量多蛋白稳分析

现在，在实验研究基础上，借助多方面的生物信息学方法，可以快速高通量的预测和进行蛋白质鉴定蛋白翻译后修饰。分泌蛋白和膜相关蛋白附着于细胞膜上的或将被排泄出去的蛋白质是由细胞内质网膜上附着的核糖体合成。附着有核糖体的内质网被称为糙面型内质网。这类蛋白质都含有一个N-末端（或氨基端），我们称之为信号序列或信号肽。这个信号肽通常情况下含有13-36个主要疏水性残基，同时它含有多蛋白复合物，我们称之为信号识别粒子(SRP)。这种信号肽在通过内质网膜之后会被去除。信号肽的去除过程是在信号肽酶催化作用下完成的。含有一个信号肽的蛋白质被称为前蛋白，有别于原蛋白。然而，某些用于分泌的蛋白在分泌之后会进一步被蛋白水解，因此包含有原蛋白的序列。这类蛋白质被称为前原蛋白。蛋白水解性裂解许多蛋白质在翻译之后会经历水解性裂解过程。其中最为简单的形式是去除起始蛋氨酸。许多蛋白质合成了不活跃的前体细胞，这些细胞只能在合适的生理条件下通过限制性蛋白水解过程产生活性。在凝血过程中使用到的胰腺酶和酶类就是后者的例证。多肽去除时产生活性的不活跃的前体蛋白，我们称之为原蛋白。前原蛋白的翻译后加工过程的一个复杂的例子就是脑垂体分泌合成的前阿黑皮素原的裂解过程（有关前阿黑皮素原的讨论，见肽类激素页）。这类前原蛋白经过复杂的裂解，根据合成的前阿黑皮素原的细胞定位而不同，其路径也有所不同。另一个前原蛋白的例子就是胰岛素。由于胰岛素是由胰腺分泌的，因此它有一个前肽。随着含24个氨基酸的信号肽的裂解，这类蛋白也折叠成了胰岛素原。胰岛素原进一步分裂，产生活跃的胰岛素，它包含两个肽链，由二硫键进行连接。但仍有其他的蛋白（酶类）被合成为非活跃的前体细胞，被称为酶原。酶原在蛋白水解性裂解时会产生活性，在凝血串联蛋白质链的若干蛋白质中都会发生这种现象。甲基化作用蛋白翻译后的甲基化过程主要发生在氮原子和氧原子上。活性甲基供体是活性腺苷甲硫胺酸(SAM)。最常见的甲基化作用发生在赖氨酸残基的ε-amine上。脱氧核糖核酸组蛋白中赖氨酸残基的甲基化作用可调节核染色质结构，因此可调节其转录活性。赖氨酸原本被认为是一种常设共价标记，可提供长期信号，甚至包括转录记忆时的组蛋白依赖机制。然而，最近的临床研究表明赖氨酸甲基化作用与其他共价修饰体相似，作用时间短，并能通过反脱甲基化活动进行动态调节。最近的组学研究发现表明，赖氨酸残基的甲基化作用不仅发生在核染色质层面，而且还通过修订转录因子影响基因表达。组氨酸的咪唑环，精氨酸的胍基部分以及谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组酰胺（R-group amides ）上，都发现了额外的氮甲基化作用。谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组羧化物也会发生氧甲基化作用并形成甲基酯。蛋白可能在半胱氨酸的R[

高压制备和中低压制备,是不是很多蛋白纯化都是直接用中低压就可以完成，纯度完全可以达到要求，中低压市场高压是不是有在很多方面不能取代，求实例

PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件：样品点样制备工作站（SymBiot 1）、生物质谱工作站（Voyager-DE PRO）和自动化分析软件（AutoMS-Fit）。SymBiot1 是一个自动样品处理系统，支持亚微升级微量点样，具有快速省时、重现性好的特点；Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统，配有AB公司之专利—延迟检测技术，具有高分辨率、质荷比宽等特点；AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库，查询参数可以任意设定，检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分，该组分理化性质不清楚，天然含量十分低，并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析，仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成，分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分（洗脱梯度增加了2.5倍），证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛，基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判，为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定，还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，提供相关生物信息学服务，并且还可以利用源后衰变（Post Source Decay，PSD）技术来获得样品的MS/MS数据，以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率，使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值，过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解，产生一系列碎片离子，在反射器的作用下，最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后，即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术，还可以对磷酸化，糖基化等翻译后修饰进行定位分析，同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.（1997）将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一，PS1的精确度可以达到10 ppm，灵敏度为fmol，分子量检测范围可达到500 kDa，每天可自动分析40-100个样品，适用于大规模“蛋白质组学”研究。

