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化学发光免疫分析放射免疫分析法有很高的灵敏度,但存在着放射性防护和同位素污染等问题。近年来,许多非放射性同位素标记的免疫分析方法相继出现。其中,在化学发光反应及抗原-抗体特异性识别基础上建立起来的一种新的非放射免疫分析技术--化学发光免疫分析法,由于这种方法具有灵敏度高,特异性强,精密度好,线性范围宽,仪器设备简单,试剂价格低廉,方法稳定、快速等优点,已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。 化学发光免疫分析包括三大类型:即标记化学发光物质的化学发光免疫分析;标记荧光物质的荧光化学发光免疫分析和标记酶的化学发光酶联免疫分析。下面以偶合放大化学发光酶联免疫分析法检测人血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)为例。 (一) 原理 尽管辣根过氧化物酶(HRP)可以催化Luminol-H2O2反应体系产生化学发光,但由于该体系的检测灵敏度不够高,不能满足酶联免疫测定的要求。因此,为了提高体系的检测灵敏度,可将HRP催化H2O2氧化曙红(Eosin)的反应与该反应产物增强HRP催化luminol-H2O2的化学发光反应相偶合,建立偶合放大化学发光酶联免疫分析法。这里,酶的活性是基于下列发光反应进行检测的: HRP luminol+H2O2───→产物+hν 产 物 ↑ Eosin+H2O2 ──────┘ HRP 二) 操作步骤 1. 包被抗体 在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚,再加入300μl用0.05M,PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体,同时设空白对照,置4℃过夜。 2. 洗涤 用抽滤针头吸干管内液体,加入Tris-HCl-Tween20洗涤3次,每次加2ml,放置3~5min,用抽滤针头吸干管内液体。 3. 加待检血清和阳性标准品 用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性标准品或待检血清,每管加入300μl。同时设阴性对照;空白对照管只加抗体稀释液。置37℃孵育2h。 4. 洗涤 同2。 5. 加酶标抗体 用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体,每管加入300μl,空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37℃孵育2h。 6. 洗涤 同2。 7. 化学发光测定 给每管加入300μl底物溶液,置37℃保温20min。犎;后将小试放入LKB-1250 lumimeter中,并置于测量位置,加入300μl 5.0×10-4M luminol。记录仪记录化学发光强度。 8. 同时用ELISA方法进行对照,结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。 结果判定(1) 定性 按下列公式判别阴、阳性: L样品-L空白 ┌≥2.1 为阳性 S/N = ──────── = 商│ L阴性对照-L空白 └<2.1 为阴性 (2) 定量 以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标,不同稀释倍数为横坐标,作出剂量反应曲线(标准曲线),犜r待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。
化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物,通过发光反应增强测定的敏感性;第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物,直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。 一、化学发光酶免疫测定 从标记免疫测定来看,化学发光酶免疫测定(chemiluminescentenzymeimmunoasssay,CLEIA)应属酶免疫测定。测定中2次抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同,仅最后一步酶反应所用底物为发光剂,通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。两种常用的标记酶,辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)均有其发光底物,由此建立的CLEIA均在临床检验中应用。 (一)HRP标记的CLEIA 常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,通常以0.1mol/LpH8.6Tris缓冲液作底物液,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光,而在最后光强度测定中造成空白干扰,因而宜分别配制成2瓶试剂溶液,只在用前即刻混合。 HRP催化鲁米诺氧化的反应可被某些酚试剂(如邻-碘酚)或萤火虫荧光素酶等加强。加强剂的作用是增强发光和延长发光时间,由此可提高敏感度。 (二)AP标记的CLEIA 在以AP为标记酶的CLEIA中,应用的底物为adamantyldioxetasephosphate,有不少衍生物的商品试剂如PPD可供应用。发光反应的反应式如下:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290913_24989_1636364_3.jpg[/img]二、化学发光标记免疫测定 化学发光标记免疫测定亦称化学发光免疫测定(chemiluminescentimmunoassay,CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件:①能参与化学发光反应;②与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂;③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力;④应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。 鲁米诺类的发光反应须有催化剂(例如过氧化物酶)催化,且与蛋白质或肽结合后其发光作用减弱,因此鲁米诺类在CLEIA中是很好的底物,但已较少用于CLIA的标记。吖啶酯类对CLIA更为适用,其显著的优点是:①氧化反应不需催化剂,只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加氢化钠溶液,发光反应迅速,本底低。②在氧化反应过程中,结合物被分解,因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。试剂稳定性好。 三、电化学发光免疫测定 在电化学发光免疫测定(electrochemluminescenceimmunoassay,ECLI)中应用的标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌,其衍生物N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合,制成标记的抗体或抗原。ECLI的测定模式与ELISA相似,分二个步骤进行。以双抗体夹心法测定抗原为例,第一步在试管中进行,反应物为Ru(bpy)32+标记的抗体、吸附在磁性微球上的固相抗体以及受检的标本,反应式如图[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290914_24990_1636364_3.jpg[/img]反应后除由标记抗体、固相抗体与标本中的抗原形成的夹心复合物外,尚有多余的标记抗体和固相抗体。第二步是将反应液输入特殊的检测仪器的反应室中(图18-3),随即用含三丙胺(TPA)的缓冲液冲洗。反应室电极下有磁铁。含磁性微球的夹心复合物及游离的固相抗体被吸附在电极表面,游离的标记抗体随冲洗液流出。此时在反应室中即发生如图18-1的电化学发光反应。发出的光由光电倍增管转为信号,通过电信号的测定反映标本中抗原的含量。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290915_24991_1636364_3.jpg[/img]ECLI具有以下优点:①标记物在再循环利用,使发光时间更长、强度更高、易于测定;②敏感度高,可达pg/ml或pmol水平;③线性范围宽,>104;④反应时间短,20min以内可完成测定;⑤试剂稳定性好,2~5℃可保持一年以上。 四、在医学检验中的应用 放射免疫分析因标记物的放射性在应用中存在不少问题。为替代这一广被采用的测定方法,近年来创立了多种新的标记免疫技术。化学发光免疫测定具有明显的优越性:①敏感度高,甚至超过RIA;②精密度和准确性均可与RIA相比;③试剂稳定,无毒害;④测定耗时短;⑤测定项目多;⑥已发展成自动化测定系统。因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA,而且可得到更为广泛的应用。
[size=4]化学发光免疫分析 [/size][url=http://baike.baidu.com/view/1401709.htm][size=4]化学发光免疫分析[/size][/url][size=4](chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。[/size]