亲子鉴定测序仪

DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪（即DNA测序仪），采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP（标记终止物法），因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'''端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD（charge-coupled device）摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶（POP 6）和GeneScan胶（POP 4）。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析（SSCP）、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性（SNP）分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】1．BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。　　2．pGEM-3Zf（+）双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。　　3．M13（-21）引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。　　4．DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。　　5．引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13（-21）引物，T7引物等。　　6．灭菌去离子水或三蒸水。　　7．0.2ml或和0.5ml的PCR管，盖体分离，PE公司产品。　　8．3mol/L 醋酸钠（pH5.2）称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。　　9．70%乙醇和无水乙醇。　　10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。　　11．POP 6测序胶 ABI产品。　　12．模板抑制试剂（TSR）ABI产品。　　13．10×电泳缓冲液 ABI产品。　　14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。　　15．2400型或9600型PCR仪。　　16．台式冷冻高速离心机。　　17．台式高速离心机或袖珍离心机。

实验室要进行标准化认证，请问DNA测序仪可不可以进行检定和认证？如果可以的话，主要是采取什么方法？多谢了！

进入21世纪，自第一个植物基因组拟南芥被完整破解以来，有近300种植物的基因组被陆续破解，并在此基础上建立了相应的植物基因组数据库，中药材植物是其中重要的组成部分。中药材品种数量众多，一项市场调查发现，123种常用的中药材都有不同程度的掺假或混用的情况。传统的DNA条形码技术虽然具有很好的物种区分能力，但是一般是针对单一的物种进行鉴定，碍于桑格测序的技术局限性，其对多药味的中成药的鉴别存在困难。NGS测序则可以解决多药味处方的鉴别的问题，目前已有许多关于NGS技术应用于中药材产品的报道。Peng Zhang等尝试用Pacific Biosciences（PacBio）公司的单分子实时（Single-molecule Realtime，SMRT）测序技术对生脉散中各个药味进行检测，不同于传统的NGS测序，其开发了一种Full-lebgth Muiti-barcoding的策略，直接对ITS2和PsbA-trnH的片段进行了测序，并选择三味蒺藜散用于验证方法的可行性。最终通过不同通用DNA引物的组合可以实现对生脉散与三味蒺藜散中所有药味的鉴定，同时可以鉴定出外源性的物种，充分证明了此种方法用于中成药质量控制的可行性。由于龙胆泻肝丸中川木通的混用会引起马兜铃肾病，因此其质量检测要求比较严格，通过鸟枪法宏基因组测序技术使用Illumina HiSeq 2500平台对龙胆泻肝丸中的木通进行验证，从实验室制作的2个参考样本（RF01和RF02）中获得了ITS2、PsbA-trnH和MatK三个序列的共计129个有用的Contigs，实现了对木通及龙胆泻肝丸中其余药味样本的检测。将该方法应用于市场收集样本的检测，发现市场样品多存在产品投料缺失、伪品混用、川木通代替木通投料等情况，证明了该方法用于中药材尤其中成药质量控制方面具有可行性。Cheng等基于高通量测序方法开发了一种新的用于识别中药中生物成分的M-TCM方法，对六味地黄丸的生物成分进行分析。分析过程中选择了3批不同制造商的六味地黄丸的药材及自己实验室制备的参考样本，最终实现了对六味地黄丸中不同药味与外源性生物的检测，并通过该方法进一步验证了有些厂家以加工过的原材料进行投料生产的猜测。目前对于天南星的化学检测方法较少，且天南星根茎具有毒性，Li等通过高通量测序与实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术检测在传统如意金黄散处方中是否存在掺伪的情况，并通过是否能鉴别如意金黄散中有毒的天南星及其混伪品虎掌来确定此方法的可行性。结果显示，市场收集的如意金黄散样品中未检测到天南星与厚朴，却检测到了虎掌和当归，实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法与NGS测序的检测结果一致，进一步验证了结果的准确性。Xin等[44]利用PACBIO RSII SMRT平台对3份市场来源和2份实验室自制的九味羌活丸样品进行测序，通过对ITS2和PsbA-trnH两种DNA条形码的测序结果分析，发现实验室自制的样品中所有的药味均被检出，而市场购买的样品中黄芩、苍术、白芷、川芎等药味未被检测到，同时朝鲜苍术、白术等非处方药味和外源性的物种例如杜鹃属、牵牛属等却有检出。Williams A等[48]利用PacBio平台结合[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）的方法检测当归补血方中处方药味的投料是否准确，并通过高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]的方法检测当归和黄芪中的1338质量标志物，确定其剂量关系。