溶菌酶酶活检测

[align=center][font='宋体'][size=29px]溶菌酶[/size][/font][/align][size=24px]赵浩博[/size][size=12px]溶菌酶又称细胞壁质酶或[/size][size=12px] N- 乙酰胞壁质聚糖水解酶。1922 年英国细菌学家 A. Fleming 发现人的唾液、 眼泪中存[/size][size=12px]在有溶解细菌细胞壁的酶，[/size][size=12px] 因其具有溶菌作用， 故命名为溶[/size][size=12px]菌酶。[/size][size=12px] 此后在人和动物的多种组织、 分泌液， 及某些植物、[/size][size=12px]微生物中也发现了溶菌酶的存在。[/size][size=12px] 随着研究的不断深入， 发[/size][size=12px]现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶，[/size][size=12px] 还有作用于真菌细胞壁[/size][size=12px]的种类，[/size][size=12px] 同时对其作用机制也有了更进一步的了解。 近几[/size][size=12px]年，[/size][size=12px] 人们根据溶菌酶的溶菌特性， 将其应用于医疗、 食品、[/size][size=12px]畜牧及生物工程中。[/size][size=12px]溶菌酶来源不同，其分子大小不一样，其氨基酸排列顺序也有所不同，如：[/size][size=12px] T4 噬菌体溶菌酶由 164 个[/size][size=12px]氨基酸组成，分子量为[/size][size=12px] 19 ku；鸡蛋溶菌酶只有 129 个[/size][size=12px]氨基酸，其分子量约为[/size][size=12px] 14.3 ku；人溶菌酶由 130 个氨[/size][size=12px]基酸残基组成，分子量为[/size][size=12px] 14.6 ku；植物中分离出的溶[/size][size=12px]菌酶，其分子量较大，约为[/size][size=12px] 24 ku~29 ku。各种溶菌酶[/size][size=12px]的等电点在[/size][size=12px] 10.7~11.5 之间，化学性质十分稳定， pH 在1.2~11.3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，活性不[/size][size=12px]受影响，此外，溶菌酶对热也极为稳定，在[/size][size=12px] pH3.0 条件[/size][size=12px]下，沸水浴中加热[/size][size=12px] 60 min 其活力仍保持 90 %以上。[/size][size=12px]目前鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶并已投入商业化生产。它是由[/size][size=12px] 18 种 129 个氨基酸残基[/size][size=12px]构成的单一肽链，有[/size][size=12px] 4 个 S-S 键的氨基酸 Cys，等电点[/size][size=12px]约为[/size][size=12px] 11.1，最适溶菌温度为 45 ℃~50 ℃， pH 为 6.0~7.0。在酸性环境中，溶菌酶对热的稳定性很强， pH4~7[/size][size=12px]范围内，[/size][size=12px] 100 ℃处理 1 min 仍有近 100 的活力， 210 ℃加[/size][size=12px]热[/size][size=12px] 1.5 h 仍具有活性；在中性水溶液中，溶菌酶可维持[/size][size=12px]数天而不失去活性；在碱性条件下，其稳定性较差[/size][size=12px]。[/size][font='宋体'][size=14px]1. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的理化性质[/size][/font][size=12px]溶菌酶纯品呈白色、微黄或黄色的结晶体或无定形粉末，无异味，微甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。溶菌酶遇碱易被破坏，但在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，在[/size][size=12px]pH值为4-7时，100℃处理1min，仍能较好地保持活力:pH值为3时，能耐100℃加热处理45min。 [/size][size=12px]溶菌酶化学性质非常稳定，当[/size][size=12px]pH值在一定范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。溶菌酶不可逆变性的临界点是77℃，随溶剂的变化，不可逆变性临界点也发生变化，当溶菌酶所处溶液pH值小于1时，不可逆变性临界点降低到43℃。[/size][size=12px]溶菌酶最适[/size][size=12px]pH为5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；溶菌酶作为防腐剂安全性高，可被冷冻或干燥处理，且活力稳定。 [/size][size=12px]溶菌酶对几种变性剂的敏感程度为[/size][size=12px]:二恶烷二甲基乙酰胺二甲基甲酰胺丙酮，并且随溶剂用量的增加而直线下降。[/size][font='宋体'][size=14px]2. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的制备[/size][/font][size=12px]目前溶菌酶可以以鸡蛋清和蛋壳膜为材料提取制得，常用的方法有亲和层析法、离子交换树脂法、直接结晶法和聚丙烯酸沉淀法等。[/size][size=12px]亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶一底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物，如：几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、[/size][size=12px]N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶。[/size][size=12px]离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋一预处理一搅拌吸附一上柱洗脱一等电点沉淀一透析一喷雾干燥一成品。[/size][size=12px]溶菌酶在等电点以下较广泛的[/size][size=12px]pH值范围内，分子带正电荷，可吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，洗脱后盐析，可得溶菌酶沉淀，再进行精制可得成品。蛋清吸附724树脂，洗涤缓冲液洗脱，硫酸铵溶液盐析透析，用NaOH去碱性蛋白，冻干溶菌酶，冻干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10℃下，将新鲜蛋清540kg加入到已处理好的80kg 724树脂中，搅拌吸附6h，在0—5℃静置过夜。倾出上层蛋清，树脂离心甩干，用蒸馏水反复洗去黏附的卵蛋白，然后将树脂装入柱内，用0.15mol/L、pH=6.5磷酸缓冲溶液约150L洗涤树脂，再用约600L的10%硫酸铵溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液中加硫酸铵，使最终含硫酸铵量为40%，有白色沉淀生成，冷处放置过夜。虹吸上层清液，沉淀吸滤抽干，再用1倍蒸馏水溶解沉淀呈稀糊状，然后装入透析袋，在约5℃的条件下，对蒸馏水透析24h左右，中间换水2—3次。离心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液与离心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升到8.0—9.0，如有白色沉淀，即离心除去。然后用3mol/L盐酸调pH=5.0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。也可将离心液用3mol/L盐酸调pH=3.5，在搅拌下缓慢加入5%的固体氯化钠，在约5℃的温度下静置48h，离心，沉淀用0℃丙酮洗涤，干燥，即得溶菌酶。[/size][size=12px]在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸盐等盐类，并调[/size][size=12px]pH值至9.5—10.0，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然在溶液。在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产品，采用结晶纯化酶液经超滤处理后，用NaOH调整pH 9.5，离心去除。上清液在缓缓搅拌下，加NaCl至5%，静置一周，得粗结晶。