细胞密度仪

[align=left]【推荐讲座】[color=black]默克[/color]《[b]高细胞密度收获液的澄清工艺解决方案》 [/b][/align][align=left][b]讲座时间：[/b][/align][align=left][color=black]2017[/color][color=black]年11月16日 14:00:00[/color][/align][align=left][b]免费报名：[/b][/align][align=left][color=black][url]http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_3075.html[/url][/color][/align][align=left][b]会议内容：[/b][/align][align=left][color=black]单抗表达量的提高能够使生产企业获得更高的经济效益，细胞培养密度随此需求日益提高，细胞碎片，DNA，HCP 等杂质的量也大幅增加，这给后续的澄清工艺带来的巨大的挑战。澄清工艺的选择多种多样，各有利弊。本期研讨会将就澄清工艺的选择、絮凝技术和人工合成材质的深层过滤器介质在高细胞密度料液澄清中的应用展开深入探讨。[/color][/align][align=left][b]主讲人： [/b][/align][color=black]王立志，目前担任膜克生命科学工艺解决方案高级市场技术专员，负责大中华区的澄清及超滤产品相关的市场和技术事物。在加入默克之前，王立志先生在国内多家生物制品企业从事过研发，生产和验证工作，曾经参与了多个项目，拥有丰富的经验。[/color]

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[size=5][font=宋体]实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。[/font][font=Arial]OD600[/font][font=宋体]是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的[/font][font=Arial]OD[/font][font=宋体]值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。[/font][font=Arial][/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]分光光度计的重要配件[/font][font=Arial] —— [/font][font=宋体]比色杯[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][/size][size=5][font=宋体]比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。[/font][font=Arial][font=宋体]由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。[/font][/font][/size]

一．蔗聚糖—泛影葡胺（Feicoll-Hypaque）溶液 1．蔗聚糖――泛影葡胺可使红细胞聚集成串后沉降，及粒细胞沉降，最多用于人外周血单细胞分离，常用400×g，15-30分钟，水平离心； 2．可用膜滤器除菌，也可用加热高压灭菌； 3．离心时保持20度效果较为重要，温度过高或过低均影响分离效果； 4．可用于人外周血、骨髓等分离单个核细胞、E花环、EA细胞分离、肿瘤细胞分离、TIL等分离及死细胞去除等。 二．Percoll分层溶液 1．Percoll可以制备成不同密度使用液，形成不连接密度，用于分离各种不同密度的细胞；也可用转角离心机2000×g转角离心（28度）1小时，产生S形连续梯度，其不同部位的密度可用不同密度的色珠指示，用于分层分离不同密度的细胞； 2．可高压灭菌，但压力过高可形成胶状，长期储备的原液有时会析出结晶，不影响其使用； 3．常用于人单核细胞、NK细胞、B淋巴细胞、小鼠低密度细胞、枯否氏细胞等分离。 三．Metrizamide 1．可用PBS配制不同密度，用于各种细胞分离；但浓度过高易引起细胞聚集。 2．常用于树突状细胞。

何为细胞外泌体？　　外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小较为均一，直径为40~100纳米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程并且有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。　　然而，测量技术手段的局限限制了外泌体在这些领域的研究进展。所以，在这篇文章中，作者总结了外泌体的纯化方法（离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法以及色谱法），比较了现存各种外泌体测量技术（电子显微镜、动态光散射技术及纳米微粒追踪分析术）在外泌体尺寸和表征研究中的应用。原文点击——综述：细胞外泌体颗粒表征测量技术新进展

