进行前后移动，因此大镜头测量附件可以轻松调整样品位置。▼镜头测量示意图▼镜头保护滤镜是用来保护数码单反镜头，或给图像增添特殊效果或颜色的，通过使用紧密贴附类型的透射支架可以测量滤镜向各个方向扩散的透射光束，如图所示。▼镜头保护滤镜测量示意图▼测量结果表明，长焦镜头在可见光区具有85%的透过率，而镜头保护滤镜在可见光区的透过率高达95%。如图所示。▼透过率光谱▼-02-总结长焦镜头由多个镜头和多层镜片组成，UH4150紫外-可见-近红外分光光度计具有优异的平行光束性能，是长焦镜头等长光路样品测量的优良选择。另外紧密贴附透射支架能够捕捉来自各个方向的透射光，确保透过率的准确测量。END公司介绍：日立科学仪器（北京）有限公司是世界500强日立集团旗下日立高新技术有限公司在北京设立的全资子公司。本公司秉承日立集团的使命、价值观和愿景，始终追寻“简化客户的高科技工艺”的企业理念,通过与客户的协同创新，积极为教育、科研、工业等领域的客户需求提供专业和优质的解决方案。 我们的主要产品包括：各类电子显微镜、原子力显微镜等表面科学仪器和前处理设备，以及各类色谱、光谱、电化学等分析仪器。为了更好地服务于中国广大的日立客户，公司目前在北京、上海、广州、西安、成都、武汉、沈阳等十几个主要城市设立有分公司、办事处或联络处等分支机构，直接为客户提供快速便捷的、专业优质的各类相关技术咨询、应用支持和售后技术服务，从而协助我们的客户实现其目标，共创美好未来。

将极性官能团嵌入烷基链中的液相色谱固定相是在上世纪90年代早期推出的，它具有的一个最大优势就是减少了填料表面游离硅烷基与碱性分析物之间的次级相互作用，从而改善了分析碱性化合物所得到的峰形。 传统的极性嵌入反相色谱柱，是将氨基酰氯基团键合在硅胶表面，这种键合方式，会造成硅胶表面有残留的氨基。残留的氨基呈现碱性特性，分析酸性物质（如有机酸）时，会造成峰形拖尾。月旭科技采用独特的键合工艺，解决了传统工艺硅胶表面氨基残留的问题，同时采用双封尾技术，进而可以得到极佳的对称峰型。Ultimate Polar-RP色谱柱——与普通C18选择性不同的反相柱比AQ柱耐相塌陷能力更强的水性柱。 极性基团的嵌入，使烷基相在流动相中有机相比例极低时（甚至100%水流动相时）也能被水溶剂化润湿，不会发生相塌陷现象。对极性物质的保留和选择性更佳。保留方面增强的例子如尿嘧啶，因为其不在大多数反相柱上有保留，通常用作死体积的标定试剂。但Polar RP柱，在100%水流动相条件下，尿嘧啶是有保留的，出峰时间甚至在5-氟胞嘧啶和胞嘧啶之后。 测定酸性化合物时，可以得到完美的峰型。由于酸性物质大部分都是极性物质，Polar-RP的极性基团对其有很好的保留，所以可以得到很好的分离和峰形。 与其它厂家同类型色谱柱测试酸性化合物得到的谱图对比 测定碱性化合物时，可以得到完美的峰型。由于极性嵌入基团把硅胶表面的残余硅醇基屏蔽掉了，所以可以得到对称的峰形。

p 继2017年佛罗里达州奥兰多市举行的Pittcon 2017会议，本期“Column Watch”旨在涵盖会议之后商业发布的色谱柱及其附件。LCGC在2018年初再次发布了一份调查报告，要求供应商提供在Pittcon 2017年之后推出的所有产品。其他领域如气相色谱(GC)、仪器和样品制备也会在本文中介绍。因为这篇文章的信息是在几个月的时间里偶然获得的，所以很可能有些信息被遗漏。我们鼓励读者查看特定的供应商网站，以获得更多的产品和更详细的信息。 /p p 　　供应商搜罗高效液相色谱法(HPLC)和超高压液相色谱(UHPLC)柱信息如图1。产品范围涵盖较广，从使用多孔柱填料的传统反相色谱柱到为特殊分离技术设计的超临界流体色谱(SFC)。本讨论围绕着几类液相色谱柱进行。随着小分子反相色谱柱、亲水相互作用色谱(HILIC)柱和手性色谱柱继续推出，因此分别进行讨论。运用于大分子(包括蛋白质、多肽和氨基酸)反相色谱分析的色谱柱构成另一类别。本文还分别讨论了大分子和小分子色谱分析的替代方法，如离子交换、凝胶排阻或凝胶渗透以及超临界流体色谱。最后介绍了纳米和微分离技术的新进展。基于2016年和2017年的报告在文章中预测了以后的发展趋势。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.gif" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/c3c3a161-6e7c-4045-bf27-ceda3b70f8a7.gif" / /p p style=" text-align: center " 小分子反相色谱柱 /p p style=" text-align: center " img title=" 10.gif" alt=" 10.gif" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/06ee954a-594d-4a01-8762-b8f8fe5dd324.gif" / /p p style=" text-align: center " br/ 亲水相互作用色谱(HILIC)柱 br/ img title=" 3.gif" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/aa286ae2-cd83-421a-aa38-0139332a57b0.gif" / br/ 手性色谱 /p p style=" text-align: center " img title=" 5.gif" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/1ca4cfa3-88d8-4914-8bb2-6028e2da8232.gif" / br/ br/ 大分子反相色谱 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.gif" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/f230121d-b22e-4e3a-b95c-9ecbf4defae5.gif" / /p p 　　 /p p 　　 /p p & nbsp /p

迪马科技作为全球领先的色谱消耗品制造商，多年来其色谱产品一直是高品质的典范，Inspire、Platisil系列色谱柱更是其中的佼佼者。 迪马科技全新推出InspireTM HILIC、InspireTM Diol系列，PlatisilTM NH2、Platisil&trade CN、 PlatisilTM Silica、PlatisilTM PH系列色谱柱。此次推出的新产品极大地丰富了迪马自有品牌的产品线，为广大用户提供更多种键合相的液相色谱柱产品选择，满足更多强极性、亲水性化合物等的检测需求。 新品一：InspireTM HILIC InspireTM HILIC柱采用了极性改性的固定相，能够在其表面形成一层富水层，从而增强了对一些强极性化合物的保留能力，有效地克服了反相色谱柱对该类化合物保留能力差的缺点。与传统的反相色谱柱不同，InspireTM HILIC柱只需要流动相中含少量的水，即可实现对强极性化合物的保留，而有机相的增加有利于提高对化合物的检测灵敏度，特别是对于小内径色谱柱而言。 &bull 独特的选择性，适用于强极性化合物的分离分析 &bull 提高对亲水性、极性化合物的检测灵敏度 &bull 增强了对强极性化合物的保留能力 &bull 快速高通量分析，提高工作效率 &bull 优异的批次重现性 &bull 适合于分离亲水性和极性化合物、氨基酸、多肽、水溶性维生素、药代谢物 咖啡因代谢物 色谱柱 如图所示 规格 150 × 4.6 mm, 5 &mu m 流动相 乙腈:10 mM 甲酸铵(pH 3.0) = 95:5 流速 1.0 mL/min 温度 室温 检测器 UV 254 nm 样品 1. 茶碱 2. 3-甲基黄嘌呤 3. 7-甲基黄嘌呤 4. 1,3-二甲基尿酸 了解更多 新品二：InspireTM Diol InspireTM Diol柱以高纯硅胶为基质，采用了Dikma独有的键合技术，使其在水相介质中更为稳定和耐用。InspireTM Diol柱可同时适合正相、反相和亲水作用色谱(HILIC)。Diol固定相与未经键合的硅胶相比，极性稍弱一些，可以提供适度的正相保留能力，具有优异的选择性；同时其表面很容易被水润湿，形成富水层，可用于HILIC模式下强极性化合物的分析分离。 &bull 二醇基基团键合在高纯硅胶基质上 &bull 高性能硅胶以及特殊的键合技术，使二醇键合相在水相介质中稳定不流失，从而延长柱寿命 &bull 适用于正相、反相和HILIC三种分离模式 &bull 二醇基极性弱于未修饰硅胶表面的硅醇基，提供适度的正相保留能力 &bull 独特的选择性，适用于亲水性极性化合物分析分离 &bull 制备色谱中溶剂易于挥干 类固醇 色谱柱 如图所示 规格 150 × 4.6 mm, 5 µ m 流动相 A相：Hexane B相：CH2Cl2:MeOH = 80:20 A:B = 80:20 流速 2.0 mL/min 温度 室温 检测器 UV 254 nm 样品 1. 11-酮孕甾酮 2. 孕酮 3. 醋酸可的松 4. 皮质酮 5. 醋酸泼尼松龙 6. 可的松 7. 波尼松 8. 氢化可的松 9. 地塞米松 10. 泼尼松龙 了解更多 新品三：PlatisilTM NH2 PlatisilTM NH2柱采用了独特的氨基键合技术，有效地减少了氨基键合相的水解，具有增强的稳定性和柱寿命。其表面的氨基基团会与其他含氢键化合物(如糖类化合物)发生氢键作用力，无论是在正相、反相或离子交换条件下，均可实现对该类化合物出色的保留和选择性。 &bull 独特的氨丙基硅烷键合技术，增强的稳定性和柱寿命 &bull 多重保留机理，同时适用于正相、反相和离子交换分离模式 &bull 适用于反相模式下分离亲水性和极性化合物，如碳水化合物和单糖、寡糖、糖醇等糖类化合物；正相模式下分离烃类化合物和维生素A和D 水溶性维生素 色谱柱 如图所示 规格 150 × 4.6 mm, 5 &mu m 流动相 乙腈:25 mM 磷酸二氢钾(pH 2.5) = 70:30 流速 1.0 mL/min 温度 室温 检测器 UV 254 nm 样品 1. 维生素B2 2. 维生素B3 3. 维生素B6 4. 维生素B1 了解更多 新品四：Platisil&trade CN 相较于传统的反相色谱柱(如C18、C8)而言，PlatisilTM CN柱的疏水性更弱一些，对于一些在C18和C8柱上强保留的化合物，无需调整有机相比例，即可实现快速分离。PlatisilTM CN柱具有多重保留机理：其表面的氰基基团会与极性化合物产生较强的偶极-偶极作用，而丙基链会提供疏水性作用，使其具有独特的选择性，能够拓宽色谱应用的范围。此外，PlatisilTM CN柱可同时应用于正相色谱和反相色谱，方便色谱工作者方法的选择和开发。 &bull 氰丙基二甲基硅烷高密度键合在高纯硅胶基质上 &bull 具有独特的选择性 &bull 快速分离疏水化合物、不饱和化合物和极性化合物 &bull 适用于正相、反相和HILIC三种分离模式 &bull 优异的批次重现性和稳定性 &bull 比硅胶柱平衡快，不易污染，对水不敏感 PlatisilTM CN柱与常规C18柱选择性和保留对比 色谱柱 如图所示 规格 150 × 4.6 mm, 5 &mu m 流动相 甲醇:水 = 65:35 流速 1.0 mL/min 温度 室温 检测器 UV 254 nm 样品 1. 尿嘧啶 5. 丁基苯 2. 咖啡因 6. 戊基苯 3. 苯酚 7. 邻三联苯 4. 甲苯 8. 苯并菲 了解更多 新品五：PlatisilTM Silica PlatisilTM Silica柱是以纯度为99.999%的高纯多孔球形硅胶为基质，金属杂质总含量小于5 ppm，颗粒表面光滑、粒径孔径分布均匀、球形对称度好，加上迪马科技独有的填装工艺，使得该色谱柱具有高柱效、高稳定性、低柱压等特点。 &bull 由99.999%的高纯度多孔球形硅胶填装而成 &bull 极低的金属含量和酸性 &bull 高机械强度和稳定性 &bull 适合于异构体和弱酸性化合物的分离 &bull 优异的批次重现性 邻苯二甲酸酯类 色谱柱 如图所示 规格 150 × 4.6 mm, 5 &mu m 流动相 A相:Hexane B相:CH2Cl2:MeOH = 80:20 A:B = 95:5 流速 1.0 mL/min 温度 室温 检测器 UV 254 nm 样品 1. 邻苯二甲酸二辛酯 2. 邻苯二甲酸二丁酯 3. 邻苯二甲酸二丙酯 4. 邻苯二甲酸二乙酯 5. 邻苯二甲酸二甲酯 了解更多 新品六：PlatisilTM PH PlatisilTM PH柱适用于反相色谱模式下芳环类化合物和极性化合物的分离，其保留特性类似于反相C8柱，但疏水性更弱一些。由于表面苯基基团的双键作用（&pi -&pi 键相互作用），使其具有独特的选择性，能够拓宽色谱应用的范围，方便色谱工作者方法的选择和开发。此外，PlatisilTM PH柱采用了高密度键合和独有的封端技术，使得柱子的稳定性和寿命大大增加。 &bull 苯基基团键合在高纯硅胶基质上 &bull 表面的&pi -&pi 键相互作用，使其具有独特的选择性 &bull 高密度键合和独有的封端技术增强了柱子的稳定性 &bull 疏水性弱于C8柱，可对一些疏水性化合物提供更快速分离 &bull 优异的分离度和批次重现性 &bull 适用于极性化合物、芳环类化合物和异构体的分离 苯胺类 色谱柱 如图所示 规格 150 × 4.6 mm, 5 &mu m 流动相 甲醇:水 = 60:40 流速 1.0 mL/min 温度 室温 检测器 UV 254 nm 样品 1. 苯胺 2. 邻甲苯胺 3. -甲基苯胺 4. 2-乙基苯胺 5. -乙基苯胺 6. , -二甲基苯胺 7. , -二乙基苯胺 了解更多