本文引用自发酵《在发酵工艺角度看蛋白表达》引用发酵 的 在发酵工艺角度看蛋白表达在分子生物学角度讲，找到或合成外源蛋白基因，构建质粒，并导入细胞以表达具有生物活性的折叠正确的蛋白，是一种成熟的常规技术。目前，包括酶，抗原，抗体，激素，其他小分子调节蛋白在内的很多蛋白，都已经用这种技术实现了工业化生产。在具体的工艺选择上，历史沿袭习惯和表达体系的选择，对工艺稳定性，成本，有巨大的影响。 目前，常用的蛋白表达系，有3个类别：1，大肠杆菌表达系。大肠杆菌的遗传背景十分清楚，代谢相对简单，发酵副产物少，在不是很严格的情况下，是表达蛋白的首选。通过按经验选择合适的菌株及合适的质粒，既可以以包涵体的形式得到大量的目标蛋白，又可以在细胞外得到可溶性蛋白，是常见的一种表达系。2，酵母菌表达系。用酵母做表达系，理由之一，也是遗传背景清楚，而且，当蛋白分子量过小，不能形成包涵体时，或蛋白的二硫键过多，不易体外复性时，酵母菌就成了合适的选择。另外，酵母对蛋白也会有一个简单的修饰，近似于高等动物的蛋白糖基化过程。这样，在合成在体液中发挥作用的蛋白，而且，又不能（技术水平限制）用动物细胞时，就可以退而求其次的选用酵母菌表达。一般是用信号肽把蛋白导出细胞，在发酵液中以可溶性蛋白的形式存在。这也是一个常见的表达系。3，动物（或说，人的）细胞表达系。这种情况，在纯度或毒性方面有较高要求的产品应用。一般国外产品应用较多，国内还没有用动物细胞表达蛋白实现商业化生产的报道。由于技术限制，国内工业化生产用这个方法目前还有较大难度。这3种表达系，各自有自己的优缺点。首先，在潜在的毒性影像方面讲，由于和真核生物亲缘关系太远，大肠杆菌就最不合适。其次是酵母菌。而在表达量和代谢控制成本上来讲，酵母菌和动物细胞又是差强人意的。现在，很多蛋白习惯性的选用酵母菌做表达系，就是因为早期提取蛋白技术低下，而动物细胞培养技术又不过关的原因所致。目前，虽然提取工艺提高了，但作为蛋白这种高附加值产品，运作成本集中在销售而不是生产，所以，降低生产成本的诉求很低。站在降低开发难度的角度讲，一方面，质粒构建和质粒与菌株的匹配方面依赖大量经验，另一方面，发酵工艺策略选择与发酵工艺优化又需要很大的投入，所以，技术开发部门沿用自己熟悉的，已经积累了大量经验的表达系，是合理的。不过，随着分子技术进一步的发展，分子技术进入低附加值的产品领域又是必然的，降低生产成本就变的越来越必要了。 大肠杆菌表达系有两种得到外源蛋白的方法：1，缓慢的表达，得到可溶性蛋白，这种方法产量和酵母菌表达类似，与酵母菌比，不具有明显的优势，一般是有做大肠杆菌传统的研究机构生产小分子蛋白的一种沿袭性做法。2，使用T7启动子表达蛋白，这样，高速的蛋白表达速率使蛋白来不及折叠，在细胞内形成非水溶性的包涵体。最后目标蛋白可以达到总细胞质量的15%-25%，这样，就为降低成本提供了一种可能。不过，在使用T7启动子表达时，也存在两个难点：1，蛋白的复性技术，如果形成可溶性蛋白，那利用（使用分子技术加载在目标蛋白上）信号肽，只要过一遍柱子就能分离得到纯度非常高的，具有生物活性的产品，而形成包涵体，对提取，复性就有较高的要求，特别是二硫键的存在，会对复性产生很大的影响。在目前国内和国际流行技术看，并不是所有的蛋白都能在预定成本下复性的。2，任何情况下，高产都是代谢网络互相依赖与作用的结果。在如此高的表达量下，甚至细胞的形态都已经发生很大变化，正常代谢受到严重干扰，以至于放大时，摇瓶工艺对发酵工艺几乎没有任何参考价值。发酵工艺策略的选择将直接依赖于工程人员在生化，生理水平对菌株的理解，而匮乏可资参考的数据资料。发酵工艺的优化要离开摇瓶经验在发酵罐上逐步进行，这样，整个发酵工艺的确立就需要比想象中要大得多的人员与时间的投入。另外，再说一下糖基化的问题。在动物细胞内合成的折叠正确的蛋白，在分泌入体液前会有一个糖基化的过程，加上一个糖链就不会很快被蛋白酶当做折叠错误的蛋白水解掉。但是以微生物为表达系表达的蛋白，不具有动物细胞的修饰过程，用大肠杆菌表达的目标蛋白，很快会在血液中被降解。解决或回避这个问题，有两种方法：1，用动物细胞表达，一般，是用癌化的人类细胞。由于动物细胞培养技术要求过高，在国外比较昂贵的医药中有应用，国内不常见。2，由于酵母菌也有一个对蛋白的粗略的修饰过程，可以用酵母菌表达目标蛋白。这个技术，国内国外都在用，可以是一个权宜之计。主要难点集中在对合适菌株的分子水平的改造，以达到尽可能接近满意的修饰效果。这样，就可以在不同目标蛋白上表达系和发酵工艺上做出选择。如果是小分子，无糖基化修饰或不在体液中发挥作用的蛋白，可以选择大肠杆菌和酵母菌表达系，得到可溶性蛋白，然后提取。如果分子量合适，并对生产成本有诉求，而且可以比较方便的复性，则选用大肠杆菌表达系，得到包涵体，然后复性。如果是需要在体液中发挥活性并有糖基化要求的 蛋白，则选用经过分子生物学改造的酵母菌表达系。当然，并不是任何一个实验室都同时拥有或擅长所有的方向的。而难点，往往集中在以下3个方面：1，大肠杆菌蛋白包涵体复性。2，糖基化修饰。3，发酵工艺（工程菌株的工业水平）的确定。做工程一般是理科实验室的弱项，而工科实验室做基础又很少，在把工科和理科结合方面，我们实验室还是有经验和成功先例的。下面，以溶菌酶为例，阐述一下蛋白表达系的选择和工艺的确定。溶菌酶是一类具有种属差异的非特异性免疫物质，在动物界中普遍存在，种类繁多，其实，在植物和微生物中也有发现。但研究最多的还是动物。开发兽用溶菌酶，主要是想作为抗生素的替代物，作为添加剂使用。因此是一个低附加值的产品。下面一切的工作，都会围绕“兽用”和“低附加值”展开。首先，比较几种常见和认为有效的溶菌酶，杀菌效果最好的是人的溶菌酶，但考虑到潜在的危险（具有对人溶菌酶产生抗性，并使抗性基因扩散），舍尔求其次，用了鸟类蛋清溶菌酶，作为表达对象。然后，在得到溶菌酶蛋白的一级结构后，对此进行了分析。此蛋白不会用于体液内，故没有糖链修饰的问题。分子量不是很大，但也不太小，130左右的氨基酸构成，足以形成包涵体，这就为用大肠杆菌表达系高效表达提供了可能。讨厌的是有4个二硫键，其中有两个在结构复杂区域，折叠正确有一定的困难。但是，如果用酵母菌做，可能没法解决成本问题，即便优化工艺现在过去了，也不会是最终版本----肯定会有人用大肠杆菌做。所以，结论就是必须知难而进，拿下复性工艺。另外，由于是低附加值产品，发酵吨位就不能太小。以往分子生物学流行的50升，100升小罐发酵，肯定是不行的。发酵罐的放大，除了溶氧，剪切力发生变化，更重要的是搅拌线速度改变了胞外酶以及包括细胞本身的代谢方式和速度。在胞内体现就是氧化还原电势的改变，这在工艺上会带来很多麻烦。虽然说，一般是放大后产量往往提高，但放大过程中，小罐的经验就不能照搬了。同时，也因为是低附加值产品，发酵过程中诸如质粒丢失等稳定性要求，就很高了，应为只有稳定，才能控制成本。这样，工艺就成了第二个难点。明白这些之后，按照大肠杆菌的喜好，合成了溶菌酶的基因。然后构建质粒，导入细胞。在摇瓶水平表达溶菌酶。在筛选复性条件的同时，就同时在发酵罐水平对工艺稳定性进行了优化。首先，为了进一步提高质粒稳定性，对初始培养基进行了重新设计。并改动发酵工艺策略，由于是胞内产物，我们应用高细胞密度发酵控制法延长限制性生长时间（不能用经典发酵的延长对数期生长时间的办法，对工程菌不适合，会造成质粒丢失，代谢紊乱等一系列问题），提高细胞量，并改变了诱导时机，得到了稳定的高产，具体数据比较枯燥，就不在此展开了。提取方面，经过不懈的努力，我们也掌握了比较成功的复性条件（具体由另外人员负责，也不做详细介绍了）。这样，工艺才基本拼凑好。进一步优化，在试生产多次重复时在进行。以上，是外源蛋白表达的粗略的技术和工艺的过程。