结晶溶于pH 4.6醋酸水中，分去不溶物后，进行重结晶，结晶的最终得率为60%左右。即每公斤蛋清中可得重结晶品近1.3 g，活力测定为8000U/mg。 [/size][size=12px]聚丙烯酸沉淀法为将提取过滤后含酶洗脱液，首先经过吸附步骤，即将过滤后的澄清溶液用[/size][size=12px]20%的NaOH溶液调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15%聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行静析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离，将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L的碳酸钠，将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加入5%CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐[/size][size=12px]析，将所得澄清溶液加入[/size][size=12px]5%的NaCI溶液搅拌均匀。放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱中40℃条件下干燥称重。[/size][font='宋体'][size=14px]3. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的应用[/size][/font][font='宋体'][size=12px]本文主要从溶菌酶在食品添加剂中的应用展开进行论述。[/size][/font][size=12px]3[/size][size=12px].1 用于水产、肉类的防腐[/size][size=12px]将溶菌酶应用于水产品、肉类的保鲜防腐，目前已做了大量的研究。如早在[/size][size=12px] 2001 年前陈舜胜等就研[/size][size=12px]究了溶菌酶复合保鲜剂在冷藏（[/size][size=12px]5 ℃）与冰藏（0 ℃~1 ℃）[/size][size=12px]条件下对虾、带鱼段、扇贝柱和柔鱼的保鲜效果，结果表明，使用溶菌酶（[/size][size=12px]0.05 %）复合保鲜液浸泡后冷藏或[/size][size=12px]用溶菌酶（[/size][size=12px]0.05 %~0.08 %）复合保鲜液制备保鲜冰冰[/size][size=12px]藏，与常规保鲜方法相比，可将上述水产品的保鲜期延长约一倍的时间。[/size][size=12px]2012 年张观科又报道：采用溶[/size][size=12px]菌酶、[/size][size=12px]Nisin、甘氨酸、VC、山梨酸钾、NaCl 等不同的配比[/size][size=12px]的复合生物保鲜剂在不同温度对牡蛎进行保鲜贮藏研究。结果表明，采用[/size][size=12px] Nisin 和溶菌酶配合的生物保鲜[/size][size=12px]剂的保鲜效果最佳（在[/size][size=12px]-3 ℃微冻条件下，保藏 30 天后[/size][size=12px]感官性状仍然良好）[/size][size=12px] 。而钱曦利用海藻糖、蜂胶、茶多[/size][size=12px]酚、魔芋葡甘露聚糖、[/size][size=12px]Nisin、溶菌酶、壳聚糖和姜汁 8种[/size][size=12px]天然保鲜剂对鹿肉保鲜进行研究，结果表明：单独使用时，溶菌酶对鹿肉样品就有较明显的抑菌作用（最佳抑菌浓度为[/size][size=12px] 0.5 %）；而采用复合天然保鲜剂（茶多[/size][size=12px]酚、溶菌酶、海藻糖、[/size][size=12px]Nisin 复合）效果更好，可以有效的[/size][size=12px]提高鹿肉的货架期至[/size][size=12px] 36 d。从以上研究结果来看，溶菌[/size][size=12px]酶尤其是它在与其他保鲜剂按一定比例复合使用时，对水产及肉类能起到较好的防腐保鲜效果。[/size][size=12px]3[/size][size=12px].2 在低度酒类、饮料中的应用[/size][size=12px]日本已成功的使用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂用于清酒的防腐[/size][size=12px]。在国内，倪瑛和钟立人研[/size][size=12px]究了溶菌酶在葡萄酒生产中的应用。因为在葡萄酒生产中乳酸菌会将苹果酸转变为乳酸，但如果在酒精发[/size][size=12px]酵的前期就完成了这种反应，会对葡萄酒的感官产生不良影响，而控制乳酸菌生长的传统方法是使用[/size][size=12px] SO2，[/size][size=12px]但[/size][size=12px] SO2 的使用不仅对人体产生毒性，同样影响葡萄酒[/size][size=12px]的品质。因此，倪瑛等尝试将溶菌酶替代或补充[/size][size=12px] SO2 调[/size][size=12px]控乳酸菌的生长，结果显示，在葡萄原汁中加入[/size][size=12px] 0.1 %~0.15 %的溶菌酶，乳酸菌生长被抑制；在白葡萄酒中溶[/size][size=12px]菌酶剂量加至[/size][size=12px] 0.5 %时，可完全抑制苹果酸向乳酸的转[/size][size=12px]变。此外，将溶菌酶用于饮料防腐也有报道，如常凯等将溶菌酶（[/size][size=12px]0.05 %） 、甘氨酸和 NaCl 进行复配用于生[/size][size=12px]产脱脂山核桃乳，其抑菌效果较显著，降低了山核桃乳的杀菌强度，延长了产品货架期。从以上结果看，在葡萄酒的生产中溶菌酶可作为[/size][size=12px]SO2 天然的、安全的替代或补充品来抑制乳酸菌的生[/size][size=12px]长，在其他低度果酒中也可做类似的尝试；同样将溶菌酶用饮料的防腐也有较显著的效果。[/size][size=12px]3[/size][size=12px].3 在乳制品中的应用[/size][size=12px]由于溶菌酶对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用，同时可直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖[/size][size=12px]。因此，有大量有关溶菌酶应用于婴幼儿奶粉的[/size][size=12px]专题论述[/size][size=12px] 冯棋琴，等：溶菌酶在食品工业中的研究进展[/size][size=12px]35研究报道，如刘浩强等研究了鸡蛋溶菌酶对婴幼儿[/size][size=12px]配方奶粉的抑菌效果，结果表明，婴幼儿配方奶粉在喷雾干燥后添加[/size][size=12px] 10 mg/100 mL~50 mg/100 mL 的鸡蛋[/size][size=12px]溶菌酶效果最好。张明江[/size][size=12px]等关于婴幼儿配方奶粉中[/size][size=12px]溶菌酶的添加工艺的研究也得出了相似的结论，既奶粉喷雾干燥后添加[/size][size=12px] 500 mg/L 的溶菌酶抑菌效果最好。[/size][size=12px]3[/size][size=12px].4 在水果保鲜上的应用[/size][size=12px]水果经过溶菌酶处理，其表面的细菌被有效的抑制或杀灭，从而延长水果的保鲜期。胡晓亮等[/size][size=12px]采用溶[/size][size=12px]菌酶与溶菌酶复合保鲜剂对马陆葡萄进行涂膜保鲜，结果表明：溶菌酶单独使用有一定的保鲜效果，但将溶菌酶（[/size][size=12px]0.1 %）和海藻酸钠（1 %）复合使用对抑制马陆[/size][size=12px]葡萄的感官品质下降效果更为显著，在（[/size][size=12px]4±1） ℃条件下[/size][size=12px]贮藏[/size][size=12px] 25 d 后，仍保持果实的硬度和组织形态，质量损[/size][size=12px]失率仅为[/size][size=12px] 9.34 %。[/size][size=12px]溶菌酶本身作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对机体无毒性，也不会在体内残留，安全性很高，加之有效的防腐特性，溶菌酶已受到了食品行业的青睐。但目前实际应用的且已商品化的是鸡蛋清溶菌酶，它的抗菌谱较窄，只对[/size][size=12px] G+细菌起作用，底物特异性[/size][size=12px]强，且投入[/size][size=12px]/效率低，这限制了它们的广泛使用。为了扩[/size][size=12px]大溶菌酶使用领域及防腐效果，可以将鸡蛋清溶菌酶与其他天然保鲜剂（如海藻糖、茶多酚、[/size][size=12px]Nisin、溶菌酶、[/size][size=12px]壳聚糖等）配合使用。