2017年5月19-21日，两年一届的全国色谱学术报告会及仪器展览会在金城兰州胜利召开。作为国内学术水平最高的色谱行业会议，此次展览会吸引了近千名全国各地色谱领域的专家和学者参与其中。迪马科技——全球领先的色谱消耗品制造商与供应商携多款产品参展，同与会色谱分析工作者共享色谱盛宴。第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会开幕式亮点一：色谱柱新品备受关注此次展会，迪马科技特别展示了Inspire苯基系列液相色谱柱，产品包括Inspire PFP、Inspire DP、Inspire Phenyl和Inspire Phenyl-hexyl四个键合相。该系列色谱柱利用π-π键相互作用，使其具有独特的选择性，适用于反相色谱模式下芳环类和具有不饱和键化合物、极性化合物和异构体的分离，因而能够拓宽反相色谱的应用范围，方法开发更加简单易行。新产品：Inspire 苯基系列液相色谱柱亮点二：展示消耗品种类齐全除新品Inspire苯基系列液相色谱柱外，展会上迪马科技还展示了Endeavorsil(奋进)、Leapsil(飞跃)、Diamonsil(钻石)、Spursil(思博尔)、Platisil(铂金)等液相色谱柱；DM系列气相毛细柱；ProElut系列样品前处理产品及通用色谱消耗品等，产品琳琅满目，吸引众多专家学者驻足、咨询。行业专家，色谱分析工作者莅临迪马科技展台亮点三：会议论文频现迪马产品大会墙报展示区，迪马科技投稿的两篇论文《QuEChERS-气相色谱-质谱法测定食用调和油中多种农药残留量》、《固相萃取-液质联用测定粮谷和食用油中5种黄曲霉毒素》在P-236、P-239展示，同时在其他色谱分析工作者的墙报中也频繁出现迪马科技产品的身影。会议论文频现迪马产品亮点四：互动游戏奖品丰富迪马展台，与会者除可零距离接触各种迪马色谱消耗品外，还可参与“扫一扫，关注有礼，100%中奖”互动活动。 一等奖：小米手环（6名），二等奖：便携防水可折叠皮肤包（15名），谢谢参与奖：洗漱包（30名）。奖品诱人，吸引与会者纷纷拿出手机“扫一扫”。扫一扫，关注有礼，100%中奖 5月22日上午，第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会完美落幕，与会的色谱分析工作者收获满满的离开了美丽的兰州。此次展会上，迪马科技也收获了无数的期许、关注和赞扬，在未来的发展之路上，“优秀的产品、合理的价格、完善的服务”将一直是迪马科技秉承的经营宗旨，为色谱分析工作者保驾护航！

今天，小编继续给大家带来液相色谱你问我答第五弹~1那怎么才能避免拖尾呢？答：首先我们需要找到产生拖尾的原因，拖尾通常由以下几个原因造成：柱外接口体积扩大、柱床污染以及被分析物与键合活性位点相互作用而产生的，这就需要根据不同原因来分别对待处理。2怎么检查拖尾的原因？答：首先要仔细观察色谱图，在不知道样品性质和色谱条件的情况下，色谱图可以提供很多线索，再借助其余的条件来验证基于色谱图的猜想。第yi检查峰高，观察色谱柱是不是在此色谱条件下过载了，为了确认是否真的过载，可以再进1/10 浓度的样品看看峰型是否有改善。如果低浓度下依然拖尾，再观察色谱图，如果色谱中有很多峰，看各个峰型是保持一定的拖尾程度还是随着时间推移峰型有一致的变化趋势，如果图谱中前边的峰比后边的峰拖尾的更厉害，可以考虑柱外效应的影响。如果色谱图中所有峰的拖尾程度一致，那么有两个可能：1）柱床损坏，2）是图谱中所有样品组分化学结构类似，拖尾是因化学效应产生的。3哪些物质会产生这些化学效应，能说明下吗？怎么解决？答：化学效应有好几种，最常见的就是分析物与不均一的活性表面的相互作用。典型的就是碱性化合物在反相柱中的拖尾，通常带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性或碱性基团的化合物能与填料表面残留的硅羟基和键合相发生次级吸附作用，进而产生拖尾。解决途径： 1）分析碱性化合物可以在流动相中添加三乙胺(TEA)作为减尾剂，TEA与碱性化合物竞争结合硅羟基，用于消除分析物与残留硅羟基间的相互作用。2）酸性化合物拖尾则需要降低流动相的pH值，尽量使酸质子化，可以通过向流动相中加入竞争的有机酸，如使用0.1%三氟乙酸 (TFA) 得到了比较好的结果，并且这种添加剂具有比较低的紫外截止波长。3）提高流动相中缓冲盐的浓度，抑制离子作用。4）在流动相中添加离子对试剂，反相流动相中一般加入0.003-0.01mol/L的离子对试剂，改善峰型和增加化合物保留。5）选择高纯硅胶色谱柱和彻底封端柱，例如：月旭Ultimate® Polar-RP，Xtimate® C18 等。4但我在有些色谱图中，会看到色谱峰前沿，是什么会导致前沿呢？答：首先我们也需要找到前沿的原因，前沿通常有以下几个原因：柱外体积、柱床污染以及溶剂效应。这就需要我们通过观察色谱图来查找原因进而解决问题。当然过载的情况，我们也是通过降低样品浓度来验证，如果低浓度依然前沿，再观察色谱图，如果色谱中有很多峰，所有峰，看各个峰型是保持一定的前沿程度还是随时间前沿峰型有一致的变化趋势，如果图谱中前边的峰比后边的峰前沿更厉害，可以考虑柱外效应或溶剂效应的影响。如果色谱图中所有峰的前沿程度一致，那么可能是柱床损坏或图谱中的样品物质性质导致。5怎么解决峰前沿呢？答：1）溶剂效应导致的峰前沿，在反相LC中，如使用100%有机溶剂或100%强溶剂，大体积进样时，将使色谱峰过早洗脱出色谱柱，导致峰变形，可以用峰形前沿抑制器来避免这个问题。在液相色谱中用溶于流动相的小体积进样最为理想。或者用流动相或与流动相极性差不多的溶剂溶解样品，如果一定要使用强溶剂溶解，那需要减少进样体积。2）柱外效应导致的峰前沿，我们需要减少仪器系统的死体积，进而解决前沿现象。3）对于样品性质导致的峰前沿，可以考虑增加流动相中缓冲盐的浓度，而增加流动相中的离子强度，减少因静电的作用引起的前沿，或者在流动相中加适量的四氢呋喃（通常加入的量在5%内即可），当然升高柱温也是一个不错的选择。4）色谱柱涡流填料产生的空隙使流动相及溶质的流速比平均流速移动更快，从而导致峰拖尾或前伸。空隙产生的原因是填充不当，或填充柱床塌陷。5）假前沿两个物质未分离开，但出现一定的分离趋势。峰前沿案例分析：C18，流动相是水－甲醇（55：45），做出来的对照品和样品峰都前延?1）样品是否过载。降低进样浓度，看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。2) 检查是否是用流动相溶解样品。溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相强会发生峰前延。具体机理是：正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。样品溶液进样后到达色谱柱时间很短，应还未被流动相充分稀释，洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在，将使部分样品被洗脱的速度加快，导致峰前延。3）增加流动相中缓冲盐的浓度。增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前延。4）流动相中加入适量的四氢呋喃。往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入的量在5％以内即可，需要的时候可以加入更大的量。 6液相色谱柱应该如何活化?答：对于液相色谱柱而言，每根色谱柱在装运之前都经过了测试，并存放在测试洗脱液中进行运输。因此，在首次使用时，反相柱建议80%的甲醇使用检测样品1/2的流速冲洗4小时，再用流动相彻底地平衡色谱柱即可进样分析。如果使用流动相添加剂（如缓冲液或离子对试剂），建议使用含原有比例但不含这些添加剂的流动相进行中间过渡10至20个色谱柱体积再更换成分析样品流动相。对于具有较短化学链（例如C8、苯基、CN）键合相的色谱柱，应小心确保在使用色谱柱之前对其进行彻底的平衡。这样可确保重复性，并有助于防止保留时间的漂移。正相溶剂和反相溶剂是不互溶的，这一点不能忽略。对于新购柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂与你将要使用的流动相不互溶，请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因异丙醇粘度较大，会导致柱压升高，适当调低流速。如果流动相中含有缓冲盐类，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，避免缓冲盐的析出。7我在使用氨基柱分析糖类物质时，为什么目标物的保留时间会不稳定，逐渐前移呢？答：这是由氨基柱的特性造成的，因为氨基柱在分析糖类时，典型的流动相是60%~90%的乙腈水混合液，当在使用过程中，填料空隙处高浓度的氨基基团显碱性，导致硅胶和键合相缓慢的水解，随着时间的推移，脱落的键合相越来越多，就会导致目标物的保留时间发生变化，同时这也是氨基柱在反相条件下寿命变短的原因。8色谱柱压力高答：色谱柱压力升高是液相工作者们在实际应用过程中较为常见的问题，首先考虑“堵”。压力升高的主要原因总结为以下几点：1. 色谱柱入口筛板堵塞；2. 样品或流动相缓冲盐在色谱柱内析出；3. 色谱柱污染；4. 流动相粘度过高；5. 在线过滤器或者保护柱堵塞；6. 管线堵塞；7. 聚合物色谱柱：溶剂改变导致溶胀。解决途径：1．用标准流速的1/4流速反冲色谱柱，不接检测器，去除筛板堵塞物。（除1.8µm粒径色谱柱外）2．尽量选用流动相做样品溶剂，减少样品析出的可能。尽可能降低流动相中盐的浓度。使用带盐的流动相后，应使用与流动相中盐相等比例的超纯水和有机相冲洗色谱柱10到20柱体积，再保存在适宜的溶剂中。3．色谱柱污染，需要对色谱柱清洗再生。4．尽量选择粘度小的溶剂做流动相，或者升高柱温。5．检查在线过滤器滤头以及保护柱柱芯，必要时更换。6．拆卸管线以便确证，必要时更换。7．对于聚合物基质的色谱柱，需要了解溶剂兼容性信息。 9色谱柱压力低?答：色谱柱压力降低，首先考虑“漏”。压力升低的主要原因总结为以下几点：1. 溶剂进口过滤芯堵塞；2. 连接管路泄漏或其他备件（泵头密封垫）；3. 溶剂或流速改变；4. 泵入口阀失灵；5. 泵出口阀失灵；6. 色谱柱失效，固定相流失。解决途径：1、检查各管路及密封垫等备件；2、更换色谱柱；3、检查色谱条件是否改变；4、检查泵流量准确。10液相的死体积和延迟体积?答：1）死体积指的是有效进样点到有效检测点之间排除色谱柱中包含固定相部分的体积。包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他 3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。2）延迟体积延迟体积指的是溶剂混合点（通常在液相色谱仪的混合腔内或比例阀中）与LC柱头之间的体积。