http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378379551.jpg 氨基酸是蛋白质的基础组成单位，通过研究蛋白质中氨基酸的性质和组成来预测蛋白质的结构和功能，蛋白质氨基酸残基组成分析主要是通过氨基酸分析仪来完成的，本文推荐了2个基于氨基酸组成进行蛋白质预测软件。基于氨基酸组成的蛋白质预测软件根据组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质可以辨析电泳等实验中的未知蛋白质，也可以分析已知蛋白质的物化性质。ExPASy工具包包涵的程序：AACompIdent：与把氨基酸序列在SWISS-PROT库中搜索不同，AACompIdent工具利用未知蛋白的氨基酸组成去确认具有相同组成的已知蛋白。该程序分析时需提交的相关信息包括：蛋白质的氨基酸组成、等电点pI和分子量(如果知道)、正确的物种分类及特别的关键词。此外，用户还需在六种氨基酸“组合”中作出选择，这影响到分析如何进行。例如，某种“组合”会把残基Asp/Asn(D/N)和Gln/Glu(Q/E)组合成 Asx(B)和Glx(Z);或者某种残基会在分析中被完全除去。对数据库中的每一个蛋白序列，算法会对其氨基酸组成与所查询的氨基酸组成的差异打分。由电子邮件返回的结果被组织成三级列表：第一张列表中的蛋白都基于特定的物种分类而不考虑pI和分子量;第二张列表包含了不考虑物种分类、pI和分子量的全体蛋白;第三张列表中的蛋白不但基于特定物种分类，并且将 pI和分子量也考虑在内。虽然计算所得结果各不相同，但零分表明了该序列与提出的组成完全相符。AACompSim：AACompIdent的一个变种，AACompSim提供类似的分析，但与前者以实验所得的氨基酸组成为依据进行搜索不同，后者使用SWISS-PROT中的序列为依据。有报道称，氨基酸组成在物种之间是十分保守的(Cordwell等，1995)，并且通过分析氨基酸的组成，研究者能从低于25%序列相似性的蛋白之间发现弱相似性(Hobohm和Sander，1995)。因此，在“传统的”数据库搜索基础上辅以组成分析，能为蛋白质之间关系提供更多见解。PROSEARCH：PROPSEARCH也提供基于氨基酸组成的蛋白质辨识功能。用144种不同的物化性质来分析蛋白质，包括分子量、巨大残基的含量、平均疏水性、平均电荷等，把查询序列的这些属性构成的“查询向量”与SWISS-PROT和PIR中预先计算好的各个已知蛋白质的属性向量进行比较。这个工具能有效的发现同一蛋白质家族的成员。可以通过Web使用这个工具，用户只需输入查询序列本身。分子量搜索(MOWSE)分子量搜索(MolecularWeightSearch，MOWSE)算法利用了通过质谱(MS)技术获得的信息。利用完整蛋白质的分子量及其被特定蛋白酶消化后产物的分子量，一种未知蛋白质能被准确无误地确认，给出由若干实验才能决定的结果。由于未知蛋白无需再全部或部分测序，这一方法显著地减少了实验时间。MOWSE的输入是一个纯文本文件，包含一张实验测定的肽段列表，分子量范围在0.7到4.0Kda之间。计算过程基于在OWL非冗余蛋白质序列库中包含的信息。打分基于在一定分子量范围内蛋白中一个片段分子量出现的次数。输出的结果是得分最佳的30个蛋白的列表，包括它们在OWL中的条目名称、相符肽段序列、和其它统计信息。模拟研究得出在使用5个或更少输入肽段分子量时，准确率为99%。该搜索服务可通过向mowse@daresburg.ac.uk发送电子邮件实现。为获得更多关于查询格式的细节信息，可以相该地址发送电子邮件，并在消息正文中写上“help”这个词。蛋白质氨基酸组成分析用盐酸在110 ℃将蛋白或多肽水解成游离的氨基酸，用氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量。采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通HPLC相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化(例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等)通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统(钠盐系统)和游离氨基酸分析系统(锂盐系统)，利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好;锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度(即最低检测限)比HPLC柱前衍生方法稍低以外(HPLC：0.5 pmol;氨基酸分析仪：10 pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。蛋白质氨基酸残基组成分析的主要步骤包括：首先是蛋白被水解为氨基酸，其次是采用离子色谱等方法进行游离的氨基酸含量和组成的分析。总之利用蛋白可以分析氨基酸，利用氨基酸也可以研究蛋白质。