[/size][size=12px]此外，随着科学技术的发展，人们还可以采用一些高科技手段（如采用微生物发酵法生产溶菌酶，采用酶修饰法合成溶菌酶复合物如溶菌酶[/size][size=12px]-环糊精、溶菌酶-半乳甘露聚糖等）生产并改良溶[/size][size=12px]菌酶。经过改良的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能。当这些杀菌谱广、成本低、安全性高溶菌酶复合剂以及人工合成溶菌酶商品化时，溶菌酶的使用范围定会越来越广，将会在各行业发挥不可估量的作用。[/size][font='宋体'][size=14px]4. [/size][/font][font='宋体'][size=12px]溶菌酶的限量，检测与标准[/size][/font][size=12px]溶菌酶可水解细菌的细胞壁[/size][size=12px], 造成藤黄微球菌的溶解而引起溶液吸光度值的降低。[/size][size=12px]一个溶菌酶活力单位定义为[/size][size=12px]25 ℃ ,pH 6.2 条件下, 使用藤黄微球菌悬浊液在450 nm 处每分钟引[/size][size=12px]起吸光度变化为[/size][size=12px]0.001 所需溶菌酶的量。[/size][size=12px]试剂和材料[/size][size=12px]藤黄微球菌:ATCC4698 或 CICC10680。[/size][size=12px]0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液:pH 6.2。[/size][size=12px]称取[/size][size=12px]11.70 g 磷酸二氢钠(NaH[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]PO[/size][font='宋体'][size=12px]4[/size][/font][size=12px] 2H[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]O) 、7.86 g 磷酸氢二钠(Na[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]HPO[/size][font='宋体'][size=12px]4[/size][/font][size=12px]12H[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]O) 及0.372 g[/size][size=12px]乙二[/size][size=12px]胺四乙酸二钠 (EDTA-[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px]Na)于无菌水中并稀释定容至1000mL。调整缓溶液pH至6.2±0.1。[/size][size=12px]注[/size][size=12px]: 用小份缓冲溶液检查pH, 以避免缓冲溶液被污染。如果需要, 通过加入更多的磷酸二氢钠溶液或磷酸氢二钠[/size][size=12px]溶液调整[/size][size=12px]pH。[/size][size=12px]溶菌酶标准品: 蛋清溶菌酶。[/size][size=12px]底物溶液: 用磷酸盐缓冲液制备50 mL 藤黄微球菌悬浊液。 使用前, 底物于37 ℃ 培养30 min。[/size][size=12px]该底物溶液室温下可稳定[/size][size=12px]2 h。 以磷酸盐缓冲液调分光光度计零点, 然后测定底物溶液的吸光度,450 nm 下读数应为0.70±0.1。[/size][size=12px]仪器和设备[/size][size=12px]分光光度计: 精度±0.001。pH 计。[/size][size=12px]注[/size][size=12px]: 所用的器皿应保持无菌, 保证工作环境的清洁。[/size][size=12px]分析步骤[/size][size=12px]试样溶液的制备[/size][size=12px]准确称取[/size][size=12px]100 mg±0.1 mg 试样, 置于50 mL 容量瓶中, 用约25 mL 磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释[/size][size=12px]定容[/size][size=12px], 充分混匀。 再转移3 mL 上述试样制备溶液至100 mL 容量瓶中, 用磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀[/size][size=12px]释定容。[/size][size=12px]标准溶液的制备[/size][size=12px]精确称取[/size][size=12px]50 mg 蛋清溶菌酶标准品于50 mL 容量瓶中, 用约25 mL 磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释[/size][size=12px]定容[/size][size=12px], 充分混匀(如果需要, 冷冻该溶液以备后续测定)。转移3 mL 上述标准制备溶液至100 mL容量[/size][size=12px]瓶中[/size][size=12px], 用磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释定容。测定[/size][size=12px]取[/size][size=12px]3 份标准溶液和3 份试样溶液进行测定。[/size][size=12px]25 ℃ 室温下, 将1 cm 比色皿放入分光光度计, 用磷酸盐缓冲液调整吸光度零点。 吸2.9 mL 底物[/size][size=12px]溶液于比色皿[/size][size=12px], 最初450 nm 处吸光度应为0.70±0.10,3 min 之内初始吸光度值变化应小于或等于0.003 时, 方可开始测定。 吸取0.1 mL 标准溶液加入底物溶液, 充分混合。 记录3 min 吸光度值的变[/size][size=12px]化[/size][size=12px], 每15s 记录一次吸光度值。 每分钟吸光度值变化应在0.03~0.08, 若不在要求范围需调整试样溶液[/size][size=12px]的浓度。[/size][size=12px] 重复操作测定试样溶液。[/size][size=12px]反应[/size][size=12px]1 min 后稳定, 计算时忽略最初1 min 的读数。[/size][size=12px]结果计算[/size][size=12px]酶活力[/size][size=12px] X , 按式计算:[/size][align=center][size=12px]X =(A[/size][font='宋体'][size=12px]1[/size][/font][size=12px] -A[/size][font='宋体'][size=12px]2[/size][/font][size=12px])[/size][size=12px]/([/size][size=12px]2 × m ×0.001[/size][size=12px])[/size][/align][size=12px]式中[/size][size=12px]:[/size][size=12px]A1 ———[/size][size=12px]试样在[/size][size=12px]450 nm [/size][size=12px]处反应[/size][size=12px]1 min [/size][size=12px]时的吸光度[/size][size=12px] [/size][size=12px]A2 ———[/size][size=12px]试样在[/size][size=12px]450 nm [/size][size=12px]处反应[/size][size=12px]3 min [/size][size=12px]时的吸光度[/size][size=12px] [/size][size=12px]m ———用于分析的试样制备溶液中的溶菌酶质量, 单位为毫克(mg) [/size][size=12px]2 ———获得1 min 和3 min 吸光度读数所用的时间, 单位为分钟(min) [/size][size=12px]0.001———由单位溶菌酶每分钟引起的吸光度降低的值。[/size][size=12px]试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。[/size][size=12px] 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差[/size][size=12px]值不大于算术平均值的[/size][size=12px]10%。