色谱柱“早衰”——寿命太太太太短我们都知道，液相色谱柱是耗材，一般一根色谱柱能使用500–1000针进样或者更多，色谱柱的成本只占总分析成本的几个百分点（其它分析成本还有：仪器折旧、溶剂采购和处置成本、制样成本以及人工成本）。除了简单冲洗外，任何其它修复一根已不能用柱子的努力，通常都不合算的。然而，一根新柱子，使用50针进样寿命毕竟还是太短了，值得花点时间解决这个问题。比如我们下面这个例子：”采用某B型硅胶 C8 柱在40 °C下进行梯度分离，从甲醇/水到THF/水变化，流动相中含0.05% 三氟乙酸，并使用了保护柱。分析物是聚合物提取物中的hindered胺，溶于甲苯而在甲醇中沉淀，进样前所有样品都经过过滤。待测物没有UV吸收，使用了氮化学发光检测器，流动相不能含氮，所以不能用乙腈。进样约50针后，胺的色谱峰消失了，峰消失的速度某种程度上取决于样品基体中所含聚合物的类型, 酸性聚合物最糟糕。连续试了4-5根色谱柱，都发生了同样情况。使用者认为是聚合物随时间的推移在色谱柱上积聚并不可逆地将胺粘在色谱柱内。用THF或二氯甲烷冲洗柱子，或者更换保护柱都不解决问题。他推测用强酸冲洗柱子会有用，但又担心这样对柱子带来永久性的损害。"常规上，普通的反相色谱清洗步骤是：先用50ml流动相中的水相连续冲洗，然后用100% 乙腈冲洗；如果不奏效，则再用二氯甲烷冲洗，对清除疏水污染物有用。用二氯甲烷冲洗后，在使用水性流动相前，必须再用乙腈冲洗确保去除残留的二氯甲烷。（如果你知道用某种特定的溶剂能溶解样品组分，去试试也无妨，只要记住清洗溶剂序列中，当次用的溶剂必须能完全溶解在前一次用的清洗溶剂中。 ）一般硅胶基质色谱柱pH耐受范围是 2–8，但短时间冲洗，流动相pH可大大超过这个范围。Dolan（John Dolan, LCGC专栏编辑）曾故意用10ml近饱和NaOH溶液冲洗，试着去破坏一根色谱柱，但发现并没有对色谱柱造成多大伤害。用低pH或高pH值清洗剂冲洗色谱柱往往能去除一些在色谱柱强保留的污染物。Dolan推荐的清洗离子对试剂的配方：100 mL浓度为200 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）, 与甲醇 50:50混合。使用这种混合物特别有效果，不过使用时须注意缓冲盐析出，清洗之前和清洗之后，需用不含缓冲盐的50:50甲醇/水过渡。考虑到酸性聚合物吸附在色谱柱上的情况和离子对试剂类似，本案例，Dolan建议先试着用几种不同溶剂冲洗。据Dolan的几十年色谱经验，仅用溶剂冲洗是不会伤害到色谱柱的。选择最可能溶解这种聚合物的溶剂，然后试着用强酸碱流动相冲洗，如 0.2%三氟乙酸或者0.1M的NaOH。还不行，再考虑上面建议的冲洗离子对试剂污染的方法。好的是，柱子已经损坏了，可以试验各种不同清洗方法而不用担心进一步伤害柱子，只要注意清洗时不能连接流通池。本案例中，用户通过试验找到了恢复色谱柱性能的洗柱方法，先用了二氯甲烷和0.2%三氟乙酸的混合物冲洗色谱柱，去除了部分污染物，大约恢复了一半的胺色谱峰信号。然后用0.2%三氟乙酸和甲苯溶剂冲洗，100%的胺色谱峰得到了恢复。根本的解决方案，在方法中把用0.2%三氟乙酸/甲苯清洗色谱柱结合进去，每批进样结束后都进行一次这样的洗柱。结论：反相色谱保留机制中，除了疏水作用外，还存在多种其它作用，而残留硅醇基的作用对反相色谱的选择性中扮演重要角色，很多在硅胶基质反相色谱柱上能很好分离的应用，在聚合物基质色谱柱就很困难或根本分不开。 本文编译自《LCGC》杂志JohnDolan的专栏文章编译：姚立新 纳谱分析技术（苏州）有限公司 总经理曾任国内知名色谱耗材公司的联合创始人及副总经理，成功开发过多系列的色谱耗材产品并实现其规模化生产和销售。拥有7项已授权的中国国家发明专利，发表论文20余篇。熟知国内色谱耗材市场行情和发展趋势，在该领域有十多年的市场营销管理经验。

沃特世公司推出的SunFire C 18和C8 色谱柱为行业内的硅胶基质反相C 18 和C8 柱建立了性能新标杆，沃特世公司多年来在填料颗粒合成和键合封尾技术的研究及在柱产品开发方面的努力，造就了SunFire色谱柱的卓越性能。而这些性能，完美符合今天食品安全检测技术的特点与需求。 普遍优异的峰形 中 -低pH条件下对各种化合物普遍具有极佳峰形，适用于多组分残留检测 高容量设计 特别适用于痕量组分分析，耐受高进样量而不容易出现过载问题 优异柱效与分辨率 特别有利于样品基质相对复杂的食品安全检测，包括多组分残留检测 多种粒径与柱规格 粒径2.5，3.5，5µ m，柱内径范围1.0-4.6mm，柱长度20-250mm，适用于各种分析需要。窄内径可直接适配MS 检测器而无需分流。小粒径与短柱长，可帮助色谱工作者获得更高的灵敏度与更高的分析通量。不同柱规格之间，方法转移轻松自如。 优异的质谱兼容性 因其出色的颗粒合成技术与键合/封端技术，即使使用低离子强度条件（如0.1%甲酸条件），仍能获得对碱性分析物的良好峰形，而不容易出现鲨鱼鳍似的过载峰，确保了分离度与灵敏度，这尤其适用于以LCMS检测平台为主的食品安全检测。 其出色的低pH条件下的稳定性，确保了使用LCMS技术时不受键合相流失的背景噪音困扰，以及更稳定耐用的色谱柱使用寿命。 对杀真菌剂多组分残留的检测 苯并咪唑类（Benzimidazoles），如涕必灵（Thiabendazole），是常规用于保护水果以及蔬菜的杀真菌剂。但是对这些物质进行液相分析通常比较麻烦。例如，涕必灵，在大多数反相硅胶色谱柱上，会显示出明显的拖尾,特别是当分析在酸性pH条件下进行时。涕必灵和多菌灵（Carbendazim）用pH 10条件在沃特世杂化颗粒技术色谱柱如XTerra ® MS C 18柱上会得到很好的保留和峰形；但是高pH条件不适合于其他种类的杀真菌剂组分的同时检测，例如，硫菌灵（Thiophanate）和甲基硫菌灵（Thiophanate Methylate），它们是氨基甲酸酯类杀真菌剂，在高pH流动相中不稳定，如使用高pH条件进行检测时将被漏检或检测浓度不准确。 使用SunFire TM C 18色谱柱，在低pH条件如pH 3.7，可以对所有这些杀真菌剂分析物都得到极好的保留与峰形。可以看到，使用pH3.7条件对涕必灵和多菌灵进行等梯度分时，10%峰高处的拖尾因子仅为1.2，可以与XTerra ® 色谱柱在高pH条件下所得到的峰形相媲美。而这一结果,是其他硅胶C 18柱在相似条件（低pH）下很难匹及的。 测试条件 SunFire™ C18： 2.1x100mm，3.5um，PN 186002534 流动相A： 水 流动相B： 乙腈 流动相C： 500mM甲酸铵缓冲液（pH 3.7）梯度或等度条件如谱图说明所示 柱温：30℃ 仪器：Alliance 2695，Waters ZQ MS 质谱条件： 锥孔电压25V，ESI+模式（源温度120℃，去溶剂化温度350℃） 分析物 母离子[M+1]+ 多菌灵（Carbendazim） 192 涕必灵（Thiabendazole） 202 甲基硫菌灵（Thiophanate Methylate） 343 硫菌灵（Thiophanate） 371 腈菌唑（Myclobutanil） 289 丙环唑（Propiconazole） 342 SPE条件 3cc Oasis MCX小柱 活化与平衡： 1mL甲醇润洗，1mL水平衡 上样： 样品溶液用甲酸调节至PH3，以5mL/min速度上样 清洗：1mL 20:89:1 甲醇/水/浓氨水 洗脱：2mL 2%氨水甲醇 因氨基酸酯类在碱溶液中不稳定，将洗脱液挥干，用流动相溶解

“岛津云学院”系列开播以来，得到了众多用户的观看和支持。在直播互动交流中，收到了很多提问，岛津十分重视各位用户提出的问题，今天将开启岛津云学院答疑系列，为大家作详细解答！ ★请问老师一般液相废液怎么处理？答：需要明确的是，液相色谱的废液中含有大量的有机溶剂以及所测试的样品，大部分情况下是有毒有害的，因此不能直接倾倒至环境中，或者流入实验室下水道中，需要集中处理。一般而言，可以根据不同的情况进行处理：1、如果废液量较少：如分析型色谱的废液，可先行收集，然后等待集中处理（尤其是含有剧毒成分的），比如寻找专业的废液回收机构；如果所在单位/机构不支持集中处理，则可以找安全的地方焚烧或填埋（含酸的需用废碱中和，含盐的可以直接倒掉）。2、废液量很大：如制备色谱的废液，则考虑通过精馏系统，将废液分馏后再次使用。3、也可以通过“循环阀”，将未污染的流动相再次回收利用。如岛津针对分析型液相和制备型液相都可以提供相应的“溶剂循环阀”，将分析过程中未受到污染的流动相，如色谱峰之间平直的基线（仅限于等度条件下）回收至溶剂瓶中，将能够大大提升溶剂使用效率，降低实验室成本。 ★新买色谱柱如何进行测试？答：对于液相色谱柱来讲，拿到一根新的色谱柱，先测柱效、拖尾因子、柱压（减去系统压力），并记录结果。之后使用过程中应定期测试，追踪色谱柱性能。因不同类型色谱柱差别较大，因此对于所使用的方法，请根据说明书上的液相条件和测试样品进行，同时需要确保仪器的状态正常。 ★色谱柱用什么冲洗？答：反相与正相体系清洗方式有所不同： 反相色谱柱1、日常清洗：10%甲醇水（去除极性大的杂质）→纯甲醇（去除非极性杂质）。2、流动相中含有离子对试剂：50%有机溶剂（10倍柱体积）→10%有机溶剂（20倍柱体积）→100%有机溶剂（20倍柱体积）→保存。3、生物样品（蛋白质/多肽）污染的色谱柱：B 5% →B 100%的梯度洗脱×3次(A：0.1%TFA B：0.1%TFA in CH3CN)→100%有机溶剂（20倍柱体积）→保存。 正相色谱柱亲水性杂质吸附太强，常规清洗效果不明显，可以逐级增加洗脱强度，每级至少确保10倍柱体积。 I级：100%正己烷II级：100%乙酸乙酯III级：50%三氯甲烷-50%甲醇 注意：回归到最初流动相条件时，请务必先用异丙醇过渡。 ★用反相色谱的液相系统可以跑正相吗？刚刚老师提到用异丙醇冲洗管路，那我跑完反相的用异丙醇冲洗是不是就可以跑正相了？答：一般来讲，当把一台液相色谱仪即当作正相色谱用，也当做反相色谱用的时候，在两个不同分析模式之间切换时需要用异丙醇做充分的过渡（比如通宵低流速异丙醇冲洗管路），其主要是利用异丙醇可以分别与正/反相溶剂互溶的特性，避免流动相残留造成的影响。但有一点需要注意的是，所使用的液相色谱仪是否适用于正相溶剂。通常液相色谱仪的主要设计目的是适用于反相体系使用，因此在使用正相体系前，最好与供应商确认，尤其是使用特殊溶剂前（如HFIP，DMF等）。 如您还有其他关于液相色谱的疑问，请扫描以下二维码提交问题，小编会把问题交给讲师解答，答案将在后续答疑系列中推送，敬请留意。?相关精彩岛津配合防疫，开启线上学习司小令大讲堂！司小令大讲堂丨第二期 流动相中产生气泡所引起的问题卫健委《消毒剂使用指南》解读和应对-色谱篇岛津LC助力消毒用品及输液器具检测全面“正偏离”——岛津液相色谱仪全优迎接新版液相色谱仪国家标准发布与实施