[b][url=http://www.f-lab.cn/solid-densimeters/1200wn.html]木材密度测试仪[/url]GP-1200WN[/b]采用固体密度测试技术专业测试木材木料密度,采用阿基米德原理的浮力法可选用沸水法,封蜡法和真空饱和法测量密度,准确、快速地显示测量结果。[b]木材密度测试仪GP-1200WN符合[/b]ASTM、GB/T1933、JIS、ISO标准,[b]木材密度测试仪GP-1200WN特点[/b]●煮沸法、真空饱和法可用于测试木材的基本密度，GP-1200WN可显示体积密度、湿密度、表观密度、表观孔隙、吸水率、开孔和闭孔体积、总孔隙。●对于木材的风干密度测试，可采用蜡封法直接显示木材的容重。●对于非吸收性木制品，GP-1200WN可以显示产品的密度和体积。●购买专业比重瓶，可显示木细胞体积密度。●本机具有水温和溶液补偿设定功能，采用蜡封法时可进行蜡脱密度设定。●机器可通过RS-232连接到PC或打印机。●采用大罐设计，减少了支撑钢丝浮力引起的误差。●水箱标准尺寸：150x100x90mm。●GP-1200WN水箱长度可根据客户需求定制。[img=木材密度测试仪]http://www.f-lab.cn/Upload/GP-1200WN.jpg[/img][b][url=http://www.f-lab.cn/solid-densimeters/1200wn.html]木材密度测试仪[/url]GP-1200WN规格参数[/b][table][tr][td][b]Model[/b][/td][td][b]GP-1200WN[/b][/td][/tr][tr][td][b]称重范围[/b][/td][td]0.01g-1200g[/td][/tr][tr][td][b]密度精度[/b][/td][td]0.001g/cm3[/td][/tr][tr][td][b]测量值[/b][/td][td]水温和溶液补偿设定，蜡封法时密度设定[/td][/tr][/table]

基本原理本分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。试剂与器材•外周血单个核细胞（参见实验1）•PBS1×和PBS10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA•胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）•HCl 1mol/l•Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）•4g/l台盼蓝染液（溶解在PBS液中）•50ml聚丙烯圆锥管•毛细吸管•移液管（1、2、10ml）•CO2孵箱•超净台•有旋转桶转子装置的离心机•PH计操作步骤所有的操作应该在无菌条件下进行一．不同密度Percoll分层液的配制1. Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+、 Mg2+）3. Percoll分层液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）二．不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。三．单核细胞的分离1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。 （图1）图略(暂时)图1. Percoll非连续性密度梯度离心分离法2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。（参见第一章第一篇第一节）结果本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。实验要点1. 为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。2. 所有操作过程应在18-20℃中进行。3. 仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。4. 洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。5. 如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

0即样品顺离心力方向沉降σ〈 S时 V〈 0即样品逆离心力方向上浮σ=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，"稳定"在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。二、 转头的选择：1、离心转头分类：转头类别 使用的离心机 发明时间、发明者或推广商固定角式转头 低、高、超速 1943年，（英）Pickels甩平转头 低、高、超速 1951年，（德）Kahler垂直管转头 高、超速 1974-1975年，（美）Dupont公司区带转头 低、高、超速 1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管转头 超速 1989年，（日）Hitachi Koki、（美）Beckman公司连续离心转头 低、高、超速 1965年，（英）MSE公司其他特种转头：分析转头，土壤脱水转头，细胞浮选转头，管式转头，血球比测定转头，细胞清洗转头等等。2、 各种转头用于密度梯度离心的比较：（I） 各种转头用于速率一区带（R-z）离心的优缺点分析：固定角式转头：壁部放应影响很大，用于R-z离心回、收率低，纯度也受影响一般知用于差分离心和等密度离心，离心时间向较短。是各其离心机的最高速转头。甩平转头：细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部入在很少。25000rpm~30000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而40000~42000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分离。离心时间较长。垂直管转头：沉降距离最短，因而离心分离时间也是短。最大半径前几乎没有壁部放位，最大本径后右一定壁部效位，垂直剖面积较大，因而离心后纯样品区带的容量也较大。但在有沉殿的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。大部份R-z离心没有沉殿，垂直管转头很适合做R-z离心。近垂直管转头：管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度（角式转头20度~45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩平转头都要短。由于右了倾角，沉殿可沿管壁滑向低部，因此基本上清除了沉殿与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。区带转头：没有壁部入应特别适合做大容量的病毒，亚细胞器，生物大分子的R-z离心，可用于研究，中试和少批量生产。分离纯度高，量大，但操作要求高，转头及整体价格昂贵。连续流离心转头：工作原理的区带转头相似，可连续工作，分离量大，分离统纯度高，可用于各种生物体的差分，R-z等密度离心。近年来高速连续流转头常用于大量发酵液（大肠样菌、酝母菌）菌体的沉殿。（II） 各种转头用于等密度离心内优缺点分析：固定角式转头：主要用于差分离心的角式转头，在速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为10~15ml,常用转速40000~60000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较少，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构层固此类转头最主转速一般在60000rpm以下）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头最高转速在40000~41000rpm，用作自形成CSCL梯度的质粒DNA离心往往需要50~70小时。垂直管转头：适合作等密度离心，沉降距离最短，在没有沉殿或沉殿非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。这类转头转进很高（目前最高转速可达100000rpm，70000xg）离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。近垂直转头：九十年代以后开始使用的新型转头，用作生物大分子（DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心最佳，目前这类转头的最高转速已达90000rpm近650000xg），离心时间相比垂直转头稍长。区带转头：非常适合做大容量样品的等密度离心。连续流离心转头：高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心超速连续流转头适合做大容量样品的等密度

