淋巴细胞免疫分析

p 　　2017年7月31日，清华大学生命学院刘万里研究组在《eLife》期刊在线发表了名为《蛋白激酶Cβ(PKCβ)和黏着斑激酶协同调控B淋巴细胞的免疫活化对呈递抗原的基质硬度的敏感性》(Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKCβ and focal adhesion kinase)的研究论文，报道了机械力感知能力调控B淋巴细胞免疫活化的精细分子机制。清华大学生命学院巴基斯坦籍博士生萨明娜(Samina Shaheen)，北京大学、清华大学和北京生命科学研究所联合培养博士研究生项目博士生万政鹏和生命科学学院本科生李宗昱是本文的共同第一作者，刘万里研究员为本文的通讯作者。 br/ /p p 　　本研究需要大力整合分子免疫学、细胞生物学、生物化学、新型材料科学、高精度活细胞成像和生物物理学等不同学科的交叉优势，涉及基因修饰小鼠脾脏B细胞和自身免疫疾病病人外周血B细胞等实验材料的广泛使用，在研究过程中得到了国内外同行的大力支持。 /p p 　　B淋巴细胞作为抗体免疫应答过程中的重要参与者，维系着人类的健康，B淋巴细胞的免疫活化进程在其质膜表面的B细胞受体(BCR)识别外来病原体抗原后启动。该课题组之前的工作揭示B淋巴细胞具有灵敏的机械力感知功能，利用B细胞受体(BCR)来精确地识别抗原的理化性状。该论文结合不同刚性抗原呈递基质系统和基于全内反射、共聚焦荧光显微镜的高速高分辨率成像系统，对机械力感知调控B淋巴细胞免疫活化的分子机制进行系统而全面的研究。该论文发现B淋巴细胞感受机械力调控其活化依赖于B细胞受体(BCR)下游信号分子。由佛波酯(PMA)诱导的蛋白激酶Cβ(PKCβ)激活可以绕过B细胞通常需要的酪氨酸激酶(Btk)和磷脂酶Cγ2(PLCγ2)信号分子来区分底物刚度。然而，这一过程依赖于由蛋白激酶Cβ(PKCβ)介导的黏着斑激酶(FAK)激活，进而表现出黏着斑激酶(FAK)介导的B细胞扩散和粘附反应的增强。黏着斑激酶(FAK)失活或缺陷将导致B细胞丧失鉴别基底刚性的能力，而粘附分子可以大大增强B细胞的这种能力。最后，该研究利用类风湿性关节炎患者的样品进行研究，发现与健康人相比，类风湿性关节炎患者的B细胞对基底刚度表现出不同的活化反应。这些发现更系统的提供了B细胞如何通过蛋白激酶Cβ(PKCβ)介导黏着斑激酶(FAK)激活的方式区分底物刚度并作出不同活化反应的分子解释。这些研究成果为B淋巴细胞的免疫识别、免疫活化和免疫调节研究提供了新的研究思路，帮助人们进一步理解自身免疫疾病，从而对探索相关疾病的致病机理、以及药物疫苗研发等重要工作提供新的理论依据。 /p p 　　刘万里研究员课题组一直致力于使用新型的高速高分辨率的活细胞单分子荧光成像技术结合传统的分子免疫学、生物化学和生物物理学研究手段，对B淋巴细胞的免疫活化及相关疾病的分子机制进行研究。继2013年在《免疫学杂志》(Journal of Immunology)，2015年在《欧洲免疫学杂志》(European Journal of Immunology)和《eLife》上发表B淋巴细胞的免疫活化受到机械力调控的相关论文后，这一新成果是他对该领域的又一贡献。该研究由国家自然科学基金委、科技部和青年千人计划提供经费支持。萨明娜(Samina Shaheen)受到中国政府奖学金项目的支持。(来源：清华大学生命科学学院) /p p 　　论文链接： a href=" https://elifesciences.org/articles/23060" _src=" https://elifesciences.org/articles/23060" https://elifesciences.org/articles/23060 /a /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/noimg/e71fa001-dac6-4706-bca7-5f946b9f1f18.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　蛋白激酶Cβ(PKCβ)和黏着斑激酶(FAK)协同调控B淋巴细胞的免疫活化对呈递抗原基质硬度的敏感性 /p p br/ /p