p style=" text-align: center " 　　 strong 液相色谱柱进展及其在药品标准中的应用(二) /strong /p p style=" text-align: right " strong 　　——液相色谱填料技术进展 /strong /p p 　　2　液相色谱填料技术进展 /p p 　　近年来，液相色谱填料技术的发展主要在于快速液相色谱分析、多种色谱固定相及各种分离模式的应用。 br/ /p p 　　 strong span style=" color: rgb(112, 48, 160) " 2.1　基于亚2微米填料的高效液相色谱柱技术 /span /strong /p p 　　范氏(Van Demeter)方程是一个描述线速度与塔板高度(柱效)关系的经验式。在范氏方程中，填料粒径大小是影响塔板高度的变量之一(图2)，因此，提高分离效能的有效方法之一是减小填粒粒径。较小粒径的填料有利于降低涡流扩散及改变传质路径，不仅使柱效更高，而且即使在较高的线速度下，理论塔板高度也不会增大，使色谱柱的分离性能得以保持，并有效地缩短分析时间和减少溶剂消耗，更加绿色环保。2000年前，人们专注于键合相类型的开发。2003 年，在匹兹堡展会(Pittcon 2003)上展出了1.8 μm 的ZORBAX STM(亚2微米，SB-C18柱)快速分析色谱柱，该色谱柱柱效是常规3.5μm 色谱柱的2倍，开启了液相色谱更高效快速分析的新篇章。同时，耐压能力达60 MPa甚至120 MPa的超高效液相色谱仪的逐步推出，使得采用小粒径色谱柱，通过提高流速加快分析速度，能有效提高分辨率和灵敏度，从而使得诸多复杂体系的分离成为可能。如今，以亚2 微米填料为填充剂的高效液相色谱柱(粒径1.6~2 μm)正在得到更广泛的应用，例如，使用1.8 μm 的C18 色谱柱分析《中国药典》2015 年版一部中的复方丹参滴丸指纹图谱，其时间可以控制在10 min 以内，见图3。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/a8b0d0bc-de94-48df-9863-f2b9db74950a.jpg" title=" 图2_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图2　理论塔板高度与色谱柱粒径的关系 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " /span /strong /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/29bf269a-5467-4844-9b2c-da972cb0bafa.jpg" title=" 图3_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图3　中国药典一部中复方丹参滴丸的高效液相色谱分析图谱 /span /strong /p p 　　中国药典对亚2 微米色谱柱技术革新和应用给予高度的关注，适时地修订了液相色谱法的相关内容。中国药典2015 年版四部通则0512 色谱法规定，若需使用小粒径(约2μm)填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配 如有必要，色谱条件也应作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。 br/ /p p 　　 strong span style=" color: rgb(112, 48, 160) " 2.2　表面多孔型填料技术 /span /strong /p p 　　表面多孔型颗粒填料(superficially porous particles，SPPs)又称核- 壳型填料(core shell particles)，商品化的产品有5μm的Poroshell 300 SB C18，该填料采用4.5 μm的硅胶实心内核，外面包裹一层0.25μm的多孔层，平均孔径为300 ，主要用于蛋白质和单抗的快速分析。由于表面多孔型填料具有极窄的粒径分布和扩散路径，同时可以减小涡流扩散，缩短传质路径和减弱传质阻力，即便使用较粗的填料颗粒也可获得较高的柱效。目前，一般使用亚3μm 的表面多孔型填料(2.6~2.7 μm)，即可获得亚2微米填料的柱效。这种颗粒一般采用1.7 μm 的实心核，外部为0.5 μm 厚度的全多孔层，它们具有亚2 微米全多孔填料色谱柱相当的柱效，而其柱压仅为亚2 微米全多孔填料的一半，见图2 中色谱柱柱效与颗粒粒径的关系。此类色谱柱一般操作压力在20 MPa 左右，故可以在耐压40 MPa 的普通液相色谱系统上运行，使得普通液相色谱仪实现高效快速分析成为现实。这种填料在过去5年里是液相色谱领域发展最快的一种填料类型，发展非常迅速，2010 年时只有3 家色谱厂商提供2.7μm 粒径的表面多孔型填料用于小分子化合物分析，2015年底则发展到了16家，键合相的类型超过了12 种，填料的粒径扩展为1.3、1.6、2.6、2.7、4 和5 μm，而生产用于大分子化合物分离的大孔径表面多孔型填料的厂商也增加到了9 家。 /p p 　　由于柱压与填料粒径的平方成反比，如图4 所示，在完成同一组化合物的快速分离时，相同柱尺寸条件下，2.7μm 表面多孔填料色谱柱的柱效与1.8μm 全多孔填料相当，而压力仅为亚2 微米填料的一半，这使得2.7 μm 的表面多孔型填料可以在普通高效液相色谱仪上实现超高效液相色谱的分析效率。故在近年的国际学术会议，包括2015 年12 月北京色谱年会上，讨论最多的话题也是表面多孔型填料。Ron Major 统计，在Pittcon 2014 上，关于SPP 的话题数量比亚2 微米填料的10 倍还多。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/2844cba5-fdd3-47a7-9b50-74c222a4a46f.jpg" title=" 图4_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图4　亚2微米全多孔填料与亚3 μm 表面多孔填料色谱柱分离结果和参数比较 /span /strong /p p 　　 strong span style=" color: rgb(112, 48, 160) " 2.3　整体化色谱柱填料技术 /span /strong /p p 　　整体化色谱柱(monolithic column)也是近年液相色谱柱填料研究的另一个重要方向。整体柱，又称为棒状柱，是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。与常规装填的液相色谱柱相比，整体柱具有更好的多孔性和渗透性，可以使用高流速实现快速的传质分离。聚合物整体柱一般采用离子交换或亲和色谱方式，用于生物大分子如蛋白、抗体、DNA 的超快速分析，这样的色谱柱包括Bio-Monolith 离子交换柱和Protein A、Protein G 亲和色谱柱，以及ThermoroSwift IEX 离子交换柱和ProSwift RP 柱。使用此类整体化色谱柱分析大分子物质时，分离通常可以在几分钟内完成。无机基质的整体柱一般采用硅胶以及在硅胶表面键合的反相填料，柱床中既有供流动相流过的粗孔(约2 μm)，又有便于溶质进行传质的中孔(几十个纳米)，如图5(来源于Merck 的目录资料)所示。市场上商品化的整体柱产品不多，如Chromolith sup & reg /sup 整体柱，该柱子具有非常低的柱压和较高的基质耐受能力，因此在普通高效液相色谱仪以及超高效液相色谱仪上都可以兼容。由于粗孔的存在，流动相流过整体化柱床时的压力非常低，这有利于提高流速来获得快速分析的结果，即使在9 mL· min sup -1 /sup 的流速条件下，最高压力也不会超过20 MPa。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/658e3259-e0e5-441f-97c1-a21ecf590ff8.jpg" title=" 图5_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图5　整体化色谱柱Chromolith sup & reg /sup 的表面电镜放大图 /span /strong /p p 　　 strong span style=" color: rgb(112, 48, 160) " 2.4　不同选择性的色谱固定相 /span /strong /p p 　　由于反相色谱分离基于多种作用力的结果，不同键合相或同一种键合相但不同的硅胶基质、封端技术和键合技术，其疏水作用、空间位阻、氢键作用、静电作用、π-π作用、偶极-偶极作用等能力不同，对化合物的分离能力不同，故而表现出不一样的选择性。比如，在碳链中嵌入极性的酰胺基团，不仅能够使键合相的水相兼容性增加，而且可以提高化合物与固定相之间的氢键作用能力，使之获得与普通C18 填料不一样的选择性。这样的色谱柱有ZORBAX Bonus RP 和Waters Symmetry shield 等。Huawei Gu等利用Bonus RP 色谱柱与其他常规碳链反相色谱柱选择性的不同，使用二维液相色谱实现复杂体系的分离。又如，苯基柱可以提供π-π 作用，用于含有苯环或能提供π 键作用的结构类似物分析 而五氟苯基(Penta Fluorophenyl Propyl，PFP)柱(则除了提供π-π 作用外，还可以提供偶极作用、静电作用等，提高了苯环上位置异构体的分辨能力。 /p p 　　一般硅胶基质填料的固定相其pH适用范围为2~8。为提高硅胶基质的填料键合相在酸性条件下的稳定性，一般在碳链的硅烷基侧链上采用大体积的有机基团进行保护，比如采用双异丁基或双异丙基的侧链保护，使得此类色谱填料能够稳定地用于pH0.8~8 的流动相体系中，而不会导致硅烷键的流失。如中国药典方法中，洛伐他汀、氢溴酸右美沙芬等在较低pH 条件下，使用这类的色谱柱可以获得较好的耐用性。 /p p 　　在提高硅胶基质填料碱性稳定性方面，除了使用致密键合、双配位键合以及双重封端等技术，还使用硅胶- 有机杂化颗粒，或者在硅胶表面进行聚合物包覆，提高硅胶在碱性条下的稳定性，同时降低硅　　醇基在碱性条件下的解离，避免碱性化合物拖尾。近期推出能够耐受高pH 稳定性的Poroshell HPH-C18(2.7 μm)和C8 填料(4 μm)，这种填料兼顾了表面多孔型填料和硅胶表面有机杂化的优势，具有高柱效、宽pH 耐受范围(2~11)的优势。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(112, 48, 160) " 2.5　多种分离模式的应用 /span /strong /p p 　　目前液相色谱中主要应用的依然是反相色谱，不过随着色谱技术的发展和分析要求的提高，其他一些分离模式正逐步得到更加广泛的应用，如亲水作用色谱(HILIC)、超临界流体色谱(supercritical　fluid chromatography，SFC)、临界点色谱(liquid chromatography at critical condition，LCCC)和多维色谱技术等。 /p p 　　HILIC 是近年来逐渐被认可的一种强极性化合物分离方法，它是基于极性化合物在色谱固定相表面水层和流动相之间进行的亲水分配作用达到保留的一种分离模式。在HILIC分离中，流动相中水的比例越小，则洗脱能力越弱 反之，洗脱能力越强。化合物的极性越小，则保留越弱 反之，则保留越强。HILIC 模式可以跟任何检测器兼容，并能提高质谱的灵敏度，避免使用离子对试剂，避免进行衍生化，是极性化合物分析最有潜力的分离模式。HILIC 模式一般采用高纯硅胶、硅胶表面键合二醇基、酰胺、两性离子基团等基团或极性聚合物等为固定相，而采用高比例的有机相为流动相。 /p p 　　SFC 是以超临界流体作为流动相的一种色谱技术，该技术具有高效、快速、操作条件易于变换等特点，非常适合于手性药物的分离。几乎所有的液相色谱柱都可以用于SFC，常用的有硅胶柱(SIL)、氨基柱(NH2)、氰基柱(CN)、2- 乙基吡啶柱(2-EP)等以及各种手性色谱柱，某些应用也会使用C18、C8等反相色谱柱和各种毛细管色谱柱。 /p p 　　LCCC 法是根据聚合物的功能基团、嵌段结构的差异进行聚合物分离的一种色谱技术。LCCC 法的原理是基于临界点之上、临界点之下以及临界点附近的标度理论。当使用多孔填充材料作为固定相时，分子排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)和相互作用色谱(interaction chromatography，IC)的分离机制在分离聚合物时同时发生作用。在某个特殊色谱条件(固定相、流动相组成、温度)下，存在2 种分离机制的临界点，被称为焓熵互补点或色谱临界条件(critical conditions)或临界吸附点(critical adsorption　point，CAP)。在这一点，聚合物分子按照分子末端功能基团的不同或嵌段结构的差异分离，与分子的聚合物摩尔质量(分子量)无关，聚合物的洗脱体积等于色谱柱的空隙体积。目前，这一技术成功用于脂溶性聚合物的分析，对于水溶性聚合物的应用研究有待深入和扩展。为适应大分子量聚合物的分离需要，比常规孔径、粒径大得多的填料和更宽柱径的色谱柱也应随之出现。 /p p 　　另外，当样品组分非常复杂时，使用一种分离模式进行分离变得非常困难，多维色谱应运而生。多维色谱又称为色谱/ 色谱联用技术，是采用匹配的接口将不同分离性能或特点的色谱连接起来，第1 级色谱中未分离开或需要分离富集的组分由接口转移到第2 级色谱中，第2 级色谱仍需进一步分离或分离富集的组分，也可以继续通过接口转移到第3 级色谱中。实际上，一般选用2 个合适的色谱联用就可以满足对绝大多数难分离混合物样品的分离或富集要求。因此，通常的色谱/ 色谱联用都是指二维色谱。 /p p 　　若2 种色谱的联用仅是通过接口将前一级色谱中某一(些)组分传递到后一级色谱中继续分离，这是中心切割式二维色谱(heart-cutting mode twodimensional chromatography)，一般用C+C 表示。但当2 种色谱联用，接口将前一级色谱中的全部组分连续地传递到后一级色谱中进行分离，这种二维色谱称为全二维色谱(comprehensive two-dimensional chromatography)，一般用C× C 表示。C+C 或C× C 2种二维色谱可以是相同的分离模式和类型，也可以是不同的分离模式和类型。接口技术是实现二维色谱分离的关键之一，原则上，只要有匹配的接口，任何模式和类型的色谱都可以联用。 /p p 　　常见的二维液相色谱(2D-LC)是将分离机制不同而又相互独立的2 支色谱柱串联起来构成的分离系统，通过柱切换技术实现样品在一维和二维色谱柱之间的流动。例如，将2D-LC 应用于复杂基质的中药材及中药复方制剂的分析，可显著提高色谱柱的峰容量和色谱峰鉴定的可靠性，降低色谱峰重叠，使分离效率与分析通量大大提高。通常会将反相/ 反相、正相/ 反相、离子交换/ 反相和手性/ 非手性等形成正交关系的色谱柱用于2D-LC 分离。使用反相/ 反相模式进行二维色谱分离时，使用不同pH或缓冲盐可以获得正交的分析结果。 /p p 　　因此，广大色谱工作者面临的问题是：如何选择合适的色谱柱以满足各种分析的要求，如何利用现有设备发挥更快的分析效率，如何利用不同色谱柱选择性的差异获得更好的选择性、分离度和柱效。 /p p 　　 span style=" font-family: 黑体, SimHei " 注：近年来，液相色谱柱技术发展的非常迅速，这同时也促进了高效液相色谱法在药物分析中更为广泛的应用。据统计，一个典型的制药企业甚至可能会拥有成百上千支液相色谱柱，在一种药物分析方法的开发过程中，如何选择适当的色谱柱往往会给实验人员带来很多困扰。 /span /p p span style=" font-family: 黑体, SimHei " 　　本文献原文刊登于《药物分析杂志》2017年37卷第2期，作者为洪小栩、石莹、宋雪洁等八人，分别来自国家药典委员会、扬子江药业、安捷伦科技和江苏省食品药品监督检验研究院等单位。本文为该文献的第二部分，详细介绍了液相色谱填料近年来的技术进展情况。仪器信息网后续还将发布该论文其余内容，为广大色谱柱用户以及色谱柱供应商提供相关参考。 /span /p p br/ /p