蛋白分析系统在我们选择蛋白分析工具的时候，通常是根据不同的蛋白来选择不同的分析手段，如凝胶电泳、化学荧光染色、质谱等等。但是目前已经研制出的蛋白分析工具的种类繁多，从这一方面也在一定程度上反映了蛋白分析的复杂性。以下是一些近期推出的蛋白分析系统，希望能帮助您轻松完成研究工作。

最近在做几个酸性蛋白的CIEF。贝克曼的方法比较适用于中性和偏碱性的蛋白分析，对于酸性蛋白分析效果不太理想。氨水迁移法比较适合酸性蛋白，但是据说很伤柱子，做不了几个样品。讨论一下，有没有人遇到同样的问题，是怎么优化方法的呢?我尝试调整占位剂的配比，暂时也没有得到理想的结果。

求购 质谱分析的蛋白标准品，MALDI-TOF-MS上用的。 分子量在400--30000da 的或者接近这个质量范围的，如有请联系我。直接给我这个留言就可以，谢谢！

我想请问一下用ESI测定蛋白分子量是要用什么作为质量分析器呢？此外，测定蛋白分子量是用ESI好还是MALDI好呢？然后样品是脱盐以后直接进样就可以了吗？望解答。

牛奶蛋白质分析仪可以用于检测乳蛋白制品。以下是详细解释和相关信息：　　功能与应用：牛奶蛋白质分析仪是一种专门用于分析牛奶及其制品中蛋白质含量的仪器。它基于先进的生化分析技术，如比色法、光谱法或电化学法等，能够准确、快速地检测样品中的蛋白质含量。　　乳蛋白制品的检测：乳蛋白制品，如奶粉、酸奶、奶酪等，其蛋白质含量是产品质量和营养价值的重要指标。牛奶蛋白质分析仪可以有效地检测这些乳蛋白制品中的蛋白质含量，为生产厂家提供准确的质量控制手段。　　优点与特点：　　准确性高：牛奶蛋白质分析仪具有高灵敏度和高准确性，能够确保测量结果的可靠性。　　快速便捷：该仪器操作简单，使用方便，可以快速得出测量结果，提高检测效率。　　适用范围广：除了牛奶及其制品外，还可以用于其他含蛋白质样品的检测，如豆类制品、肉制品等。　　在乳品工业中的重要性：随着乳品市场的不断扩大和消费者对乳制品质量要求的提高，牛奶蛋白质分析仪在乳品工业中的重要性日益凸显。它可以帮助乳品企业提高产品质量、降低生产成本，同时为消费者提供更加安全、健康的乳制品。　　综上所述，牛奶蛋白质分析仪是一种功能强大、应用广泛的检测仪器，完全可以用于检测乳蛋白制品中的蛋白质含量。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/05/202405271615421543_8284_6238082_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

最近在做公司产品含药量的释放情况，释放液是加了牛血清白蛋白的PBS液，释放后产品从释放液中取出，注射用水洗净后晾干。产品上残留药品再用乙酸乙酯超声洗脱，用UV测定乙酸乙酯中的药品浓度。因最近新换了牛血清白蛋白，后来实验数据与前比似乎有点偏低，怀疑产品上牛血清白蛋白没洗干净，对UV吸收有影响？牛血清白蛋白对UV吸光度值有什么影响呢？哪里有供应质量稳定的牛血清白蛋白？