[/size][size=12px]最终对于溶菌酶的检测要求罗列如下：[/size][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081546089787_7027_1608728_3.png[/img][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081546090379_7253_1608728_3.png[/img][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081546091326_4621_1608728_3.png[/img][/align][size=12px]注：本标准适用于以鸡蛋清为原料[/size][size=12px], 经提取、精制等工艺制得的食品添加剂溶菌酶。[/size][size=12px]溶菌酶作为一种天然球状蛋白质，[/size][size=12px] 能促进营养物质被人[/size][size=12px]体消化吸收，[/size][size=12px] 对人体无毒性， 也不会在体内残留， 是一种安[/size][size=12px]全性很高的食品保鲜剂、[/size][size=12px] 营养保健品和药品。 由于每一类型[/size][size=12px]的溶菌酶都有其最适的作用条件，[/size][size=12px] 而且底物特异性强， 因[/size][size=12px]此，[/size][size=12px] 在应用溶菌酶时， 必需注意以下几个事项： ①充分掌握[/size][size=12px]溶菌酶的酶学特性，[/size][size=12px] 掌握食品中的营养成分、 pH 值、 食盐[/size][size=12px]浓度等影响溶菌酶效果的因素以及造成某种食品腐败的主要微生物群体，[/size][size=12px] 采用适当的添加量和添加方法才能收到应有的[/size][size=12px]防腐效果。[/size][size=12px] ②为了有效的发挥溶菌酶作用效力， 可以考虑与[/size][size=12px]其它物质配伍使用。[/size][size=12px] 如将溶菌酶与甘氨酸混合使用， 其防腐[/size][size=12px]效果则远远高于单独使用溶菌酶。[/size][size=12px] 因为甘氨酸含量达到一定[/size][size=12px]程度时，[/size][size=12px] 能抑制微生物细胞壁的合成， 这种作用对革兰氏阳[/size][size=12px]性菌和阴性菌均有效，[/size][size=12px] 从而增了溶菌酶效力的发挥。 也可[/size][size=12px]以考虑与植酸、[/size][size=12px] 聚合磷酸盐等配伍使用， 以增强溶菌酶革兰[/size][size=12px]氏阴性细菌的抑菌作用。[/size][size=12px] 不管与哪种物质配伍使用， 使用之[/size][size=12px]前都要进行小试。[/size][size=12px]参考文献：[/size][font='宋体'][size=14px][1] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]GB 1886.257-2016,食品安全国家标准 食品添加剂 溶菌酶[s].[/s][/size][/font][font='宋体'][size=14px][2] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]范林林[/size][/font][font='宋体'][size=12px], 林楠, 冯叙桥,等. 溶菌酶及其在食品工业中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(003):248-253.[/size][/font][font='宋体'][size=14px][3] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]冯棋琴[/size][/font][font='宋体'][size=12px], 周立梅, 高文功,等. 溶菌酶在食品工业中的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2015, 000(005):134-136[/size][/font][font='宋体'][size=14px][4] [/size][/font][font='宋体'][size=12px]张新宝[/size][/font][font='宋体'][size=12px], 陈红兵. 溶菌酶的性质及其在食品防腐中的应用[J]. 江西食品工业, 2008(4):42-45[/size][/font]

今天收到客户一个实验，检测奥美拉唑镁肠溶片，溶出度实验，样品中有一个杂质未分开，希望安排售前实验，进行色谱柱的筛选。以辛烷基硅烷键和硅胶为填充剂，流动相是0.01M磷酸氢二钠（磷酸调pH=7.6）-乙腈=75:25，波长302nm，要求奥美拉唑峰与杂质I分离度大于2.0.下面是客户做的结果，实验室色谱柱筛选工作正在进行中……http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/03/201603071349_586166_1987954_3.png

先和大家唠唠青霉素酶的主要来源：奶牛每到换季容易发作乳腺炎等疾病，往往通过注射抗生素进行治疗。凡经治疗过的乳牛，其牛奶在一定时期内残存着青霉素，而在原奶收购检测时，抗生素超标会拒收，奶户为了私利会人为添加青霉素分解酶。别小看这东东，个人认为危害大着呢：1.青霉素酶的安全性以及是否可以在食品中添加尚未有定论。2.在分解青霉素后，可能引进其他有害物质。3.这种做法纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。（这三条都个人主义的看法 仅供参考）一.杯碟法检测原理：采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。二.实验试剂与材料1 菌种：藤黄微球菌，对青霉素较敏感，有青霉素存在时藤黄微球菌不会生长繁殖（如图）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081621_492377_2227357_3.jpg2 试剂及药品1）磷酸盐缓冲液（配药)：取8g磷酸二氢钾和2g磷酸氢二钾，用1000ml溶解，121℃高压灭菌15min。2）舒巴坦标准储备溶液：将舒巴坦标准品用磷酸盐缓冲液溶解并定容为10mg/ml。4℃保存，可使用一周。3）舒巴坦标准工作溶液：吸取100ul舒巴坦标准储备溶液到1ml离心管中，用磷酸盐缓冲液定容，配置成浓度为1mg/ml。4）青霉素标准储备溶液：用磷酸盐缓冲液将青霉素溶解并定容为10mg/ml， 4℃棕色瓶中保存。使用时间根据实验情况而定。5）青霉素标准工作溶液：吸取10ul青霉素标准储备溶液于1ml离心管中，用磷酸盐缓冲液稀释，配置成浓度为0.1mg/ml ，4℃保存，可使用一周。6）生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中， 121 ℃高压灭菌15min。7）B-内酰胺酶标准储备溶液和工作溶液：方法要求16000U/ML（依据实际检验情况定浓度），目前用的是8千单位。如购买的青霉素酶的单位有IU/L,U/L,单位/ML,它们的换算关系是：1IU/L=609U/L=0.609单位/ML.8）无菌水：121℃高压灭菌15min。9）抗生素1号培养基，营养培养基。注：于配制药品的容器如不能高压灭菌，需用75%的酒精进行2-3次的消毒，再用所使用的无菌溶剂（生理盐水和磷酸盐缓冲液）进行2-3次的润洗后再进行药品的配制.3 主要实验器材http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081629_492378_2227357_3.jpg三.实验步骤1.试样处理：把离心管放入微孔中，标记为A、B、C、D，取试样1000ul分别放入A、B、C、D四个1.5ml离心管中，每个样品做三个平行，共12管。同时每次检验应取纯水1ml加入到1.5ml离心管中做对照。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释，如样品是酸性乳制品，应调节PH值至6-7后，按顺序加入以下药品后混匀。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081633_492379_2227357_3.jpgA: 5ul青霉素标准工作溶液。B: 25ul舒巴坦标准工作液+ 5ul青霉素标准工作溶液。 C: 25ul β-内酰胺酶标准工作液+ 5ul青霉素标准工作溶液 。D: 25ul β-内酰胺酶标准工作液+ 5ul青霉素标准工作溶液+25ul舒巴坦标准工作液。2.菌悬液的制备1）菌种的制备：将营养琼脂培养基分装到试管中做成斜面，用接种环挑取适量藤黄微球菌在斜面上划线，36 ℃培养22-24h。2）菌悬液的制备：用2ml生理盐水将经过斜面培养的藤黄微球菌洗下，混合均匀，然后将菌悬液以大约2%的比例加入到营养琼脂培养基中。3.检定用平板的制备1） 在无菌培养皿中注入抗生素1号培养基10ml，作为基层培养基，水平静置，待其自然凝固后将皿盖盖好备用.2）2.将灭菌的营养琼脂培养基溶化后在水浴锅中冷却至55℃左右，加入适量的菌悬液,混匀,移取5ml含有浓度为1*108CFU/ml注入铺有基层培养基的培养皿中，均匀摊开，凝固。加入菌悬液的量以能产生17-27mm的抑菌圈为宜。