为答谢各位新老用户对上海通微的支持和厚爱，公司于2010年12月1日至31日举行德国Bichoff色谱柱促销活动。 一 以下6种规格的C18 柱促销价均为2010元。 1 ProntoSIL C18 H （S/N:2546F185PS050, 250x4.6mm, 5&mu m） ProntoSIL C18 H是标准的C18键合固定相的色谱柱，它广泛地适用于各种反相色谱。 2 ProntoSIL C18 SH（S/N:2546F180PS050, 250x4.6mm, 5&mu m） ProntoSIL C18 SH具有杰出的形状选择性，在PH低至1的环境中仍能保持良好的稳定性。 3 ProntoSIL C18 AQ （S/N:2546F184PS050, 250x4.6mm, 5&mu m） Bischoff公司的独特键合技术使ProntoSIL C18 AQ特别适用于有机溶剂含量低于10%的亲水系流动相环境。采用传统键合技术生产的固定相在这种亲水系条件下，刷状C18链会发生塌陷，导致峰形变差；而ProntoSIL C18 AQ在这种亲水环境中可以维持良好的峰形，特别适用于极性物质的分析。 4 ProntoSIL C18 AQ PLUS （S/N:2546F183PS050, 250x4.6mm, 5&mu m） 与ProntoSIL C18 AQ相似，ProntoSIL C18 AQ PLUS也适用于有机溶剂含量低于10%时的亲水系流动相的环境。不同的是，ProntoSIL C18 AQ PLUS在低pH的酸性条件下（pH 1）具有更强的稳定性。即使在以纯水为流动相的体系中，也能获得良好的峰形。 5 ProntoSIL C18 ace-EPS （S/N:2546F18APS050, 250x4.6mm, 5&mu m） ProntoSILC18 ace-EPS是一类键合了极性基团的新型反相色谱柱，它不但具有超强的稳定性（适用pH范围1-10），还最大限度地提供了疏水性和极性的选择。由于ProntoSIL C18 ace-EPS的硅羟基活性非常低，即使像amitriptyline（抗抑郁药）这样的强碱性化合物也可以在中性pH条件下得到洗脱分离，并保持良好的色谱峰对称性。ProntoSIL C18 ace-EPS主要应用于样品本身带有碱性或酸性基团的物质，在制药领域有着广泛的应用。 6 ProntoSIL KromaPlus C18 （S/N:2546F180PS050, 250x4.6mm, 5&mu m） ProntoSIL KromaPlus C18是一种基于高纯度球形硅胶基质的反相色谱柱。Bischoff对硅胶基质的长期研究以及独特的键合技术产生了这款全新的液相色谱柱产品。该款色谱柱具有高效、重复性好和化学稳定性高的特点。ProntoSIL KromaPlus C18的pH应用范围是1~10。 2 凡一次性购买十根以上的客户，我们加送一根（以上6种规格，客户可任意挑选一种）。 3 所有购买客户将会有元旦抽奖机会，获奖者将得到精美礼品一份。获奖名单见通微网站。

01 摘要碳水化合物化合物可利用 RediSep Gold Amine 色谱柱结合蒸发光散射检测（ELSD）进行简便的纯化。该色谱柱采用亲水相互作用液相色谱（HILIC）梯度洗脱法，以乙腈或丙酮与水的梯度进行操作。将待纯化的样品溶解于 DMSO 中，不仅允许大量样品加载，同时还能保持良好的分辨率。02 背景碳水化合物通常采用氨基柱进行分析，该方法具有良好的分辨率。这种分析方法一般使用乙腈和水作为流动相，样品通常溶解在水中。由于样品注射量较小，样品有机会吸附在固定相上。在制备色谱中，相对于色谱柱尺寸而言，样品负载和注射体积要大得多，因此将样品溶于水中注射可以防止碳水化合物吸附在柱子上，导致它们在空隙处洗脱。干法加载样品到固体装载小柱上通常用于快速色谱，但用户需要自己用氨基介质填充他们的小柱。样品仍然溶解在水中进行加载，这需要很长时间才能在运行样品前蒸发。二甲基亚砜（DMSO）常用于反相色谱的样品溶解，因为它能溶解大多数化合物。DMSO 能够溶解碳水化合物，但在 HILIC 中是一种弱溶剂，因此它允许样品吸附在柱子上。在使用氨基柱时，DMSO 在洗脱早期被洗脱；然而，在采用非氨基介质的其他 HILIC 运行中，它可能在梯度洗脱的后期才被洗脱。03 结果与讨论虽然亲水相互作用液相色谱（HILIC）属于正相色谱，但它使用的溶剂通常适用于反相色谱，因此需要根据表 1 中的设置调整蒸发光散射检测器（ELSD）的参数，以保持基线稳定的同时维持灵敏度。表1. 纯化碳水化合物的蒸发光散射检测器（ELSD）设置。ELSD控制设置值Spray Chamber20℃Drift Tube60℃Gain1SensitivityHigh样品均溶解于 DMSO 中。如有必要，将样品在热水浴中加热以促进溶解。使用 PeakTrak Flash Focus 梯度生成器在系统上开发方法。运行了一个亻贞查梯度以验证样品能够被洗脱，并证明化合物之间有足够的分辨率以实现成功的纯化。所需化合物的保留用于计算聚焦梯度的溶剂组成。所有运行均使用 RediSep Gold 氨基柱。运行完成后，用2-丙醇洗涤并储存柱子，2-丙醇与有机溶剂混溶，可实现较少极性化合物的快速纯化。第一个实例使用了核糖和葡萄糖。亻贞查梯度和聚焦梯度都使用乙腈作为弱溶剂。亻贞查运行只用了少量几毫克，并且为了提高这个小样品负载的灵敏度，ELSD 增益被调高到 3。第二个洗脱峰用于聚焦梯度；计算梯度后，ELSD 增益被重置为 1 以保持 ELSD 响应在量程内。总样品负载为 100 毫克，使用 50 克 RediSep Gold Amine 柱。果糖和蔗糖通常一起出现在样品中。图 2 展示了从葡萄糖杂质中纯化果糖的过程。该混合物以与核糖-葡萄糖样品类似的方式运行，梯度聚焦于葡萄糖。在约 1.8 柱体积（CV）出现的峰是用于溶解样品的 DMSO。图1. 核糖和葡萄糖在 5.5 克 RediSep Gold Amine 柱上运行亻贞查方法（上图），并聚焦到 50 克 RediSep Gold 胺柱上。样品总负载量为核糖和葡萄糖各 50 毫克。聚焦梯度中约 1.8 柱体积处的小峰是 DMSO。图2. 使用 RediSep Gold Amine 柱和乙腈/水梯度从蔗糖中纯化不纯的果糖。04 丙酮作为弱溶剂丙酮也是 HILIC 的弱溶剂，可以替代乙腈使用。尽管醇类可以用于 HILIC，但这些溶剂对于在胺柱上纯化碳水化合物来说太强了。使用丙酮纯化了一个果糖和葡萄糖的样品。该混合物的纯化方式与之前的例子相似，除了亻贞查梯度使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold Amine 柱，因为 PeakTrak 允许使用任何尺寸的 Teledyne ISCO 柱进行亻贞查运行。聚焦梯度使用了一根 50 克的 RediSep Gold Amine 柱，但计算出的梯度需要较低的水浓度来纯化葡萄糖，这表明对于这些化合物，丙酮是比乙腈更强的溶剂。图3. 使用丙酮/水梯度纯化的果糖和蔗糖。亻贞查运行使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold 胺柱。05 结论使用 NextGen 300+ 配备蒸发光散射检测器（ELSD）和 RediSep Gold 胺柱，通过 HILIC 梯度方法可以高效纯化碳水化合物。使用 DMSO 溶解样品既保证了高样品负载量，又保持了良好的分辨率。PeakTrak Flash Focus 梯度生成器使得 Teledyne ISCO 制造的所有色谱柱都能快速开发和放大方法。