市场上供应的大多数培养液的配方非常接近，这使得细胞很容易适应新的培养液。这里我将详细介绍一个方法，这个方法是保守的，在大多数情况下可以进行删减一些步骤。最简单最节省时间的情况是把细胞直接分装到新的培养液中，观察几代以保证细胞的生长参数是可以接受的。这个方法适于悬浮细胞，不过也很容易扩展到贴壁细胞。细胞的生长参数1. 翻倍时间（ Doubling Time ）细胞的翻倍时间在评价昆虫细胞健康程度的参数中是最容易测量的。翻倍时间应该在细胞处于对数期复制时测量，对于 Sf9 和 Sf21 细胞来说通常是介于 16-24 小时之间，不过大多数在 20-22 小时。dt=t × ln2/ln(Ct/Co) ，其中 dt 为翻倍时间， Co 为起始细胞数目， Ct 为经过时间 t 后的细胞数目， t 为 Co 和Ct 两次计数之间的间隔时间，所有的时间都以小时为单位。2. 细胞大小（ Cell Size ）细胞的大小是监测细胞健康程度的一个非常有用的参数。如果细胞是健康的，细胞的大小均一，都处于该细胞株体积正常变化范围的下限。细胞的大小在不同的细胞株变化是很大的。对于我用过的 Sf9 和 Sf21 ，典型的直径是 16-18 m m ，不过我知道有些细胞株小至 14 m m 或者大至 19 m m 仍然很健康。3. 滞后期（ Duration of Lag ）当细胞的密度较低时，会有一个滞后期，其长短取决于分装或者传代后细胞的密度。一般说来，该密度越低，滞后期越长。对于一个特定的细胞株来说，当这个密度高出一个阈值时，滞后期的长短与密度无关；而低于一个阈值时，滞后期无限长，细胞不再增殖。4. 低密度分装极限（ Low Density Split Tolerance ）能够在一个较短的滞后期（小于 12 小时）复苏的细胞形状较好。不过这是细胞株的特性，需要进行实验来确定你的细胞株的密度极限。我的细胞株有些在分装成密度为 5 × 104 细胞 /ml 时仍然可以很好复苏，有些细胞株分装成 5 × 105 细胞 /ml 就不能复苏了。5. 高密度极限（ High Density Maximum ）这是你的细胞能生长的最大密度，高于这个密度你的细胞将进入平台期。这个指标既和细胞株有关，又和使用的培养液有关。我建议先把你的细胞株培养至平台期，然后把一些分装到新鲜的培养液中以后，使剩下的继续生长至平台期，同时密切监测细胞状况。一般来说，细胞的培养要避免密度超过高密度极限的 80% 。对于我培养的细胞，这个极限值从 2 × 106 至 12 × 106 细胞 /ml 不等。实验步骤第一阶段：1. 准备合适体积的由 25% 体积新培养液和 75% 旧培养液（即细胞原先适应的培养液）组成的混合培养液 I。2. 将细胞以通常分装时使用的最低分装密度的两倍分装到混合培养液 I 中。3. 使细胞生长到通常培养时的较高密度，监测细胞生长参数。4. 继续以步骤 2 中的密度分装细胞到新鲜的混合培养液 I 中，直到生长参数达到可以接受的水平。有时候分装一次就可达到要求。5. 一旦细胞稳定下来，以通常使用的最低分装密度分装细胞至新鲜的混合培养液 I 中，同样监测细胞参数。6. 细胞达到较高密度后，继续以步骤 5 中的分装密度把细胞分装到新鲜的混合培养液 I 中，直到细胞的生长参数达到可以接受的水平。7. 如果细胞恢复到正常状态，进行第二阶段的实验。8. 如果细胞不能达到正常状态，新培养液可能不适于培养这种细胞。9. 如果细胞在新培养液中的生长参数达到平衡状态，虽然与正常状态不同，但是可以为实验接受，也可进行第二阶段的实验。第二阶段：1. 准备适量的由 50% 新培养液和 50% 旧培养液组成的混合培养液 II 。2. 将细胞以两倍最低分装密度分装至混合培养液 II 中。3. 如第一阶段一样，监测细胞生长指数，使细胞达到稳定状态。然后将分装密度降到最低分装密度，再使细胞达到稳定状态。第三阶段：步骤同第一阶段和第二阶段，使细胞适应混合培养液 III （ 75% 新培养液和 25% 旧培养液）。第四阶段：1. 步骤同第一阶段、第二阶段和第三阶段，使细胞适应新培养液。2 . 当细胞在新培养液中达到稳定后，监测细胞的生长指数，看是否波动过大。