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081639_492380_2227357_3.jpg3）.凝固后将皿倒置，用笔在皿上画十字线，将皿平分四份，并标记样品的序列号，与原始记录对应。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081641_492381_2227357_3.jpg4）.然后再把皿反转，在每个培养基表面均匀对称放置4个牛津杯。检定平板应为同一批次。放置牛津杯时，必须均匀对称的放置，以免各自产生的抑菌圈有交叉现象。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081642_492382_2227357_3.jpg4. 试样测定 1）. 取ABCD四个离心管中的试液各200ul，分别加入到检定平板的四个牛津杯中，每组试验做3 -4个平行样。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081644_492383_2227357_3.jpg2）培养结束后去除牛津杯用游标卡尺精确测量ABCD四个试液的抑菌圈直径。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081646_492384_2227357_3.jpg四.结果判定取ABCD抑菌圈直径的平均值，纯水空白结果应为A、B、D、均产生抑菌圈；A的抑菌圈与B的抑菌圈相比，差异在3mm以内（含3mm),C的抑菌圈小于D的抑菌圈差异在3mm以上（含3mm),且重复性良好。如此结果则系统成立，可对结果进行如下判定。样品结果B和D均产生抑菌圈，且D-C抑菌圈在以上3mm(含3mm)时，可以判定样品中A和B的抑菌圈差异小于3mm ，且重复性良好的青霉素酶结果为阴性；样品中A和B的抑菌圈差异大于3mm (含3mm) ，且重复性良好的青霉素酶结果为阳性；纯水空白对照品系统成立的情况下，为判定样品结果的前提条件。如果A和B均不产生抑菌圈，

[align=center]几种酶的酶活力检测方法及结果分析[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]安评中心：王涛[/align]大蒜属百合科葱属植物蒜的鳞茎，其风味独特，营养丰富，用途十分广泛。在生产上，大蒜不能通过杂交制种，只能采用其鳞茎繁殖，由于长时间的营养繁殖造成植株体内病毒积累，使得蒜头变小，品种退化，产量降低，大大降低了大蒜的商品价值。大蒜在长期的生长过程中，由于受到病原菌的植物的附着与侵入，会产生自身的抗性机制，其中的保护性反应是复杂的新陈代谢的结果，其生理反应是通过酶催化活动来实现的。这些酶包括抗病性酶超氧岐化酶SOD，多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD等，以及感病性酶纤维素酶和果胶酶。本文主要描述了大蒜苗中的SOD，PPO，POD，纤维素酶和果胶酶的酶活力检测方法，并从酶活的角度分析，大蒜茎尖脱毒技术可以有效提高SOD，PPO，POD等与植物抗病性有关的酶的活性，而与植物感病性有关的酶的活性如纤维素酶和果胶酶的活性有所降低，其中脱毒苗中的SOD，PPO和POD的活性分别比未脱毒苗相应地高出93.37 U/g，19.48 U/gmin和382.55 U/gmin，纤维素酶和果胶酶的活性则分别低出18.29 U/gmin和38.08 U/gmin。这就从植物生理的角度上验证了脱毒大蒜苗抗病和高产的原因。[b]1实验药品及仪器1.1缓冲液的配置[/b]1.1.1磷酸缓冲液的配置首先分别配置母液A、B，再根据质量分数分别取对应的母液，调pH即可。母液A：0.2 mol/L Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]溶液：称量71.63 g Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]12H[sub]2[/sub]O，定容至1 L。母液B：0.2 mol/L NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]溶液：称量31.21 g NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]2H[sub]2[/sub]O，定容至1 L。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.8，内含1%PVP)：22.875 mL A +2.125 mL l B+1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，稀释至100 mL。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：3.075 mL A + 21.925 mL B，稀释至100 mL。0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：12.3 mL A + 87.7 mL B，稀释至200 mL。1.1.2醋酸缓冲液的配置同磷酸缓冲液一样，先配置母液。母液A：0.2 mol/L HAc溶液：吸取11.5 mL 醋酸溶液，定容至1 L。母液B：0.2 mol/L NaAc溶液：称量27.2 g 三水合乙酸钠，定容至1 L。0.2 mol/L (pH4.6) 醋酸缓冲液：51 mL A + 49 mL B混合均匀即可。0.2 mol/L（pH4.8）醋酸缓冲液：40 mL A + 60 mL B混合均匀即可。1.1.3其他试剂的配置100 umol/L EDTA-Na[sub]2[/sub]溶液：称取0.03721 g EDTA-Na[sub]2[/sub]，用磷酸缓冲液定容至1 L。20 umol/L核黄素：称取0.00753 g核黄素定容至1 L。130 mmol/L甲硫氨酸（Met）：称取1.9399 gMet，用磷酸缓冲液定容至100mL。750 umol/L氮蓝四唑（NBT）：称取0.06133 g NBT，用磷酸缓冲液定容至100 mL。0.1 mol/L邻苯二酚：称取1.1011 g邻苯二酚定容至100 mL。20%三氯乙酸（TCA）：称取20 g TCA定容至100 mL。二氧甲基酚即愈创木酚30%H[sub]2[/sub]O[sub]2 [/sub]3,5-二硝基水杨酸显色剂（DNS显色剂）：称取2.5 g DNS溶于水中，加入2.5 g氢氧化钠、50 g酒石酸钾钠和100 mL水，加热溶解后再加入0.5 g苯酚和0.125 g无水亚硫酸钠，待全部溶解后冷却，定容至500 mL，贮于棕色瓶中，放置一周后使用，用之前过滤[sup][/sup]。葡萄糖标准液：称取0.54 g葡萄糖定容至500 mL。纤维素底物（CMC）：称取0.625 g羧甲基纤维素钠溶于0.2 mol/L (pH 4.6) 醋酸缓冲液中，定容至100 mL。果胶底物：称取0.5 g果胶溶于0.2 mol/L (pH 4.8) 醋酸缓冲液中，定容至100 mL，放置冰箱内冷藏。D-半乳糖醛酸标准液：称取0.1 g D-半乳糖醛酸溶于0.2 mol/L (pH 4.8) 醋酸缓冲液中，定容至100 mL。[b]1.2主要实验仪器[/b]紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司可见光分光光度计 上海第三分析仪器厂TCL-16C型台式离心机 上海安亭科学仪器厂超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器材厂灭菌器 上海申安医疗器械厂海尔冰箱 青岛海尔集团电子分析天平 北京赛多莉斯天平有限公司数显pH计；恒温光照培养箱；制冰机；计时器；[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]；试剂瓶；容量瓶。[b]2实验方法2.1材料[/b]大蒜脱毒试管苗：采用大蒜茎尖组织脱毒技术，经过3次继代培养所获得的生长健壮脱毒苗。大蒜苗植株：将市售山东金乡大蒜，分瓣去皮后，栽种于花盆中，日光照射，生长两个月之后所得植株。[b]2.2方法[/b]共测两组植株（第一组为大蒜脱毒苗，第二组为大蒜苗植株即未脱毒苗）的五种酶的酶活，这五种酶分别是超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、纤维素酶和果胶酶，最后将两组酶活数据分别做对应比较。同一植株做三次平行实验，取平均值。[b]3酶活测定3.1超氧物歧化酶（SOD）活力的测定[/b]本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，这种自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙。后者在560 nm处有最大吸收，而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。3.1.1粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入1 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8,内含1%PVP)在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心10 min，取上清液，冷藏待用。