在制备液相色谱中，样品的上样量是影响分离效果的重要因素之一。要纯化分离的样品应以合适的浓度添加到色谱柱柱床上，以实现窄的水平谱带。如果上样量太大，则谱带变宽，分离效率降低。Flash和Prep HPLC的上样量有很大不同。由于Flash色谱通常用于预纯化，高分辨率不是优先考虑的因素，因此上样量往往比Prep HPLC高。在Prep HPLC中，主要目的是获得最高纯度的物质，故基线必须得到分离。正相和反相二氧化硅（如C-18、氨基或二醇基）的上样量也存在相当大的差异。由于非键合相二氧化硅的表面积大，故这种固定相的载样能力更高。正相二氧化硅的载样能力通常比键合二氧化硅的载样量高约10倍。标准二氧化硅（粒径40-60 μm）通常可接受10%的载样量；在使用较小颗粒（15-30μm）时可以达到30%。然而，重要的一点我们要知道，无论是反相还是正相，上样量由样品的复杂程度决定的。对于含有多种化合物的复杂样品，决定其复杂性的因素是纯化目标化合物与其邻近的洗脱组分的分离程度。通常情况下，复杂样品需要少量多次的上样方式来处理。接下来“小步”同学将分享给大家一篇关于Pure制备色谱上样量的应用文章，来让大家感受下色谱的魅力。?在液相色谱中，样品可以通过两种不同的方式上样：固体或液体。液体上样，是将样品溶解在溶剂中后，直接注入色谱柱上。固体上样，是将粗样品与载体材料（如硅胶）的固体均匀混合物放在色谱柱前面。图1：液体和固体样品每种技术都有其需要考虑的特殊方面，下面将进行更详细的讨论。液体上样是一种将样品很好地溶解在洗脱初始溶剂中的方法，可用于Flash和Prep液相色谱应用中。推荐使用弱极性溶剂，因为强极性溶剂会降低分离度。液体上样被认为是最简单、最快捷的方法，但可能会造成样品损失，需要考虑的因素如下：- 化合物在初始溶剂中的溶解度:样品需要完全溶解，因为进样系统或色谱柱顶部的沉淀可能在系统中产生过大的压力，并最终导致样品流失。- 溶解溶剂的极性：如果使用极性溶剂溶解样品，则它们可能会吸附在极性硅胶柱基质上，并对更多极性化合物（后来在硅胶材料上洗脱的化合物）的分离产生不利影响。- 样品溶剂的体积:体积越大，样品从一开始就迁移到填料柱床中的风险就越高，从而导致谱带变宽、分离度降低。理想的样品体积不应超过色谱柱体积的10%。样品的保留率越高，可装载的体积就越大。- 样品量：每根色谱柱都有规定的装载量。理想的样品量不应超过纯化柱的最大装载量。在Flash液相色谱中，通常是在注射器的帮助下将液体样品手动直接注入到色谱柱顶部（如下图）。由于高背压，无法在Prep液相色谱柱上进行手动上样。因此，它是通过专用的进样阀完成的，如图所示：图2：Flash和Prep HPLC中的液体上样固体上样是仅适用于Flash色谱分离应用的技术，用于只能在强溶剂中溶解的样品，或用于具有难以溶解的粘性或多杂质样品。该方法可以通过减少谱带展宽和随后的拖尾效应来改善分辨率。一般来讲，固体上样分离较慢，但与液体上样相比，分辨率更高。推荐的样品量不应超过色谱柱的最大载样量。固体上样通常通过以下步骤完成：- 将粗样品溶解在合适的极性溶剂中。-然后，将该混合物在超声浴中超声几分钟，以提高溶解度。- 过滤混合物以除去尚未完全溶解的物质。非键合的二氧化硅是最常用的吸附剂，但可能不是最佳的选择。通常，建议使用与色谱柱相同类型的硅胶作为支撑材料。这样可以避免不必要的化学相互作用或样品的不可逆吸附。一种有用的替代材料是 Celithe,由于其中性的化学特性，它不与任何物质发生相互作用。

抗体是免疫系统中一类重要的蛋白质，它们通过特异性方式来结合抗原。这一特性使之在诊断、治疗、基础研究等方面具有巨大的价值。抗体由四条多肽链构成，两条重链和两条轻链，通过二硫键连接而成。它们通常被糖基化，其中羧基端区域高度保守，而氨基端区域在氨基酸序列上可变，从而产生抗体的特异性和多样性。 在一系列的酶切和化学处理下，抗体分子被裂解为各种片段，通过HPLC分离，结合电泳和质谱等手段，抗体的结构可被了解和鉴定。近日，赛分科技的科学家通过体积排阻色谱、离子交换色谱和反相色谱等多种技术实现抗体异构体、各种抗体碎片的高效分离，可对抗体结构进行可靠的鉴定和验证。此外，为抗体药物的质量控制也提供了有效的监控手段。 一、结构研究 体积排阻色谱法（Zenix&trade SEC） 抗体片段重链和轻链的分离 抗体片段Fc和Fab的分离 离子交换色谱法（Antibodix&trade WCX） 抗体片段Fc和Fab的离子交换色谱法分离 反相色谱法（Bio-C8） Column: Bio-C8 4.6 x 100 (3 &mu m, 300 Å , 4.6 x 100 mm) Mobile Phase A: 0.11% TFA in water Mobile Phase B: 0.09% TFA in ACN Flow: 0.5 mL/min Temperature: 75 oC Detection: UV 280 nm 抗体片段重链和轻链的反相色谱法分离 二、抗体异构体分析 Column: Antibodix&trade WCX NP5 4.6 x 250 mm Mobile phases: A: 20 mM sodium acetate, pH 5.15, B: A + 1 M LiCl Flow rate: 0.8 mL/min Detection: UV 280 nm. 单克隆抗体的稳定性分析 更多信息请参考：http://www.sepax-tech.com.cn/training/Antibody Solution Kit.pdf 关于赛分科技 赛分科技有限公司（Sepax Technologies, Inc）总部位于美国特拉华州高新技术开发区，致力于开发和生产药物与生物大分子分离和纯化领域的技术和产品。赛分科技是集研发、生产和全球销售为一体的实业型企业。公司主要产品为液相色谱柱及耗材、固相萃取柱（SPE）及耗材、液相色谱填料以及分离纯化仪器设备。在液相色谱领域里，赛分科技已开发出了100多种不同型号的液相色谱材料，涵盖了反相、正相、超临界（SFC）、手性（Chiral）、离子交换、体积排阻、亲和、HILIC等各种类别，为世界范围内液相色谱产品最为完善的企业之一。 赛分科技的创新技术使之生产出具有最高分辨率及最高效的生物分离产品，包括体积排阻、离子交换、抗体分离、和糖类化合物分离色谱填料和色谱柱，可广泛地应用于单克隆抗体、各种蛋白、DNA、RNA、多肽、多糖和疫苗等生物样品的分析、分离和纯化。赛分科技先进的技术和完善的产品线已使赛分成为全球生物分离的领航者。 公司网站：www.sepax-tech.com.cn www.sepax-tech.com