生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。(一)细胞生长环境的优化策略要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。1．培养基组成的优化培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素b的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组a-淀粉酶的产量可提高2倍。培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。2．特殊营养物的添加在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产b-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。3．限制代谢副产物的积累培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组a-淀粉酶和b-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。(二)培养模式由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。1．大肠杆菌流加发酵策略大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。2．重组酵母的流加发酵酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。3．流加培养的控制一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

前几天在淘宝上买了密度计，收到之后放进硅酸乙酯28中测量，结果0.928，书上说的是0.934呢，于是把它放在水中验证下，没想到 在拍照保留证据的时候这个密度计慢慢的慢慢的从0.996浮岛0.999了。我要怎么和卖家说呢？原以为是时间的环境的问题，于是再次放进正硅酸乙酯浸泡了一小时，没动呢，和卖家反应了，卖家说卖了很多家都没人说不准。我还特意用了另外一家的密度计对比了下，人家的密度计放水中直接标在0.998的，在同等条件下，这个淘宝卖家的密度计就是不确定值。所以想请各位给解释下。淘宝退货很麻烦，能否改进下用用？

LASER是light amplification by stimulated emission ofradiation.的缩写。意为“受激发射的辐射光放大”。1964年按照我国著名科学家钱学森的建议将“光受激发射”改称“激光”。 本特利流式细胞仪中使用的氩离子激光器是一种固体激光器。这种激光器的特点是频率稳定性高，相干性好，寿命长。激光是这样产生的：当高压放电激发电子，电子吸收能量跃迁到高能级，然后在短时间内释放光子，回到基态。等离子管末端的光学系统来回反射光子。这些光子与其它受激电子相互作用，释放出更多与其波长、相位、方向相同的光子，随着光子数量的增加，光信号得到放大产生激光，并通过放电管尾部的布鲁斯特窗产生偏振，以最小损耗率传送。我们在等离子管周围加一磁场，对带电粒子起约束作用，以提高放电区中心的电子密度和离子密度，从而提高了输出功率。 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交，且相交于激光能量分布峰值处。 激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处。光路调节通过仪器光学部分三个旋钮调节，对用户是相对封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，不推荐用户作任何调节。

离心PBS液1 ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液取1 ul悬液+9 ul PBS细胞计数：1. 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.2. 用10 ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)的细胞数目。4. 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×106