[font=宋体]在生命科学领域中，包涵体复体的研究占据了重要的地位。但随着研究的深入，一些问题逐渐浮现。本文将对包涵体复体研究中常见的挑战进行解析，以及为研究者提供一些解决思路。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]①包涵体复性原则[/b]：[/font][font=宋体]低浓度，平缓梯度，低温。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②怎样洗涤包涵体？[/b][/font][font=宋体][font=宋体]通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到[/font][font=Calibri]4M,[/font][font=宋体]离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]③对于尿素和盐酸胍该怎么选择[/b][/font][font=宋体][font=宋体]尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素[/font][font=Calibri]8-10M[/font][font=宋体]，盐酸胍[/font][font=Calibri]6-8M[/font][font=宋体]。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为[/font][font=Calibri]70-90%[/font][font=宋体]，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]盐酸胍溶解能力达[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]④[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]尿素溶解的包涵体溶液应如何保存[/font][font=Calibri]?[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]度放置半个月，都没什么问题 。在室温放置超过[/font][font=Calibri]48[/font][font=宋体]小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理[/font][font=Calibri]BI[/font][font=宋体]溶液比较好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑤复性时的蛋白浓度[/b][/font][font=宋体][font=宋体]一般使用浓度为[/font][font=Calibri]0.1-1.0mg/ml[/font][font=宋体]，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑥蛋白复性后浓度低[/b][/font][font=宋体]蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可以将复性好的蛋白浓缩一下跑胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白，需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出来，复性后的蛋白高速离心看看。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑦复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？[/b][/font][font=宋体]出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]复性应该采取复性液浓度和[/font][font=Calibri]PH[/font][font=宋体]值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]PH[/font][font=宋体]或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]若加变性剂尿素可加到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]，盐酸胍可加到[/font][font=Calibri]1-1.5M[/font][font=宋体]；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]另外可将甘油浓度增加，范围可在[/font][font=宋体]≤[/font][font=Calibri]30%[/font][font=宋体]，且在复性样品中也可加适量甘油。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑧复性效果的检测[/b][/font][font=宋体]根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。[/font][font=宋体][font=宋体]光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（[/font][font=Calibri]CD[/font][font=宋体]）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]色谱方法：如[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]RP-HPLC[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CE[/font][font=宋体]等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。[/font][/font][font=宋体]生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。[/font][font=宋体]黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。[/font][font=宋体][font=宋体]免疫学方法：如[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]WESTERN[/font][font=宋体]等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑨变性的[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/fusion-protein]融合蛋白[/url]可以制备多抗或者单抗吗？[/b][/font][font=宋体]变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑩纯化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？[/b][/font][font=宋体]免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]更多蛋白复体详情可以关注义翘神州网！[/font]

维纶基牛奶蛋白纤维和维纶基大豆蛋白纤维定性分析的研究维纶基大豆蛋白纤维是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明，在纺织行业得到了快递的发展，广泛的应用，但与维纶基大豆蛋白纤维一样由我国企业自主研发的维纶基牛奶蛋白纤维也申请到专利好几年了，但迟迟没有相关标准的出台，使这一我国自主研发的新型纤维得不到有效利用新型纤维的不断推出，为我们提供了更多的纤维原料，但同时由于国家标准的相对滞后，给检测工作者带来了很大的难题，下面就目前市场上两种新型蛋白复合纤维给予试验，进行定性分析。主要原理是在观察了维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维显微结构和燃烧性状后，研究两者在常用化学试剂中的溶解性。试验结果表明，维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维在88%甲酸和浓硝酸中都能够部分溶解；在沸腾水浴中，维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维能够完全溶解于75%硫酸和98%硫酸牛奶蛋白纤维是再生蛋白质纤维，是以牛奶为原料经脱水、脱脂、分离、纯化、浓缩制成牛奶酪蛋白，与高分子化合物共混、共聚制成纺丝液，再经湿法纺丝而成；牛奶酪蛋白与聚乙烯醇制得的纤维称为维纶基牛奶蛋白纤维；牛奶酪蛋白与纤维素共聚制得粘胶基牛奶蛋白纤维。牛奶蛋白纤维含有多种氨基酸，具有良好的亲肤性和吸湿导湿性，抗菌防蛀，服用性强，受到消费者的青睐。维纶基牛奶蛋白纤维呈浅黄色，是由牛奶酪蛋白和聚乙烯醇大分子共混、共聚、醛化、揉和、脱泡，湿法纺成的纤维，克服了合成纤维吸湿性差和天然纤维强度低的不足，其比电阻介于天然纤维和合成纤维之间，吸湿性也优于聚乙烯醇纤维，在直接染料、弱酸性染料、活性染料和中性染料中都有良好的上染能力。本文在观察维纶基牛奶蛋白纤维和维纶基大豆蛋白纤维显微结构和燃烧性状后，研究两者在常用化学试剂中的溶解性，为纤维检测提供参数。大豆蛋白纤维属于再生植物蛋白纤维类，是以榨过油的大豆豆粕为原料，利用生物工程技术，提取出豆粕中的球蛋白，通过添加功能性助剂，与腈基、羟基等高聚物接枝、共聚、共混，制成一定浓度的蛋白质纺丝液，改变蛋白质空间结构，经湿法纺丝而成. 其有着羊绒般的柔软手感，蚕丝般的柔和光泽，棉的保暖性和良好的亲肤性等优良性能，还有明显的抑菌功能，被誉为“新世纪的健康舒适纤维”。大豆纤维是以脱去油脂的大豆豆粕作原料，提取植物球蛋白经合成后制成的新型再生植物蛋白纤维，是由我国纺织科技工作者自主开发，并在国际上率先实现了工业化生产的高新技术，也是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明。1 试验1. 1试验材料、仪器和试剂纤维细度成分显微分析仪，万分之一电子天平；SHA-C水浴振荡器；鼓风恒温烘箱； 索氏萃取器；酒精灯；具塞三角瓶若干。甲酸（88%）；硫酸（75%）；浓硫酸（98%）；浓硝酸；1MOL/L次氯酸钠溶液;石油醚（馏程为40℃～60℃）。1.2试验方法显微结构试验：用纤维细度成分显微分析仪观察纤维的显微结构。 以下试验维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维同一方法分别做一次燃烧性状试验：点燃酒精灯，用镊子夹取10mg左右纤维束，徐徐靠近火焰，观察试样对热的反应情况。将纤维移入火焰，观察纤维的燃烧情况；然后离开火焰，观察纤维的燃烧情况，并用鼻子闻试样燃烧刚熄灭的气味。最后，待试样熄灭冷却，观察残留物灰分的状态。预处理：取纤维5g左右，用定量滤纸包好，置于索氏萃取器中，用石油醚萃取1h，每小时至少循环6次，待试样中的石油醚挥发后，把试样浸入冷水中浸泡1h，再在（65±5）℃的水中浸泡1h，浸泡过程中时时搅拌。水（mL）与试样（g）之比为100:1。然后抽吸脱水，晾干。溶解性试验：准确称取试样1g置于具塞三角瓶中，加入100mL化学试剂，在搅拌条件下观察不同温度下纤维和试剂随时间的变化情况。待一定时间后，洗涤，抽吸排液，烘干。2 试验结果2.1显微结构在显微镜下观察维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维的横截面呈腰圆形或哑铃形，纵向有沟槽，两种纤维在显微镜下几乎无差别，无法区分这两种纤维。2.2燃烧性状维纶基牛奶蛋白纤维与维纶基大豆蛋白纤维靠近火焰时现象都是熔融并卷曲；进入火焰，熔融、卷曲并燃烧；离开火焰，燃烧，有时会自然熄灭。燃烧过程中散发出蛋白质燃烧时所特有的臭味。纤维燃烧的一端形成黑褐色硬块。两种纤维在燃烧情况下，火焰颜色，气味几乎无差别，无法区分这两种纤维。2.3溶解性取维纶基牛奶蛋白纤维与和维纶基大豆蛋白纤维分别置于88%甲酸、75%硫酸、浓硫酸、浓硝酸和1MOL/L次氯酸钠溶液中进行溶解性试验， 品名/溶液88%甲酸[/ali

AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤很简单的，比较适合初学者。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=113913]AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤[/url]

尿微量蛋白（尿微量白蛋白/蛋白尿）试验（也称“白蛋白试验”，“尿微量白蛋白”和“蛋白尿”试验）何为尿微量白蛋白（白蛋白）试验？尿微量白蛋白试验是对尿液中的蛋白质进行测定的筛选试验。人体血液中有一种蛋白质称为白蛋白。在正常情况下，几乎无法在尿液中检测到。只有在肾脏受损，尤其是损伤早期，它可以优先于其他肾损伤标志物在尿液中被检测出，因此，尿微量白蛋白在诊断肾脏疾病、早期肾损伤等方面具有重要意义。此项试验有何目的？蛋白质是人体的基本构成“材料”，具备一些重要的功能和作用，可结合营养物质将其运输至各个组织，，并将人体中循环的体液量维持在适当水平。肾脏功能正常时，蛋白质几乎无法通过肾脏进入尿液（仅会排出血液循环产生的废料）。然而，如果人的肾功能受损或衰竭，该肾脏对蛋白质的过滤能力将有所下降，因而一些蛋白质将会透过肾脏而出现在尿液中，称为尿微量蛋白。尿微量白蛋白与蛋白尿有何不同？白蛋白是一种大量存在于血液中的典型蛋白质。因其分子个头小，当肾脏功能出现问题时，白蛋白是能够率先通过肾脏进入尿液的几种蛋白质之一。尿液中出现少量白蛋白的情况称为尿微量白蛋白。若肾脏功能受损严重，尿液中的白蛋白数量呈现出增长趋势，这种症状被改称为蛋白尿。尿微量白蛋白/蛋白尿有何症状？病症早期，并无明显症状或征兆显现。随着肾功能衰竭的加重，大量蛋白质出现在尿液中，手脚、腹部和面部可能出现肿胀。如果蛋白尿的情况加重，可能会造成永久性肾功能损伤，有些病人可能需要做透析或肾移植。不论上述症状是否存在，尿蛋白测定是确定有多少蛋白质进入尿液的唯一办法。蛋白尿还可能引发心血管疾病。血管受损除了会引发肾脏疾病外，还可能会造成窒息和心力衰竭。患蛋白尿（症）的高危人群有哪些？患有糖尿病、高血压、心血管疾病和其他类型肾脏疾病等慢性病的病人易出现蛋白尿。老年人、肥胖人群以及有肾脏疾病家族史的人群。其

[font='times new roman'][size=18px]常规蛋白组学分析方法[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]蛋白质组学是中心法则的下游，因此它要比基因组学更加复杂。和以相对稳定的方式存在的基因组比较，蛋白质组会由于蛋白质和基因的多种生化反应以及环境的影响而发生多种改变。首先计算并比较两组中三种样品之间蛋白质的差异表达状况，然后计算每组样品中蛋白质差异表达的显著性[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]P[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]值，选定表达差异倍数大于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1.5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]倍或小于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.67[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]倍且[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]P-value[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]significance A[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）小于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.05[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的蛋白质界定为差异表达蛋白质。通过基因本体数据库（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Gene Ontology[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GO[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）分析和京都基因与基因组百科全书（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Kyoto encyclopedia of genes and genomes[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]KEGG[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）通路富集分析进行相关生物信息学分析[/color][/size][/font][font='宋体'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='宋体'][size=16px][color=#000000]1 火山图[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]火山图可查看蛋白在两组样品中表达水平的差异以及差异的统计学显著性。图中每一个点表示一个蛋白，横坐标表示某一个蛋白在两样品中表达量差异倍数的对数值[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]纵坐标表示[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]P-value[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的负对数值。横坐标绝对值越大，说明表达量在两样品间的表达量倍数差异越大[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]纵坐标值越大，表明差异表达越显著，筛选得到的差异表达蛋白越可靠。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]热图[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]差异表达蛋白层次聚类分析热图：前三列代表对照组样品，后三列代表实验组样品。红色代表与对照组相比表达上调的蛋白，蓝色代表下调的蛋白。颜色亮度的深浅代表差异表达蛋白表达上调或下调的程度。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在对目标蛋白质集合进行[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GO[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]注释或[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]KEGG[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路注释的富集分析时，使用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Fisher[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]精确检验来比较每个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GO[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]分类或[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]KEGG[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，然后再评价某个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GO term[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]或[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]KEGG[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路蛋白质富集度的显著性水平。[/color][/size][/font]