1、网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可以?反冲后是正着用，还是反着用?具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如正向柱、氨基柱、离子交换柱等，最好都有解释。 　　答：一般的正相、反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。我们一直提倡的是：正向使用，反向冲洗。 　　2、我在做方法开发的时候，用乙腈和水作为流动相，在调整梯度的时候发现，刚开始用60%乙腈，RT为2.5分钟，调到40%乙腈，RT没有变化，30%也没有变化，一直调到20%的时候，RT突然变到了约13分钟，请问这是什么原因?我用的是离子交换柱。 　　答：离子交换柱的保留时间主要由洗脱液的离子强度和pH决定，你现在讲的比较简单，需要把你的方法说的详细一点才能做具体的分析。譬如分析物是什么情况，其含有极性电离基团和非极性基团是什么性质?离子交换柱是聚合物基质还是硅胶基质?水相是什么缓冲盐?对于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护?为什么要这样做? 　　3、对于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护?为什么要这样做? 　　答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。 　　4、测定多肽，一般采用什么柱子?流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子? 　　答：分子量不高的多肽一般选用常规C18柱就能测定，也有用离子交换柱、水性C18柱和Hilic亲水作用柱的。 　　5、氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复? 　　答：氨基柱测酸性样品，应该是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱(冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨)，之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1%。 　　6、色谱柱的技术都有哪些?比如封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里? 　　答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术，填料技术自不待言，填料的好坏对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响。装柱技术也没有想象中的这么简单，不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度，装柱工艺都有所不同，要装出紧密、稳定、均一的柱床，更多是一门艺术，需要经验积累。国内和国外想比，我认为色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料，一般买国外现成填料装柱，买到的填料质量控制权不在自己手里。另外因为装柱历史短，经验积累少，装柱工艺也没有完全达到国外水平。另外，对色谱柱性能很关键的基础材料-----裸硅胶，国产的还不过关，在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产品相比，差距很大。 　　7、色谱柱技术的差距在哪里? 　　答：液相色谱柱装填实际上是有一定技巧和程序，可能还有一些运气。一般使用高压匀浆方法装填。也就是能让填料在溶剂内均匀地悬浮。然后用瞬间高压压实，这实际上用到了不同比例的匀浆液体，和合适的压力。压力太大，颗粒破碎，压力太小，塔板数少。同时压力需要稳定，不然分布不均，拖尾严重。同时还有头上平整程度。套上套，就可以用了。 　　8、柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢?原来也讨论过这个问题，我也拆下来清洗过，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢? 　　答：柱头污染了，就取出污染的，再装一些填料。因为加入你刮了些填料，那么微观的塔板数就少了。假入你刮得不多，仅表面，可能就是一些脏物，所以，问题解决。但是今后还会有同样问题，再挂，那么不小心刮，影响柱效。建议还是装一个预柱。 　　9、如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗? 　　答：对一般的反相柱，也就是洗干净后放到纯甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，应该不需要做特殊的保护。 　　10、流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么? 　　答：《高效液相色谱方法及应用》于世林编著的上面说：甲醇为质子给予体、乙腈为质子接受体、四氢呋喃是偶极溶剂，应该除了极性影响，还有另外的影响因素，至于分离机理，还是比较复杂的，不能看成是个万能方法。 　　11、关于色谱柱的填装问题!我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：1.国外生产填料并填装完成成品卖到国内 2.国外生产填料，国内填装销售 3.国内生产填料，国内填装销售。一般情况下，第1种情况卖的最贵，也质量最好!可是我就不明白了：如果是填料的生产很复杂的话，那么填装上国内也跟不上去吗?为什么换在国内填装就会出现或多或少的一些小问题呢? 　　答：国内填装会出现质量小问题，和国内目前普遍做事没有国外严谨有关吧。如果工艺技术上没有问题，又能制订并切实执行一整套严格的生产质量管理措施，国内填装和国外填装并无区别。 　　12、什么原因导致峰比原来大，而且出现的早? 　　答：过快、过大的峰通常是由于从分流口和隔垫吹扫口排出的载气减少，而更多的进入色谱柱 因此增加柱头压力，可降低分流比。检查分流出品的气体流量，如需调整分流比则对调整此流量。如果问题依然存在，可卸下并清洁分流口。这个问题也可能由于柱头压调节阀有问题而引起。 　　13、预柱或保护柱用还是不用的问题!原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗?我们做的大多是头孢类的抗生素。 　　答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在，但是如果保护柱接得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱(中间是个筛板)，制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是最好配个保护柱。 　　14、用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水，经常出现停或进气泡这是什么原因? 　　答：水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱?系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。 　　15、何时需更换隔垫或衬管? 　　答：通常比较好的隔垫至少能保证100次进样不发生问题。当色谱特征说明衬管有问题时，需要更换衬管。影响隔垫寿命的因素有注射器尺寸、进样口温度和压力，当然受压力影响的程度比较小。影响衬管寿命的因素通常是样品的清洁度。应该根据仪器维护历史记录来选择色谱需要的特定程序。 　　16、想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法，是不连检测器吗? 　　答：反冲就是将柱子反向连到系统中。因为有污染物反冲出来，当然不连检测器，出液端直接接到废液瓶就可以。 　　17、如果不使用不锈钢接头，而改用PEEK头，是否可以完全解决接头匹配问题? 　　答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，VICI，Upchurch，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。 　　18、有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径(2-5um)的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。厂商一般在使用说明书中会说明前后筛板的孔径吗? 　　答：厂商如果前后筛板孔径不对称，肯定会在说明书里特别提到的。 　　19、我在做多肽药物时遇到下列问题：1).基线不稳定波动大，流动相A：1%TFA水溶液，B:1%TFA乙腈溶液，检测波长210nm 流速1.0ml/ml，什么原因?怎么解决?TFA有什么作用?流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。2)做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好 3)药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为30nm，30nm与10nm对结果有什么区别? 　　答：应该是起&ldquo 离子对&rdquo 的作用吧。在做多肽类样品的时候，300A孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。流动相加入TFA，在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸(TFA)作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。 　　20、waters Atlantis C18柱可以用较高比例的流动相，那麽用完后应该怎麽清洗?在什麽体系中保存比教合适? 　　答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：流动相中不含缓冲盐分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向冲洗色谱柱45min流动相中含有缓冲盐，分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向冲洗色谱柱45min (注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易长菌，使用时间不可超过3天) 水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中(不含缓冲盐)，中长期保存在纯甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。 　　21、正相硅胶柱一般保存在什么溶剂里面比较合适? 　　答：短期和长期都建议保存在正相测定所用的流动相中，一般是正己烷和极少量的异丙醇。 　　22、磷酸盐缓冲盐渗透力强，为什么，是因为与醋酸盐，枸椽酸盐相比，基团小吗，使用磷酸盐缓冲液与其它缓冲液相比，会使色谱柱寿命缩短多少? 　　答：经常用磷酸盐，在其它条件差不多一样的情况下，柱子寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些。但用磷酸盐也有不可取代的优点吧，否则不可能现在大部分人还在用。 　　23、反相离子对色谱法中，离子对是如何起作用的，是离子对试剂的非极性端溶解在填料的非极性端里，解离端伸向流动相，对含胺化合起离子交换作用，还是样品与离子对生成紧密的结合物，离子对试剂掩藏化合物中的极性基团，还是这种结合物是在解离与结合的动态平衡之中? 　　答：首先离子对试剂的解离端和目标离子形成离子缔合物，降低其极性，这样就能较好的在柱子上保留。再者，根据疏水效应理论，离子对试剂的疏水端是很容易和C18链相互作用的，这样更容易在柱子上保留，所以我认为离子对试剂作用是混合保留机制，即纯粹的反相保留和离子对保留机制共同作用。 　　24、四烷基季铵盐(如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等)在水中电离后，也形成了类似N+H(CH2CH3)3的结构N+(CH2CH2CH2CH3)4，这种结构也能有效的与Si-O-产生较强的静电作用，此类离子对用的比较少，但它的作用仅是掩藏Si-O-吗，它对物质的保留性能有何影响，实验中发现检测胺化物时，流动相中加入磷酸缓冲盐有增加物质保留的趋势，而加入三乙胺则会降低物质的保留能力? 　　答：前面提到的四丁基氢氧化铵等离子对试剂确实不如辛磺酸钠等极性基是阴离子的离子对试剂用得普遍，原因是酸类极性物质很容易通过降低pH值的方法提高在反相色谱中的保留能力，降低pH可抑制酸的电离，使酸处于中性状态而与疏水碳链的作用力增强。而碱类分析物则受硅胶基质pH上限的严重影响(以前上限是8，后来抬到10，直到最近杂化硅胶才将pH上限提到12左右)。铵盐类离子对试剂确实有辛磺酸钠等所不具有的屏蔽硅醇基作用，但其主要作用还是疏水端和疏水固定相结合，外露的阳离子亲水端和酸阴离子作用，从而提高其保留能力。当然同样还有第二种解释机理，离子对试剂先和分析物结合，掩藏极性基，从而提高极性分析物在反相色谱中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差，这种情况下，认为后面的结合机理占上风的可能性更大。检测胺类化合物，加入三乙胺预先和硅醇基结合，胺和硅醇基作用被三乙胺取代，保留下降是肯定的。 　　25、同一根色谱柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精钠时为什么保留时间会提前? 　　答：色谱柱被强保留物质污染后，保留时间提前和滞后的情况都有，具体要看污染物的性质，还要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情况，情况比较复杂，有时候比较难预测是提前还是滞后。不过你平时维护的时候，注意在测定后将污染物用有机溶剂反冲清洗，就可以减轻或避免这种情况的出现。建议每个分析方法用专门的色谱柱，长远看，这样更节省色谱柱的费用。 　　26、HPLC柱前衍生和柱后衍生的相关问题?1)为什么要衍生?2)衍生化的分类?3)进行衍生，适用的化合物有哪些?4)进行衍生化的要求有哪些?5)柱前衍生和柱后衍生的优缺点? 　　答：色谱技术中的化学衍生法系指在色谱过程中用特殊的化学试剂(一般称为衍生化试剂或标记试剂)使样品成分转变相应的衍生物之后进行分离检测或进行检测的方法。目的为：1.将紫外&mdash 可见强吸收功能基团引入被检测对象或将其转变为荧光衍生物，以提高检测灵敏度 2.提高对分析样品的分离和选择性。从是否与HPLC系统联机的角度，化学衍生法分为在线on line)与离线∣Off line)两种。从发生衍生化的场合，分为柱前衍生法pre-column derivatization)与柱后衍生法(post-column derivatization)两种。目前，在HPLC中，以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多。 　　27、多个样品不好不离的时候，请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度? 　　答：提高分离度可从三个主要影响因素来考虑，柱效、选择性和保留因子。可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效 选择性和固定相选择以及pH条件有关，通过选择合适的色谱柱和合适的pH，可以提高选择性 有时候适当延长出峰时间增加保留因子，也可提高分离度。 　　28、苯基柱，氰基柱该什么时候考虑用? 　　答：苯基柱用于含苯环的芳香族化合物的测定时，具有较高的选择性。CN柱可作为一个保留能力最弱的反相柱使用，也可作为一个活性降低的正相柱使用(保留时间比硅胶柱和氨基柱低很多)。 　　29、同样类型柱子还有长度，粒径等差异，这些该怎么去选择? 　　答：长度和粒径都是用来改变柱效的，选择原则是够用就好。　　30、我前几天刚刚装上一个新的C18柱，在进样之前我用100%的甲醇冲了半个多小时。刚才看到上面写的要活化什么的?不知道我只冲洗半小时就开始用对柱子有没有影响?对出峰什么的有没有影响呢? 　　答：不是所有的测定，都需要对新柱子用所测样品老化。但先按方法程序进样几针，观察到峰面积保留时间不再有明显变化，再开始正式测定，这是一个好习惯。按你现在的做法，如果第一针和第二针的峰面积、保留时间没有变化，就继续做没影响吧。 　　31、现在色谱柱和仪器的接口还没有标准化吗，除了检测池的出入管较小外，色谱柱的接口与PEEK头不匹配的有哪个型号的色谱柱，以后使用的时候需要注意一点。同时发现使用过金属接头的色谱柱再换成PEEK头，常易漏液，这是因为金属头易使色谱柱接口变形吗? 　　答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，VICI，Upchurch，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。 　　32、普通的C18柱能作为正相色谱柱使用吗?正相色谱体系中最常用也最普通的是那种色谱柱。正相柱在使用过程中与反向柱相比有什么需要注意的地方? 　　答：普通C18柱作为正相柱使用，我还没听说过。正相色谱分离模式是指固定相的极性比流动相的极性大，反过来，流动相极性大就是反相。C18固定相属于疏水性相对比较强的，疏水性强就是极性很弱，应该找不出极性比它更弱的流动相了。正相体系常见的柱子有：硅胶柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，最普通的应该就是硅胶柱。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相柱对水分非常敏感，流动相中水分含量的些微变化对保留时间影响很大，因此正相柱测定前平衡时间需要几个小时甚至更长。 　　33、色谱柱的柱头类型与不锈钢毛细管接头有6种连接方式(在讲义里面提到)，那么我们用户一般是液相色谱仪是固定某一个厂家，而是根据样品检测需要更换不同类型的色谱柱，那么怎么判断我所购买的色谱柱是否与不锈钢毛细管是否匹配呢，我之前只是知道安捷伦和waters都有规定他们自己家的柱子与自己家的仪器配套是最合适的，而其他厂家的色谱柱都很少提及，在不知道的情况下，我们该怎么选择? 　　答：不锈钢毛细管接头有个缺点，用过一次后卡匝位置和距离毛细管末端的长度就固定死了。如果下次用的色谱柱的柱头接口深度和原来的不同，就容易产生死体积和泄漏。产生的死体积一般不大，如果只引起柱效的稍微下降而没引起拖尾，这个问题就容易被忽略。引起大家关注的是泄漏，如果用了新柱子，发现和毛细管的接口处有泄漏，就可以判断是接头的匹配问题。最好的判断方法还是：询问一下厂商色谱柱柱头的类型和柱头接口的深度，然后和毛细管接头的规格比较。如果用PEEK接头，发生问题的情况就大大减少，因为PEEK接头卡匝位置是不固定的。接头与色谱柱的匹配，并没有在实际色谱应用中造成很大的问题，有很多人都没有关注到这个问题。一方面原因是使用PEEK接头的情况很普遍，另外如果发现不匹配，换个毛细管接头还是非常方便的。 　　34、相对于气相色谱，液相的优势在哪里?做防腐剂分析时，流动相加入乙酸铵才可以出峰，原理是什么? 　　答：液相和气相相比的优势有很多，我认为主要在于应用范围更广。气相只限于容易气化的低分子量物质的分析测定，对象大部分是基础化工原材料 而任何能溶解于某溶剂的物质都能用液相分析，适用对象是分子量从几十到几万的广大范围。在制药、化工、环保、食品和刑侦等诸多重要领域，液相都已成为主导的分析分离工具。也有两者都能应用的交叉情况，但液相的制样更简单。液相色谱的出现克服了气相色谱不能直接用于难挥发、热不稳定及高分子化合物的弱点。 　　35、您提到&ldquo 磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH使用范围。&rdquo ，既然这样，经常使用，柱子寿命是否也下降的快呀? 　　答：经常用磷酸盐，在其它条件差不多一样的情况下，柱子寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些。但用磷酸盐也有不可取代的优点吧，否则不可能现在大部分人还在用。 　　36、CN柱的保存需要在低温条件，但是又不能太低，使固定相冻结，怎么控制这个温度?怎么判断固定相是否被冻结?固定相冻结后会是什么样的现象? 　　答：所谓低温储存，就是放到阴凉处或者放到冰箱的冷藏室。储存液只要不是纯水，冰点都比较低，纯甲醇的冰点是零下90度以下了。 　　37、我们测试样品时，经常会关心柱压是否太高，但是在购买色谱柱时，并没有说每一根色谱柱的最大使用压力是多少?针对这样的情况，用户怎么判断柱压是否超过该柱的极限? 　　答：装柱时的压力比使用时高很多，所以柱压对色谱柱本身在使用时没有极限问题存在，倒是一般仪器有个40Mpa的上限。如果色谱分离度还能满足分析方法要求，柱压只要仪器能承受就OK吧。 　　38、使用缓冲液不当，使硅胶溶解并重新形成粉末后，会出现什么样的异常情况?怎么处理? 　　答：出现异常就是柱压升高。小粉末在流动相不断冲洗带动下，最后会聚集在柱子出口端，沉积在后筛板。处理方法只有拆下后筛板进行清洗或更换，但这样做会影响到柱床，处理后柱效会下降。 　　39、今天才知道滤膜的材质分了这么几种：再生纤维素、聚四氟乙烯、硝酸纤维和醋酸纤维等，之前只知道有有机系和水系之分?各种不同材质的滤膜适合于什么样的样品? 　　答：再生纤维素膜：具有蛋白质吸收低，适用于水溶性样品和有机溶剂 聚四氟乙烯：适用于所有有机溶剂，酸和盐 尼龙66：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%的乙醇，二氯甲烷，不适用与二甲基甲酰胺 醋酸纤维：不适用有机溶剂，特别适用水基溶液。 　　40、我原来遇到个这样的问题，一直不知道原因。刚拿柱子做，色谱条件是成熟的，绝对没问题，但是该条件下保留的物质变的不被保留，比如本来保留时间15分钟却怎么调比例都是2-3分钟就出峰了，维护后，下次再使用又正常了，什么样原因啊? 　　答：最大可能是发生相塌陷了。C18柱和高密键合封尾的C8柱，在高含水流动相下会发生相塌陷，后果就是保留能力大幅下降。用有机相比例较高的流动相冲洗后，又可恢复正常性能。 　　41、UPLC色谱柱可以反冲吗?HPLC的色谱柱可以简单反冲，但是，UPLC的色谱柱.也是一样的吗?如果压力偏高，该怎么办? 　　答：如果两端筛板孔径对称，UPLC柱应该也是可以反冲的。发现压力偏高，当然也可以用反冲清洗的方法维护，UPLC柱和普通色谱柱比，只是压力高一点，不应该有什么特殊吧。 　　42、常规LC的柱子粒度小，柱效高，现在有3.5um的常规柱，不知道用3.5um*250的压力与4.6um的压力相差多少? 　　答：一般柱子4.6mmx250mm指的是其内径和长度。粒径才用um的单位，但一般标的是5um，也有3.5um的。其它条件一样，光粒径是3.5um和5um的柱压差别，理论上3.5um柱子的柱压是5um柱子的(5/3.5)平方倍数，即2.04倍，简单说就是2倍。 　　43、因为不知道流动相已走完，液相色谱柱空走了大概一晚上，请问这种情况下柱子还能用吗?如果可以应该如何再生? 　　答：能用的!可能柱子里会有气泡进去，但之后多用流动相冲冲，看到基线稳定，就没问题了。用色谱柱的保存液低流速长时间冲洗，然后再检测一下柱效，看柱子是否恢复，液相最好设置一下最低压限，这样就不怕流动相走光而会损伤色谱柱。 　　44、在梯度洗脱的时候，如果整个时间程序越长，保留时间的重现性越差，尤其是后出的峰重现性差更明显，我猜估计是流量本身的误差引起的，但是怎么尽量避免这种情况的出现，使保留时间重现性更好?而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能检测一下过氧化物的含量。