1、搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。　　(1)供氧方式的改进　　一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐，整体呈梨形，搅拌置于培养罐底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。　　(2)搅拌桨的改进　　搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。　　2、非搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式培养罐产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。　　(1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小，适合细胞高密度生长。　　(2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。　　(3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。

由于传统的血球计数板已不能满足高速发展的细胞研究需要，市场上各种自动细胞计数的设备越来越多。常见的主要分为两 类：基于图像的细胞计数仪(Automated vision-based counter)和基于库尔特电阻抗原理的细胞计数仪。两者主要区别在于，前者扫描仪器视野内图像，依靠设定的上下限细胞大小来进行图像识别，而后者根据细胞通过小孔引起电位变化来计算细胞个数（关于库尔特原理，详见此处），两者原理不同，因此所获得的效果也大相径庭。以下对各类细胞计数仪的计数准确性、可重复性、快捷性做结果数据比较，建议读者根据您自身需要选购适合您使用的细胞计数仪。【准确性比较】http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201107/2011072416480295.jpg图1. 不同细胞浓度下各种细胞计数仪的计数结果与实际数值的对比上图可见：血球计数板在高细胞密度 时，计数结果与实际细胞密度有偏差，而基于图像的细胞计数仪则在多个浓度下均有较大偏差。这表明基于库尔特原理的细胞计数仪（Coulter counter和Scepter cytometer）在计数准确性上优于其他两种细胞仪。（样品为常见的COS7细胞）【可重复性比较】http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201107/2011072416514090.jpg 图3. 不同细胞浓度下细胞计数的可重复性比较上图可见：基于库尔特原理细胞计数仪的可重复性均明显好于血球计数板和基于图像的细胞计数仪。（样品为19种细胞系）【快捷性】http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201107/2011072416541552.jpg图5. 三种细胞计数法的计数时间对比上图可见：传统的血球计数板的计数时间远长于其他两种计数。库尔特原理计数法与基于图像的细胞计数法相比，计数速度更为稳定，而且计数时间约为后者的一半。（样品为常见的SF9，MCF7，HEK293细胞）

标准是这样的：取2克，加水100毫升加热回流2小时，用80度烘2小时，精密称定，质量为m，再置适宜的溶剂中，精密称定，质量为M，计算公式为密度=*d(适当溶剂的密度），我看半天都搞不明白。。。。。大家检药包材PET的密度是怎么测定的？

先要搞清细胞是如何混匀的，是滴管吹打还是振荡培养板，如果是后者，而且是转圈摇匀的话，很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分，导致细胞中间少，四周多。 当然，也有可能是培养板的质量问题或是铺板时细胞密度太低。对此可在培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出，种入细胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡，否则你的细胞就会聚积在一起。 还有些可行的处理方法：加入前吹打均匀 从多孔板侧边或底边缓慢加入。在进行原代培养时遇到该现象，可能有些人以为培养皿铺胶不均匀会导致这种现象，因为混匀的血管段加入到培养皿中时，在显微镜下血管段均匀分布在培养皿中，二十四小时后贴壁的血管段就是周边多，中间相对少些。