[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体]在蛋白质研究领域，稳定细胞系的应用已成为生产高质量结构生物学蛋白质的关键手段。随着技术的不断进步，稳定细胞系的生成与筛选方法得到了显著改进，从而推动了蛋白质生产的高效化与精准化。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]细胞系的建立和应用[/font][font=宋体][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系[/font][/font][/b][font=宋体]因其稳定的蛋白表达和适当的翻译后修饰而被广泛用于结构生物学研究。这些细胞系能有效地生产具有复杂糖基化模式的蛋白质，这对于确保蛋白质的功能和稳定性至关重要。糖基化缺陷细胞系通过特定的基因改造，能够分泌脱糖基化糖蛋白，为蛋白质生产提供了更加纯净的原料。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系的生成[/font][/b][font=宋体][font=宋体]传统的稳定细胞系生成技术如瞬时转染，虽然方法简便，但存在整合频率低、转基因沉默等问题。为了克服这些困难，研究者们开发出了一系列新技术，如细胞分选技术、位点特异性重组（如[/font][font=Calibri]FLP/FRT[/font][font=宋体]系统）、转座子系统（如[/font][font=Calibri]piggyBac[/font][font=宋体]）、慢病毒系统以及噬菌体整合酶等，提高了稳定细胞系的生成效率和稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]序列特异性基因组工程也为稳定细胞系的生成提供了新的思路。通过敲除或修饰特定的基因，研究者们能够实现对细胞功能的精准调控，从而优化蛋白质生产的效率和纯度。例如，一种同时缺乏[/font][font=Calibri]GnTI[/font][font=宋体]和谷氨酰胺合成酶（[/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体]）活性的[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系被成功开发出来，为高效筛选具有[/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体]标记的稳定细胞系提供了有力工具。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系与瞬时转染的比较[/font][/b][font=宋体]稳定细胞系相较于瞬时转染具有多个优点，包括能够进行大规模生产和保持高水平的蛋白表达稳定性。尽管瞬时转染在某些情况下能快速产生大量蛋白，但其表达水平和重复性通常不如稳定细胞系。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]展望[/font][/b][font=宋体]近年来，利用稳定细胞系高效生产结构生物学蛋白质已成为研究的热点和趋势。通过引入新技术、优化筛选方法和改进整合系统，不仅能够提高蛋白质生产的效率和纯度，还能够为结构生物学研究提供更加精准、可靠的实验工具。随着基因编辑和细胞工程技术的进步，预计在未来，通过精确的基因操作能够更有效地创建和利用稳定细胞系。这些技术的进步将促进结构生物学和药物开发中蛋白质的高效和可持续生产。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]本文由义翘神州进行整理，同时提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][u][font=宋体][color=#0000ff]稳定细胞系构建服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体]，详情可点击了解！[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=Calibri]Büssow K. Stable mammalian producer cell lines for structural biology. [/font][i][font=Calibri]Curr Opin Struct Biol[/font][/i][font=Calibri]. 2015 32:81-90. doi:10.1016/j.sbi.2015.03.002[/font]

大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质纯化出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，表达蛋白纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的)，但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(overexpression)，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%.(一)试剂准备采用T7· Tag Affinity Purification Kit1. T7·Tag抗体琼脂。2. B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。4. 洗脱缓冲液： 0.1M柠檬酸，pH2.2。5. 中和缓冲液：2M Tris,pH10.4.6. PEG 20000.(二)操作步骤1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr,中间换液数次。8. 用PEG 20000浓缩蛋白。(三)注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。

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褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

[b][font=宋体][font=宋体]一、[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]蛋白全称[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]，全称为增强型绿色荧光蛋白（[/font][font=Calibri]Enhanced Green Fluorescent Protein[/font][font=宋体]），是一种在生物科学研究中广泛应用的荧光报告蛋白。它是由普通绿色荧光蛋白（[/font][font=Calibri]GFP[/font][font=宋体]）进行突变和优化得到的，相较于原始的[/font][font=Calibri]GFP[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]具有更高的荧光亮度和更稳定的性质。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]二、[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]蛋白大小[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]蛋白的大小为[/font][font=Calibri]238[/font][font=宋体]个氨基酸，分子量约为[/font][font=Calibri]27kDa[/font][font=宋体]。这个分子量相对较小，使其在融合蛋白、抗体标记等生物分子标记领域中具有广泛的应用价值。同时，[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]的相对分子量较小也意味着它对其他蛋白质的负担较小，这有助于保持标记蛋白质的天然状态和功能。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]蛋白序列[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]以下是[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]蛋白的氨基酸序列：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]MVHHIQGGGPGMPMPGEEMMMAAN[/font][font=宋体]稚[/font][font=Calibri]TSGSHMVHHIQGGGPGMPMPGEEMMMAAN[/font][font=宋体]稚[/font][font=Calibri]TSGSHMVHHIQGGGPGMPMPGEEMMMAAN[/font][font=宋体]稚[/font][font=Calibri]TSGSHMVHHIQGGGPGMPMPGEEMMMAAN[/font][font=宋体]稚[/font][font=Calibri]TSGSHMEEEEDVMKDVEEETPIPELMLLDMAAQDPIPELMLLDMAAQDPIPELMLLDMAAQDPIPELMLLDMAAQDPIPELMLLDMAAQDP[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]通过分析[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]的氨基酸序列，我们可以发现其中包含一些重要的结构域和功能位点。例如，在[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]的氨基端，有一个由数个甘氨酸和丝氨酸组成的“环状结构”，这个结构对于荧光发射起着关键作用。在羧基端，我们还可以看到一个“多肽区”，这个区域对于荧光亮度和稳定性也有重要影响。此外，在[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]的氨基酸序列中还包含多个突变位点，这些位点使得[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]相较于原始的[/font][font=Calibri]GFP[/font][font=宋体]具有更高的荧光亮度和更稳定的性质。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]四、总结[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]是一种重要的荧光报告蛋白，通过对其全称、大小和序列的深入了解，我们可以更好地理解其性质和应用。在实际的生物科学研究中，[/font][font=Calibri]EGFP[/font][font=宋体]已被广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物医学等多个领域，为科研工作者提供了强有力的工具，有助于推动生命科学研究的进步。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]蛋白标签[/b][/url]详情可以查看义翘神州网：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=Calibri] [/font]