3.1.2显色反应取7只5 mL透明度好的试管，用记号笔编号，1为空白管，2~4为测定管，5~7为对照管。各管按照表3-1依次添加试剂溶液，混匀后，将空白管置于暗处，其它各管置于4000 lx日光灯下反应20 min。[align=center]表1 测定SOD活性试剂添加量[/align][align=center]Table 1 The add content of reagent to SOD[/align][table][tr][td][align=center]试剂[/align][/td][td][align=center]用量/ mL[/align][/td][td][align=center]备注[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.05 mol/L磷酸缓冲液[/align][/td][td][align=center]1.5[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]130 mmol/L Met[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]750 umol/L NBT[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td=1,2][align=center]总体积为3.0 ml，对照管与空白管加入缓冲液代替酶液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]100 umol/L EDTA-Na[sub]2[/sub][/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]20 umol/L 核黄素[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]酶液[/align][/td][td][align=center]0.05[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]蒸馏水[/align][/td][td][align=center]0.25[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][/table]3.1.3活力测定与计算以暗处管为空白，分别测定其它各管在560 nm波长下的吸光度（OD）。以抑制NBT光化还原的50%作为一个酶活性单位（U）表示。按下式计算SOD的总活性：SOD总活性（U/g）=（A[sub]o[/sub]-A[sub]s[/sub]）*V[sub]t[/sub]/ A[sub]o[/sub]*0.5*W*V[sub]1 [/sub]（公式3-1）式中：SOD总活性以每克鲜质量的酶单位表示（U/g）；A[sub]o[/sub]-照光对照管的吸光度；A[sub]s[/sub]-样品管的吸光度；V[sub]t[/sub]-样品液总体积（mL）；V[sub]1[/sub]-测定时样品液用量（mL）；W-样品鲜质量（g）。[b]3.2多酚氧化酶（PPO）活力的测定[/b]多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌，其活性可以用比色法测量产物的形成，邻苯二酚是其常用的底物。3.2.1粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心15 min，取上清液，冷藏待用。3.2.2活力测定与计算取2支试管，一支为空白对照管，对照管中加入1 mL酶液+3 mL 0.05 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液；另一支为测定管，测定管中加入1 mL酶液+1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚+2 mL 0.05 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液。然后在37 ℃水浴保温10 min，立即冰浴，冷却下来之后，各管加入2 mL 20% TCA终止反应。立即在410 nm波长下测定吸光度，每min测一次，共测3 min。以每min内吸光度变化0.01为酶活性单位（U）。PPO活性（U/gmin）=ΔA*V[sub]0[/sub]/0.01W*V[sub]1[/sub]*t [sub] [/sub]（公式3-2）式中：ΔA = A[sub]s[/sub]-A[sub]o[/sub]；A[sub]o[/sub]-对照管的吸光度；A[sub]s[/sub]-测定管的吸光度；V[sub]0[/sub]-酶液提取总量（mL）；V[sub]1[/sub]-测定时酶液用量（mL）；W-样品鲜重（g）；t-反应时间（min）。[b]3.3过氧化物酶（POD）活力的测定[/b]选用愈创木酚法，即在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。3.3.1反应混合液的制备量取50 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH6.0），加入28 uL二氧甲基酚，加热搅拌至溶解，冷却后再加入19 uL 30% H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]，混合均匀保存于冰箱中。3.3.2粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心15 min，取上清液，冷藏待用。3.3.3活力测定与计算取2只比色杯，一只加入2 mL反应混合液和1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，作为校零对照；另一只加入2 mL反应混合液和1 mL酶液，立即开启秒表计时器，在470 nm波长下测定吸光度，每隔1 min读数一次。以每min吸光度变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。POD活性=△A*Vt /0.01W* V[sub]1[/sub]*t （公式3-3）式中：△A-反应时间内吸光度的变化量；V[sub]t[/sub]-酶液总体积（mL）；V[sub]1[/sub]-测定时酶液用量（mL）；W-样品鲜重（g）；t-反应时间（min）。[b]3.4纤维素酶活力的测定[/b]选用DNS法测定纤维素酶活力。DNS法测定的是纤维素酶对羧甲基纤维素钠（CMC）的糖化能力，其水解产物如纤维二糖和葡萄糖是还原糖，可以将DNS还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的量与该物质溶液颜色的深浅成比例，因此可以用分光光度计进行测定，该方法可表示纤维素酶的总活力。3.4.1绘制葡萄糖标准曲线取5支试管，用记号笔编号后，按表3-2量取试剂，每管分别加入1 mL 2 mol/L氢氧化钠和2 mL DNS显色液，摇匀后置于沸水浴中加热5 min，流水冷却，用蒸馏水定容至10 mL，静置20 min后以1号管为对照于490 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。[align=center]表2葡萄糖标准曲线制作表[/align][align=center]Table 2 Standard curve of Glucose[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td]标准葡萄糖溶液（mL）[/td][td]0.2 mol.L[sup]-1[/sup]，pH4.6醋酸钠缓冲溶液（mL）[/td][td][align=center]试管中葡萄糖量（umol）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]5.0[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]4.6[/align][/td][td][align=center]2.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]4.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]4.2[/align][/td][td][align=center]4.8[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][td][align=center]4.0[/align][/td][td][align=center]6.0[/align][/td][/tr][/table]3.4.2粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入2 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.6)，在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心15 min，取上清液，装入离心管中再离心10 min，定容至10 mL，冷藏待用。