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

原标题 “纳米生物间谍”技术能进入活细胞取样 可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性 科技日报讯 据物理学家组织网近日报道，美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校（UCSC）研究人员开发出一种机器人式的“纳米生物间谍”系统，能从单个活细胞内提取出微量样本，进行RNA或DNA测序，而不会杀死细胞。研究人员表示，这种单细胞“纳米生物间谍”技术是一种了解活细胞内部动态过程的有力工具。相关论文发表在最近出版的美国化学协会《纳米》杂志上。 “我们能从活细胞中拿走一个‘生物间谍’，再把它送回该细胞，在几天内这样重复多次而不会杀死细胞。如果用其他技术，你不得不牺牲这个细胞才能分析它。”该生物传感与生物电技术小组负责人、UCSC巴斯金工程学院生物分子工程教授内德·波曼德说。 “纳米生物间谍”平台是研究小组用纳米吸液管开发的最新设备。纳米吸液管是一种小玻璃管，取液端越来越细，至尖端直径仅50到100纳米。波曼德说：“我能在实验室造出纳米吸液管，这不需要昂贵的纳米制造设备。但要进入一个细胞，问题是即使在高倍显微镜下，你也看不见吸液管尖端，不知道它偏离了细胞有多远。” 实验室博士后研究员亚当·赛格尔解决了这一问题。他基于在一台改造过的扫描离子电导显微镜（SICM），开发出一种反馈控制系统。该系统能利用通过纳米吸液管尖端的离子流作为反馈信号，在尖端接近细胞表面时探测其中的液滴。在尖端进入细胞之前，一种自动控制系统能定位它在细胞上面的位置，然后尖端很快插入穿透细胞膜，通过操控电压有控制地提取一小点细胞内物质。由于吸液管尖端极精细，对细胞造成的损害极微小。 研究小组用这种系统从活细胞中提取的微量细胞物质，估计只有50毫微微升（千万亿分之一升），约一个人体细胞百分之一的量。他们从单个人体癌细胞中提取物质并进行RNA测序，还从人类成纤维细胞中提取了线粒体并对其进行了DNA测序。“人们已经知道，线粒体和多种神经退化疾病有关。该技术可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性。”波曼德说。 该技术应用前景广阔。波曼德希望能与其他研究人员合作，探索其更多用途。“对于癌症生物学家、干细胞生物学家等想要了解细胞内部情况的科学家来说，这是一种多功能的平台。”（常丽君）来源：中国科技网-科技日报 2014年01月20日

大家还记得我吗？好久好久没有来发帖了，肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞，这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧，等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意：要想把细胞养的漂亮，一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持，方法很重要，更重要的是要有责任心。方法的话，可能每个人都会有自己的一套方法，不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室，现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗？我们实验室现在还在用，倒是真的蛮好用的，至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了（因为有领用记录）可能新朋友不知道，或者没有看过我上篇帖子的人不了解，如果相信我的推荐，可以看下我上一篇帖，谢谢，希望能帮到大家！差点忘了，那款软件更新成了iLab，不叫Mr.F了。其他不多说，省得被当成打广告的！

十八. 流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定 NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。 LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。 [

大家还记得我吗？好久好久没有来发帖了，肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞，这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧，等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意：要想把细胞养的漂亮，一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持，方法很重要，更重要的是要有责任心。方法的话，可能每个人都会有自己的一套方法，不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室，现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗？我们实验室现在还在用，倒是真的蛮好用的，至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了（因为有领用记录）可能新朋友不知道，或者没有看过我上篇帖子的人不了解，如果相信我的推荐，可以看下我上一篇帖，谢谢，希望能帮到大家！差点忘了，那款软件更新成了iLab，不叫Mr.F了。其他不多说，省得被当成打广告的！