左右滑动查看更多 ✦ &bull ✦ 同样以“分离”为目的，还有Biozen系列反相色谱柱，助力新型HER2靶向ADC药物质控，为乳腺癌带来希望✦ &bull ✦ 2023年2月24日，中国国家药品监督管理局官网最新公示，注射用德曲妥珠单抗已正式在中国获批上市。这款药物由阿斯利康和第一三共联合开发，科研代号DS-8201。截至目前，德曲妥珠单抗已在全球至少获批5项肿瘤适应证，包括两种乳腺癌。DS-8201由抗HER2人源化单克隆抗体与载药拓扑异构酶Ⅰ抑制剂DXd（payload）通过可裂解连接子（linker）组成，其DAR值达理论最大值8，具有避免耐药、特异性强、高细胞毒性和安全性良好的特点。对于ADC这类药物来说，DAR的测定是非常重要的关键质量属性。今天我们将为大家展示Biozen这种生物惰性的反相柱在这个重要检项上的应用案例。小分子毒素抗体比DAR（drug-to-antibody ratio）是ADC药物独特的重要质量属性，它代表抗体偶联小分子毒性药物的平均数量。DAR值分析常见的模式为HIC，该模式下根据分子疏水性逐渐增加的顺序洗脱。荷载小分子药物最多的分子由于疏水性最强最后洗脱，分离过程类似于反相色谱。但是随着ADC药物的payload不断发展，近期科研工作者发现对于偶联较强亲水性payload的ADC药物而言，不同荷载分子之间的疏水性差异不是特别明显，HIC模式下无法很好的分离不同载药数量的ADC分子。此时反相色谱就成为一种适合的替代方案，该方法特别适合基于半胱氨酸偶联的ADC。通过对ADC药物进行还原，使抗体还原为轻链和重链，含不同数量小分子载药数的轻链和重链依据载药数量从少到多依次洗脱。再通过计算各轻、重链的峰面积百分比，并结合每个峰偶联小分子药物的个数，计算加权平均DAR值。本案例使用Biozen的400&angst 孔径的WidePore C4色谱柱对DTT还原后的Trastuzumab-deruxtecan供试品进行分析，并计算其平均DAR值。01样品Trastuzumab-deruxtecan对照品购自第一三共，DAR值为8。用纯水稀释为浓度为1.0mg/mL；Trastuzumab-deruxtecan供试品，由客户慷慨赠送，先用纯水稀释为浓度为1.0mg/mL；再用1M DTT还原后上样。Trastuzumab购自MCE；先用纯水稀释为浓度为1.0mg/mL；再用1M DTT还原后上样。02色谱条件色谱柱：Biozen WidePore C4（2.6μm，400&angst ，150*4.6mm）；P/N：00F-4786-E0流动相A：0.1%TFA水流动相B：0.1%TFA乙腈流速：0.5mL/min柱温：60℃波长：280nm进样量：10μL03结果与讨论通过对Trastuzumab-deruxtecan供试品，Trastuzumab单抗和Trastuzumab-deruxtecan对照品进行还原（100μg蛋白中加入5μL 1M DTT，37℃分别孵育半小时和一小时），我们可以在反相色谱上通过梯度优化，清晰的分离轻链和重链以及荷载不同小分子数量的轻重链。通过对峰面积进行加权计算，我们可以计算得供试品的平均DAR值为3.98。裸抗（蓝）、供试品（黑）和DS-8201（红）轻重链保留时间对比Tips:反相测DAR的方案，是正交于HIC方法的很好的补充。同时，这种方法可以直接上质谱进行表征，对于含偏亲水性payload的ADC来说，也能够得到比HIC更好的分离结果。本应用使用的Biozen WidePore C4采用核壳技术结合丁基的键合相，核壳的设计不仅可以大幅提高柱效，也可以减少蛋白与固定相的次级作用，改善蛋白回收率，峰形和残留的问题；三键键合工艺能够耐受90度的高温；Bio Ti生物惰性的钛合金柱硬件也最大程度的减少了对生物样品的干扰，保证分析结果的稳健可靠。Biozen WidePore C4pH范围：1.5-9.0**USP分类：L26孔径：400&angst &bull 完整蛋白与片段分析&bull 完整质量数测试&bull ADC药物抗体比（DAR值）Biozen Intact XB-C8pH范围：1.5-9.0**USP分类：L7孔径：200&angst &bull BioTi硬件与核壳硅胶颗粒帮助降低吸附,提升回收率&bull 较低背压下实现高柱效分离&bull 温度可达90℃当然，除了Biozen WidePore C4，稍长碳链的Biozen Intact XB-C8也是键合相互补的优选。特别是对于MMAE这类疏水性payload来说，可以优先尝试空间位阻填料工艺的Biozen Intact XB-C8。

安捷伦科技公司推出 AdvanceBio 肽图分析色谱柱 新的 HPLC 和 HILIC 解决方案在生物药物开发中实现更快更稳定的分析 2013 年 5 月 13 日，加利福尼亚州圣克拉拉市 &mdash 安捷伦科技公司（纽约证交所：A) 今日推出 AdvanceBio 色谱柱系列的最新成员。新型 AdvanceBio 肽图分析 BioHPLC 和 ZORBAX RRHD 300-HILIC 色谱柱旨在为各种蛋白质、单克隆抗体、多肽和其他生物制剂的分离、表征和分析提供卓越性能。 两根色谱柱都能让用户体验前所未有的分析速度和高分离度结果。 安捷伦化学品业务部副总裁兼总经理 Anne Jones 说：&ldquo 我们非常高兴能够为我们的制药客户和其他生命科学研究人员推出这些潜力无限的新型色谱柱，成就他们对极致分析灵敏度和速度的追求。我们始终致力于提高生物色谱法的准确度和效率，可以从这些产品身上得到印证。&rdquo 新型 AdvanceBio 肽图分析色谱柱能够快速测定蛋白质的一级结构，还能以无与伦比的速度和灵敏度鉴定变异。事实上，与使用全多孔 HPLC 色谱柱进行常规肽图分析相比，使用该色谱柱得出准确结果的速度要快二至三倍，而常规肽图分析耗时长达 60 分钟。 每批 AdvanceBio 图谱分析柱均采用多肽混合物标样进行严格测试，确保适用性和高重现性，使其能鉴定复杂多肽图谱中的重要多肽。所有可用色谱柱可耐压 600 bar，使 UHPLC 仪器发挥出最佳性能。同时，用于 400 bar 的旧型号仪器时也有卓越表现。 应用 AdvanceBio 肽图分析色谱柱非常适合分析高度复杂的肽谱，能为许多蛋白消化物，包括 rhEPO 提供 100% 序列覆盖率，有 45 糖肽匹配。应用简报使用 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱进行 EPO 的高分辨率糖肽谱分析中对这些功能进行了一一探索。 ZORBAX RRHD 300-HILIC 色谱柱是目前市面上仅有的亚 2 &mu m、300Å HILIC 色谱柱。专门为寻求更快、更高分离度分离多肽、极性糖肽、蛋白质、抗体、偶合物、新生物体和生物制药的用户而设计。 亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 专门针对亲水性糖肽变异体分析。使用该色谱分析极性糖肽可得到出色的峰形，而如果采用反相色谱柱分析则只能得到有限的保留率和分离度。1.8 &mu m 填料的 ZORBAX RRHD 300-HILIC 色谱柱能够实现耐压 1200 bar、快速分析以及卓越的准确度。它们为反相 HPLC 提供了正交和互补分离。应用简报利用 HILIC 和反相色谱分析促红细胞生成素的糖肽和糖型中深入探讨了这些功能。 关于安捷伦科技 安捷伦科技（纽约证交所：A) 是全球领先的测试测量公司，同时也是化学分析、生命科学、诊断、电子和通信领域的技术领导者。公司拥有 20,500 名员工，遍及全球 100 多个国家，为客户提供卓越服务。在 2012 财年，安捷伦的净收入达到 69 亿美元。如欲了解关于安捷伦的详细信息，请访问：www.agilent.com.cn。