GBT2910.101-2009 大豆蛋白复合纤维与某些其他纤维的混合物FZT 01102-2009 纺织品 大豆蛋白复合纤维混纺产品定量化学分析方法？都是测试大豆蛋白复合纤维的成分，问：问什么在同一年内有两个标准，但是内容几乎没有什么变化？目的是什么？

采用CEX分析蛋白电荷异质性，与主峰的相对保留时间差十分钟左右的是酸性或碱性峰么？通常情况下是不是酸性峰中性峰碱性峰三者挨着？谢谢

用UV-1750型分光光度计中的多波长法测蛋白含量，我将蛋白含量稀释到光密度在0.2-2.0之间，但是仪器自带的计算公式算出的结果和用双縮脲法测出的结果不一样，仪器自带的公式有谁知道？？还是我用的方法有什么问题？？ 方法：用生理盐水将蛋白稀释后（光密度在0.2-2.0之间），仪器自动算出蛋白质含量，根据含量乘以稀释倍数得到最终含量!

1994年，Marc Wilkins在Siena双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophoresis杂志上发表。随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，人们不再满足于对一个细胞或组织的蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量的研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛的应用。蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合体，表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表达的绝大多数蛋白质或一个复杂的混合体系中绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。目前最新的iTRAQ蛋白定量分析技术在此基础上被提出，并被得到广泛应用。仅仅知道蛋白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，一种特殊蛋白质在浓度上的变化，就能预示细胞的突变过程。因此，科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量，是很重要的事情。过去，科学家通常先进行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。可是，这种方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精确。新泽西医学及牙科大学的蛋白组学研究中心主任Hong Li说：“当我们开始蛋白组学研究时，就采用2D凝胶技术，但得出的信息量却让大伙很失望，因为许多蛋白质已经改变了自身的代谢过程，如热休克蛋白或者是管家蛋白。”蛋白组学中的方法一直在不断提高。基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。iTRAQ和iCAT是这些新进展中的两大主力，但是，新技术也有不尽如人意的地方，需要不断改进。iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术，是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。上海舜百生物公司目前所采用的就是这种iTRAQ技术。该技术的主要特点在于：1. 分离能力强、分析范围广；2. 定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；3. MS具备高灵敏度、检测限低；4. 分析时间快，分离效果好；5. 自动化程度高；6. iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。上海舜百生物使用的液相色谱仪的型号是日本岛津公司2D-nano-HPLC，质谱仪型号是美国ABI公司的MALDI-TOF-TOF 4700，标记试剂盒是美国ABI公司的ITRAQ标记试剂盒。舜田生物所采用的iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分（reporter group ），另一端是肽反应部分（peptide reactive group），中间部分是平衡部分（balance group）。 其中，reporter group：质量为114Da、115 Da、116 Da、117 Da，因此iTRAQ试剂共四种。 peptide reactive group：将reporter group与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。 balance group：质量为31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四种iTRAQ试剂分子量均为145 Da，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。舜百生物公司iTRAQ的操作程序如下：将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。再将标记的样本相混合，这样就可以对其进行比较。与样本结合后，通常用MudPIT多维蛋白质鉴定技术进行下一步的操作，用2D液相色谱串联质谱进行分析。在质谱分析鉴定特殊肽离子片断结构的基础上，采用美国应用生物系统公司的软件包MASCOT和Protein Pilot对每一个肽段进行鉴定。其具体操作如下图所示： http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1383890263png_small.jpgiTRAQ技术对检测标本也有一定要求。舜百生物要求检测蛋白量最低不少于50 ug，浓度最低不少于5 ug/uL，否则同位素无法标记。而对蛋白提取试剂也要求使用普通的组织、细胞裂解液即可，切忌不要使用二维电泳试剂提取。iTRAQ技术区别与以往二维电泳技术具有更明显的优势，两者比较如下：1. 二维电泳所检测的发生表达变化的蛋白都位于细胞浆内，而iTRAQ可检测到蛋白有胞浆蛋白外，还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。2. 二维电泳观察到的蛋白变化在2倍以上，而用iTRAQ计算出的蛋白变化在1.3-1.6倍之间。3. iTRAQ技术在鉴定大分子和小分子蛋白方面也有优势。4. 二维电泳是通过切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质，但该方法既不是非常敏感，也不是非常精确，获取的信息量很少。 而itraq技术是基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。5. iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白质和碱性蛋白质，而二维电泳对这些蛋白质都束手无策。由此，舜百生物得出结论：iTRAQ技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白，但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面，二维电泳技术有一定长处，对iTRAQ的实验结果有互补作用。