3.4.3活力测定与计算取3支试管，一支作为空白对照，另2支作为平行样品。样品管中加入50℃预热的酶液1 mL，底物溶液（CMC）4 mL；空白对照管加4 mL底物溶液（CMC）。3支试管放入50℃水浴中，5 min后取出，立即加入1 mL 2mol/L NaOH溶液和2 mL DNS显色剂。摇匀后，空白对照管中加入1 mL酶液，立即将3支试管放入沸水浴中，反应5 min后取出，流水冷却，定容至10 mL，在490 nm波长处测吸光度。用测得的OD值在标准曲线上差得相应的葡萄糖的量，代入下面公式计算活力。以每min催化纤维素水解成1 umol葡萄糖的酶量表示酶活大小（U）。纤维素酶活性（U/gmin）=葡萄糖量/5*E* W （公式3-4）式中：5为反应时间（min）；Ew为1 mL酶液中含有的酶量（g）；W-样品鲜重（g）。[b]3.5果胶酶活力的测定[/b]选用DNS法测定果胶酶活力。该方法是利用果胶酶在一定温度，时间和条件下水解果胶，释放出还原性D-半乳糖醛酸，与3,5-二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物，即发生显色反应。在一定范围内，水解生成D-半乳糖醛酸的量与吸光度成正比，与果胶酶活力成正比，通过分光光度计测定吸光度，可以计算出果胶酶的活力。3.5.1绘制D-半乳糖醛酸标准曲线取6支试管，编号后依次按照表3-3加入试剂，摇匀后置于沸水浴中反应5 min后，冷却，用蒸馏水定容至10 mL，静置20 min后以1号管为对照于540 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。[align=center]表3[b] [/b]D-半乳糖醛酸标准曲线的绘制[/align][align=center]Table 3 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td]D-半乳糖醛酸标准液（mL）[/td][td]0.2 mol.L[sup]-1[/sup]，pH4.8醋酸缓冲液（mL）[/td][td][align=center]DNS显色液（mL）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]4.0[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]0.2[/align][/td][td][align=center]3.8[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]3.4[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]3.2[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][td][align=center]3.0[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][/table]3.5.2粗酶液的提取与提取纤维素酶的方法相同。3.5.3活力测定与计算取5支试管，用记号笔编号。1、2号管为样品管，分别加入1 mL果胶底物，在48℃水浴中预热5 min，再分别加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.8)，之后，1号管中加入1 mL酶液，立即摇匀，在48℃水浴中反应30 min；2号管中加入1 mL酶液，立即放入沸水浴中反应5 min，冷却。分别取1、2管中容液各2 mL于3、4管中，并加2 mL水，2.5 mL DNS显色剂，混匀，沸水浴反应5 min，流水冷却。5号管加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.8)，2.5 mL DNS显色剂，静置20 min后以5号管为对照校零，在540 nm波长处测3、4管的吸光度；用测得的（OD[sub]3[/sub]-OD[sub]4[/sub]）值在标准曲线上查得相应的D-半乳糖醛酸的量，代入下面公式计算活力。以每min酶作用生成的D-半乳糖醛酸的量为一个酶活单位（U）。果胶酶活性（U/ gmin）=Y*3*N/t* W [sub] [/sub]（公式3-5）式中：Y-酶作用生成的D-半乳糖醛酸的量；3-测酶活取了反应液的1/3；N-样品稀释倍数；W-样品鲜重（g）；t-反应时间（min）[b]4标准曲线的绘制4.1葡萄糖标准曲线[/b]依照3.4.1步骤，最后测得各个试管中的吸光度依次为0，0.432，0.672，0.865，1.073。按照表4，以葡萄糖浓度为横坐标，490 nm处的OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（如图1）。[align=center]表4葡萄糖标准曲线[/align][align=center]Table 4 Standard curve of Glucose[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]葡萄糖浓度umol[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]2.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][td][align=center]4.8[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]490 nm OD[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.432[/align][/td][td][align=center]0.672[/align][/td][td][align=center]0.865[/align][/td][td][align=center]1.073[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,580,219]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010439441511_1108_2904018_3.png!w580x219.jpg[/img] [/align][align=center]图1葡萄糖标准曲线[/align][align=center]Figure 1 Standard curve of Glucose[/align][b]4.2 D-半乳糖醛酸标准曲线[/b]依照3.5.1步骤，最后测得各个试管中的吸光度依次为0，0.211，0.384，0.561，0.743，0.965。按照表5，以D-半乳糖醛酸的量为横坐标，540 nm处的OD值为纵坐标，绘制D-半乳糖醛酸标准曲线（如图2）。[align=center]表5 D-半乳糖醛酸标准曲线[/align][align=center]Table 5 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]D-半乳糖醛酸的量mL[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.2[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]540 nm OD[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.211[/align][/td][td][align=center]0.384[/align][/td][td][align=center]0.561[/align][/td][td][align=center]0.743[/align][/td][td][align=center]0.965[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,579,188]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010440011153_826_2904018_3.png!w579x188.jpg[/img] [/align][align=center]图2 D-半乳糖醛酸标准曲线[/align][align=center]Figure 2 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][b]5结果与分析[/b]将所测得的OD值，根据各个公式计算出SOD，PPO，POD，纤维素酶和果胶酶的酶活力，结果如表6所示。再将大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果做成柱状图进行比较，如图3所示。可以看出，脱毒试管苗中的SOD，PPO，POD的活性均高于未脱毒试管苗的对应酶的活性，而这三种酶都与植物的抗病性有关，说明在抗病性上脱毒试管苗强于未脱毒试管苗；纤维素酶和果胶酶的活性则是未脱毒苗比脱毒试管苗高。此外，作为植物抗氧化系统第一道防线的SOD，其活性大小在脱毒试管苗与未脱毒苗中相差93.37 U/g，前者比后者高出约1.5倍，说明经脱毒的试管苗抵御活性氧侵害的能力更高。