如何提高仪器的精密度？先抱砖引玉，首先都使仪器处于最佳状态，试剂，水等肯定纯度要高，杂质很少，光谱干扰方面等要合理调节。。。。。。。。。。。。大家怎么看？

有望提供一种新的治疗癌症的方法2013年08月01日 来源： 科技日报 作者： 陈丹 科技日报讯（记者陈丹）据《自然》杂志网站8月1日（北京时间）报道，纳米钻石可用于量子计算机中处理量子信息，而哈佛大学的研究人员利用纳米钻石的量子效应，将其变为“温度计”，测量出了人类胚胎干细胞内部的温度变化，精确度是现有技术的10倍。通过加入金纳米粒子，研究人员还能够利用激光对细胞的特定部分加热甚至杀死细胞，这有望提供一种新的治疗癌症而不损害健康组织的方法，以及研究细胞行为的新手段。研究论文发表在本周的《自然》杂志上。 在这项最新研究中，研究人员使用纳米线将直径约100纳米的钻石晶体注入一个人类胚胎干细胞中，然后用绿色激光照射细胞，使氮杂质发出红色荧光。当细胞内局部温度出现变化时，红色荧光的强度会受到影响。通过测量荧光的强度，便可以计算出相应的纳米钻石的温度。由于钻石具有良好的导热性，就可以像温度计一样显示出其所处细胞内部环境的即时温度。 研究人员同时还将金纳米粒子注入细胞内，然后用激光来加热细胞的不同部位，加热点的选择和温度升高多少都可由纳米钻石“温度计”来精确控制。“现在我们有了一个可以在细胞水平上控制温度的工具，让我们能够研究生物系统对温度变化的反应。”参与该研究的哈佛大学物理学家彼得·毛瑞尔说。 他指出，基础生物学涉及到的很多生物过程，从基因表达到细胞新陈代谢，都会受到温度的强烈影响，纳米钻石“温度计”将是一个有用的工具。例如，通过控制线虫的局部温度，生物学家可以了解简单有机体的发育。“你可以加热单个细胞，研究其周围的细胞是否会减慢或者加快它们的繁殖率。”毛瑞尔说。 目前也有一些其他测量细胞温度的方法，比如利用荧光蛋白或碳纳米管，但这些测量手段在敏感性和准确度方面都有欠缺，因为其中的一些成分会和细胞内的物质发生反应。毛瑞尔说，他们的纳米钻石“温度计”的敏感度至少提高了10倍，能够检测出细微到0.05开的温度波动。而且其还有改进的余地，因为在活细胞外部，该“温度计”的敏感度已经达到0.0018开的温度波动。 总编辑圈点 这样的“温度计”应该造价不菲，好在钻石是纳米级的。而其能够检测出细微到0.05开的温度波动，让其他测量细胞温度的方法难以望其项背，我们有理由相信，这项技术不仅仅只应用于医学领域。目前晶体管已经达到极小量度，在20或30纳米级别，离原子级别已经不远。然后，最重要的事情就是要理解热量散播和设备电子结构之间的关系，只有掌握这方面的知识，才能真正操控原子级设备，而纳米钻石“温度计”或许能派上大用场。 《科技日报》（2013-08-02 一版）

发酵过程中，细胞浓度是一个非常重要的生理参数，不但可以计算比生长速率，底物消耗速率、生物量产率和维持系数等参数，还可以及时判断是否有染菌等异常情况发生。目前测量细胞浓度的方法主要有化学法（DNA/RNA分析）和物理法（干重、光密度、呼吸商等）两大类。一般来说，与物理法相比，化学法能较准确的测量有代谢活性的生物量，缺点是花费时间长，而利用物理法测量，无法区分区分处于悬浮状态的颗粒和微生物，也无法分别活死细胞。 实现在线活细胞浓度一直是发酵领域的热门话题，仅些年来出现了不少的测量方法，依据的工作原理也是五花八门，其中最具代表性的有声学，激光散色、荧光、核磁、量热或电容。 其中法国fogale公司的测量仪器，以电容法为工作原理，直接将传感器安装与发酵罐上，可承受121℃高温灭菌，理论技术也比较成熟，是目前最为理想的适合工业级别的在线活细胞传感器。工作原理：电容传感器采用活细胞的介电特性，实时连续测量活细胞的生物体积，可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对对电极位于传感器的顶部，一对用于在培养基中产生交变的电场，在电场范围内，带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象，发生极化的细胞可以认为是极小的电容，死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜，所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号，培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系，当频率增加时，培养基中细胞的介电常数由低频峰（最大极化）降低到高频峰（最小极化）。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式：培养基的基线在10MHz左右得到，细胞的信号在临界频率区域获得，在曲线的拐点，（动物细胞和细菌在1MHz，酵母在2MHz）我们获得了最佳的信号线性。应用：这项技术可广泛应用于各种细胞培养，生物发酵过程。已被文献证实可应用的细胞如下：动物细胞：CHO, BHK, MDCK, PERC6, NSO, HEK, Hela,Hybridoma, Vero细 菌：E.Coli, Bacillus Thuringensis, Salmonella,Streptomyces, Lactic Bacteria酵 母：Pichia Pastoris, Saccharomyces Cervisiae, PolymorphaHasenula昆虫细胞：sf9, Hi-5真 菌：Absidia