免疫荧光检测仪

前言免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，它是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。一、实验步骤免疫荧光实验的主要步骤包括 样片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育、封片及荧光检测等。1、 样品准备对于单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过（70%乙醇中浸泡）的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片即可，操作过程要小心，防止细胞脱片。对于悬浮生长细胞，有两种方式，一种是取对数生长细胞，制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入封闭液中固定，封闭后滴加一抗和二抗孵育；另一种是先在悬浮液中进行固定和染色，离心洗脱后，用移液管移至盒式玻片进行后续抗体孵育。对于冰冻切片制备，建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。组织一定要冷冻适度，切片时选用干净锋利的刀片，防止裂片和脱片。对于石蜡切片的制备，要先进行脱蜡和抗原修复的处理。2、固定做好切片并风干后立即用合适的固定液（固定液包括有机溶剂和交联剂，其选择取决于抗原的性质及所用抗体的特性）进行固定，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。固定时间则取决于固定组织切片的大小和类型，对大多数组织，18-24h即可，而细胞的固定时间较短。3、通透针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透剂进行通透，这一步的目的是使抗体进入胞内。 4、封闭为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用封闭液（一般包括与二抗同一来源的血清、BSA或者羊血清）封闭，减弱背景着色。封闭开始后，要注意样品的保湿，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景。5、一抗孵育一抗孵育温度一般分为：4℃、室温、37℃，其中4℃效果更佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃孵育1-2h，4℃过夜（从冰箱拿出后37℃复温45min）。具体条件还要根据样品、稀释液等条件进行摸索尝试。6、荧光二抗孵育荧光二抗孵育一般在室温或37℃孵育30min-1h，该过程必须在避光环境下进行，防止荧光淬灭。荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能会有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时采用小包装并进行适当的离心。7、复染一般采用DAPI进行复染，目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。8、封片为了长期保存，我们需要对样本进行封片，用吸水纸吸干爬片上的液体，一般用缓冲甘油等或专门的抗荧光淬灭的封片液。9、 荧光观察有条件的话最好立即用荧光显微镜观察拍照，若不能及时拍照，也要做好封片和封固，保持避光和湿度。荧光显微镜的成像能力对最终的结果也会造成很大的影响，好的荧光显微镜能够最大限度地收集荧光信号，并呈现高分辨率的图片，使细节更清楚，更易得到一张效果极佳的结果图。注意：切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染；(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。可使用浸洗方式；(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质；(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求（建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M；中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。根据上述步骤完成免疫荧光实验后，就需要进行荧光显微成像，得到我们想要的结果。选择一款操作简单、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：☑ 正倒置一体快速切换：切片、细胞观察随心切换，无惧任何耗材；☑ DHR数字降噪功能：极大地降低了背景噪音和荧光干扰，提高图像锐度，加深细节，得到分辨率更高的图片；☑ 强大的Z-Stacking功能：通过高精度电动化Z轴层扫来扩大景深，解决厚样本观察问题，提高图像分辨率；☑ 500MP单色相机：能够采集更多荧光信号，助力低荧光强度样本观察；☑ 多通道荧光自动拍摄叠加功能：可自动进行多通道成像的叠加，个性化选择查看/保存各通道的组合图像。

大家好，我是流式荧光崔工，一个旨在链接与流式荧光相关的朋友，一起赚钱、一起学习、一起工作、一起生活的靓仔。——流式荧光崔工上期回顾：《流式荧光技术检测与化学发光技术检测那些事儿》— 1 —前两天有位老师问崔工，流式抗体与免疫组化抗体有什么区别？崔工收集了网络上的一些回答，供参考：崔工收集了网络上的一些回答，供参考：回答1：两种抗体不一定通用，流式是用直接标记还是间接标记？如果是直接标记的话，那这个抗体一般不是FITC标记或者就是TRITC，PE之类的。如果恰好你的免疫组化，也是想用荧光素标记的抗体来直接标记，那就可以通用。如果你的免疫组化要用其它的标记的话，或者是间接标记的话，就有麻烦，因为荧光素的标记很可能会影响二抗和一抗的结合。回答2：流式抗体是用于流式细胞仪检测的抗体，与之相对应的有免疫组化抗体，免疫荧光抗体等等。回答3：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。崔工还请教了一位做抗体的朋友，他的回答是这样的：表位抗原有差异，免疫组化抗体要实现不同组织的定位，半定量特异性检测，流式是定量表达。— 2 —不同的实验对抗体有不同的要求崔工觉得首先可以从抗体的应用原理及特点从侧面来了解会更加清楚。抗体的应用一般来说除了做流式和免疫组化外，还可以做免疫荧光等其他实验。免疫组化是利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学的方法使标记抗体显色，对组织胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测。免疫荧光是利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的荧光标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光。在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技术。流式荧光一样是利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的荧光标记技术，过激光激发使荧光素发出荧光。不过检测是通过流式细胞仪来检测的。— 3 —再从WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC对抗体需求有什么区别来看WB的蛋白经过加热变性之后都变成线性的结构。因此最好的抗体是采用非常特异序列的人工合成多肽的方法来做实验，结果也非常特异。IP/CHIP. 我们用抗体去结合生理状态下的蛋白质，因此IP的抗体最好使用纯化的天然蛋白制作的抗体来做，也可以用纯化的重组蛋白的抗体。最好不要用人工合成多肽制作的抗体，因为这种抗体识别的位点可能被深深地藏在了蛋白的内心深处。CHIP和IP没有太大的区别，唯一的问题在于，如果抗体识别的表位和该蛋白质与DNA结合的部位一致，则会导致CHIP实验的失败。 IF/IHC. 免疫荧光和免疫组化中需要进行固定一步，固定是为了尽量让细胞的形态结构维持和原有的一致。这种化学物质的固定使蛋白质变性凝固，与天然状态下的蛋白质有了一定的区别，但是又不同WB中加热变性变成了线性的结构。因此在做IF/IHC实验中，最合适的抗体可以是纯化的重组蛋白得到的抗体，也可以是人工合成多肽得到的抗体（多肽是在蛋白质的表面）。FC. 流式细胞中分为两种，一种是活细胞的流式，这种流式最好采用是天然蛋白或者重组蛋白的抗体来做，另外一种是经过固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗体一致。在做流式细胞中，我们有直接标记和间接标记，间接标记不如直接标记真实准确。因此我们选择流式抗体要采用带有荧光标记的抗体；如果研究的蛋白没有直接标记的抗体，那么就采用间接标记抗体，需要添加荧光二抗。—————————————————————【行业征稿】若您有生命科学、医药、临床等行业相关研究、技术、应用、管理经验等愿意以约稿形式共享，欢迎自荐或引荐投稿联系人：刘编辑（点击查看KOL主页）word图文投稿邮箱：liuld @instrument.com.cn微信：JaysonXY（备注来意：投稿）

什么是免疫荧光技术？免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。免疫荧光方法中主要步骤：1）冰冻切片制备 2）组织切片固定3）血清封闭 4）一抗孵育条件5）二抗孵育条件 6）复染 7）封片 8）切片清洗荧光显微镜标本制作要求：1、载玻片：载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光，有时需用石英玻璃载玻片。2、盖玻片：盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。3、标本：组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。4、封裱剂：封裱剂必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。5、镜油：必须使用无荧光镜油。荧光玻片如何来检测呢？荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过荧光显微镜来观察。Revolve Gen 2正倒置一体电动荧光显微镜★ 高分辨率3D成像，获得最佳成像效果★ 正倒置一体，一机两用★ 智能化操作，高效便捷