PPO能催化木质素及其他酚类氧化物的形成，从而构成保护性屏蔽，抵抗抗病菌的入侵，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。脱毒试管苗的PPO活性比未脱毒苗的PPO活性高出19.48 U/gmin，约2.45倍。说明脱毒苗在抵抗抗病菌的入侵方面，能力更强。在植物对病原菌侵染的防卫反应中，POD和SOD都有着极其重要的作用，SOD能有效的清除机体内的超氧自由基，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢，而POD可以将过氧化氢分解为完全无害的水，在脱毒试管苗与未脱毒苗中POD的活性均比较大，两者相差382.55 U/gmin，约1.7倍，说明经脱毒的试管苗可以更有效的抵御过氧化氢的毒害。而纤维素酶和果胶酶均与植物的感病性有关，其活性则是未脱毒苗比脱毒试管苗高，分别高出18.29 U/gmin和38.08 U/gmin，约2.4倍和1.2倍，说明脱毒苗的感病几率有所降低。POD不仅可以将过氧化氢分解为完全无害的水，而且还具有多种生理功能，如从叶绿体和细胞质中去除过氧化氢、氧化有毒化合物、合成细胞壁、对各种胁迫的应急、吲哚-3-乙酸的调控、乙烯的生物合成等，还参与了植物酚类的聚合和氧化以及木质素和植保素的合成。因此POD是植物体中活性较高的一种酶，从图3中也可以看出，POD的活性在五种酶中最高。[align=center]表6 大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果[/align][align=center]Table 6 Enzyme activity assay results between virus-free garlic in vitro and not virus-free plantlets[/align][table][tr][td][align=center]酶总活性[/align][/td][td][align=center]SOD[/align][align=center](U/g)[/align][/td][td][align=center]PPO[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]POD[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]纤维素酶[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]果胶酶[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]脱毒苗[/align][/td][td][align=center]157.46[/align][/td][td][align=center]27.43[/align][/td][td][align=center]610.95[/align][/td][td][align=center]7.77[/align][/td][td][align=center]31.97[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]未脱毒苗[/align][/td][td][align=center]64.09[/align][/td][td][align=center]7.95[/align][/td][td][align=center]228.40[/align][/td][td][align=center]26.06[/align][/td][td][align=center]70.05[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,564,289]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010440223303_2970_2904018_3.png!w564x289.jpg[/img] [/align][align=center]图3大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果比较[/align][align=center]Table 3 Comparison of enzyme activity assay results between virus-free garlic in vitro and not virus-free plantlets[/align]

β-内酰胺酶各检测方法优缺点比较[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/08/200908111906_165045_1641058_3.jpg[/img]目前已有的检测β-内酰胺酶方法大体可以分为两类：一类是测定底物分解产物的方法，如碘量法、pH 测定法、产色头孢菌素法；另一类是测定未分解底物的方法，如UV法、羟肟酸测定法、生物测定法等。但是上述检测方法都存在一定的缺陷。测定底物分解产物的方法目前来说还不能做到定量化，而通过未分解底物的方法又存在时间长、成本高的缺陷。

[b]问题：[b][b][b][/b][/b]艾司奥美拉唑镁肠溶片的检测，流动相是？[/b]答案：流动相： A：水-磷酸盐缓冲溶液-乙腈（80:10:10） B：乙腈-磷酸盐缓冲溶液-水（80:1:19）=======================================================================【活动内容】1、每个工作日上午10：00左右发布一个关于应用数据库的应用问答题，版友根据题目给出自己理解的答案。2、每个工作日下午15：10公布参考答案。【活动奖励】幸运奖：抽奖软件，当天随机抽取3个或5个回答正确的版友ID号（最后一个ID号，截止至下午15：00），每人奖励[color=#ff0000]2钻石币[/color]（抽奖人数≤10，抽取3个版友；抽奖人数＞10，抽取5个版友）；中奖名单：lijing320323(注册ID：lijing320323）999youran（注册ID：999youran）dahua1981（注册ID：dahua1981）PAEs（注册ID：v2911392）吕梁山（注册ID：shih20j07）[img=,690,388]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/09/201809041504163298_6848_1610895_3.png!w690x388.jpg[/img][img=,690,388]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/09/201809041504189792_3148_1610895_3.png!w690x388.jpg[/img]积分奖励：所有回答正确的版友奖励[color=#ff0000]10个积分[/color]（幸运奖获得者除外）。【注意事项】同样的答案，每人只能发一次[/b][align=left][color=#ff0000][b]PS：该贴浏览权限为“回贴仅作者和自己可见”，回复的版友仅能看到版主的题目及自己的回答内容，无法看到其他版友的回复内容。[/b][/color][/align][align=left][color=#ff0000][b] 下午3点之后解除，即可看到正确答案、获奖情况及所有版友的回复内容。[/b][/color][/align][align=center]=======================================================================[/align]方法：HPLC基质：药品应用编号：103783化合物：艾司奥美拉唑色谱柱：[url=http://www.dikma.com.cn/product/details-855.html]Platisil ODS 5μm 250 x 4.6mm[/url]样品前处理：有关物质供试品：精密称取20mg样品置于100mL容量瓶中，加10mL甲醇，振摇，加20mL磷酸盐缓冲溶液（每1000mL水中加入磷酸钠0.0137mol和磷酸氢二钠0.0551mol），超声使其溶解，用水稀释到100mL，混匀，过滤，取续滤液。色谱条件：色谱柱： Platisil ODS 250*4.6 mm，5 μm(Cat#：99503)流动相： A：水-磷酸盐缓冲溶液-乙腈（80:10:10） B：乙腈-磷酸盐缓冲溶液-水（80:1:19）磷酸盐缓冲溶液：1000mL水+磷酸二氢钠0.0052mol+磷酸氢二钠0.0315mol流速： 1.0 mL/min柱温： 30 ℃检测器： 302nm进样量： 20uL文章出处：天津应用实验室关键字：艾司奥美拉唑镁肠溶片、Platisil ODS、99503、HPLC摘要：Platisil ODS检测艾司奥美拉唑镁肠溶片。图谱：[img]http://www.dikma.com.cn/u/image/2017/01/05/1483598227111770.jpg[/img][img]http://www.dikma.com.cn/u/image/2017/01/05/1483598227527569.jpg[/img][img]http://www.dikma.com.cn/u/image/2017/01/05/1483598227109068.jpg[/img]