受访专家： 　　欧阳学农，南京军区福州总医院肿瘤科主任、主任医师，国家中西医结合肿瘤重点学科主任、国家药物临床试验机构(肿瘤专业)主任、全军中医药学会副会长、全军肿瘤专业委员会常委，《临床肿瘤学杂志 》编委、《肿瘤学杂志 》编委，从事肿瘤临床工作近30年。 　　牵头或参与国际和国内药物临床试验项目20项，与美国 M.d. Anderson 癌症研究中心、加拿大UBC 大学、日本爱知癌症中心、中国医科院肿瘤医院、军事医学科学院等国内外著名肿瘤研究机构保持广泛合作。 　　“40%—50%的淋巴癌患者病因是病毒感染，但现在九成食品中含有添加剂，这也可能是淋巴瘤发病的重要原因之一。”国家中西医结合肿瘤重点学科主任欧阳学农主任医师日前告诉记者，加工食品中滥用的非法食品添加剂已经成为导致淋巴癌发病重要因素之一。 　　食品添加剂或可导致淋巴细胞变异 　　“在长期过量食用食品添加剂的不良影响下，有可能促使淋巴细胞在生长过程中发生变异，增加患上淋巴瘤的风险。”欧阳学农说。 　　据了解，淋巴癌是发生于淋巴结的恶性肿瘤，除了我们平时所知道的颈部、腋窝、腹股沟等处会长肿块之外，还可能存在于全身各处，比如脑淋巴瘤、肺淋巴瘤、胃淋巴瘤、口腔淋巴瘤等。 　　“人越年轻，淋巴细胞就越有活力，也就越容易得淋巴癌。恶性淋巴瘤多发生在20岁到40岁的青壮年。”欧阳学农说，淋巴癌的产生原因仍然不明确，与人自身免疫防御系统缺陷、病毒感染、化学物质、射线、基因突变等有关，如今，当人类的食物97%都含有添加剂时，几千种添加剂充斥我们的生活时，对于癌症的重新认识，应当谨慎考虑添加剂这一风险因素。 　　食品添加剂是人为添加到食品中的天然物质或人工合成的化学物质，在使用标准范围以下，人体的代谢能力可以降解出去，是相对安全的，但是一旦超过标准，过量的添加剂就会沉积在体内伤害各个器官，造成病变甚至致癌。尽管尚未有人类肿瘤的发生和食品添加剂有关的直接证据，但许多动物实验已证实大剂量的食品添加剂能诱使动物发生肿瘤。 　　“淋巴系统是身体重要的防御系统，就像人体的‘军队’，它可以帮助身体抵抗各种病原体，像细菌、霉菌等，让我们免于疾病的侵害。和这新病原体‘作战’的淋巴细胞容易在食品添加剂的不良影响下，有可能发生变异，直接或间接影响淋巴瘤的形成。”欧阳学农说。 　　动物实验多证实添加剂有致淋巴瘤作用 　　“许多动物实验已证实大剂量的食品添加剂能诱使动物发生淋巴瘤。”欧阳学农说。 　　如亚硝酸钠是食品添加剂亚硝酸盐的一种，国外试验证实，同时服用乙胺丁醇和亚硝酸钠，小鼠淋巴瘤的发生率提高，而单用乙胺丁醇对淋巴瘤发生率无影响。 　　作为人造甜味剂之一的蔗糖素，常用于食物和饮料。然而，美国食品药品管理局(FDA)在批准蔗糖素的报告中明确指出：在一个老鼠淋巴瘤突变试验中，科学家发现蔗糖素具有轻微的诱变性，根据检测致癌物的一种标准方法——艾姆斯试验结果，蔗糖素被消化时分解的物质也有“轻微的诱变性”。 　　“一些非法的添加剂致癌作用就更不用说了。”欧阳学农告诉记者，苏丹红作为一种非法食品添加物，对人体具有潜在致癌性，国际癌症研究机构将苏丹红一号归为三类致癌物，主要基于体外和动物试验的研究结果：苏丹红一号在特定存在的条件下，对小鼠淋巴细胞具有致突变作用。 　　此外，有的食品添加剂本身即可致癌，作为牛奶酸化剂的花楸酸、淀粉变性剂的琥珀酐、面包防硬剂的聚氧化乙烯乙醇硬脂酸等，在动物实验中都具有致癌活性 有的添加剂可在使用过程中，与食品中的存在成分发生作用转化为致癌物质，如能保持肉色鲜嫩的亚硝酸盐，会与蛋白质代谢后产生的胺类物质结合，形成亚硝胺，具有很强的致癌性。其他种类的防腐剂如苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸等，经毒理研证，较多剂量的摄入，也会影响人体的正常机能，削减人的免疫力，这就为人体细胞的变异提供了前提。 　　加工食品多含添加剂 自己动手最健康 　　“食品添加剂最主要的作用是为了让快速生产出的食品，看起来更鲜亮、闻起来更香，吃起来可口、保质期更长，同时由于它大多来自边角边料，所以有可能价格更便宜。”欧阳学农说，食品加工商为了让食品在经历漫长的运输和保存之后仍旧色彩诱人、香气扑鼻，绞尽脑汁的合成和添加各种食品添加剂。 　　如加入次亚氯酸钠可以给切过的蔬菜杀菌，让蔬菜更鲜亮 加入苯甲酸钠可以让碳酸饮料保持新鲜口感 加入碳酸氢钠可以使曲奇饼干膨松可口 加入环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)能增加蛋糕和饮料的甜度 加入胭脂红，可以让食物的颜色红亮诱人。 　　“一个三餐都通过这些食品解决的成年人，每天添加剂摄入量约为10克左右，种类高达六七十种。”欧阳学农说，“要想远离他们，最好自己购买新鲜食品原料，亲自烹饪。” 　　“购买的食物加工度越高，使用的添加剂也越多。如果一味追求方便快捷，必然要牺牲健康，甚至是生命。”欧阳学农说。 　　———————— ■相关链接 —————————— 　　发热、消瘦、盗汗 或是淋巴瘤症状 　　淋巴癌临床早期症状不痛不痒、隐匿不易察觉，很多患者会将发烧等症状与感冒病症混淆。因此，有三种常见并发症要注意： 　　发热，体温长期徘徊在38℃—39℃之间，有持续高热，也有间歇低热，少数有周期热。消瘦，多数病人有体重减轻的表现，在短时期内减少原体重的10%以上。盗汗，夜间或入睡后出汗。 　　欧阳学农强调，并不是所有的淋巴结肿大都是癌，其中不少是炎症或良性病变等正常反应。此外，直径超过一厘米大小的肿块才有临床检查的意义，所以，发现异常时要警惕，及时就医，但不要过分紧张。 　　早期的淋巴瘤，通过以放疗为主的治疗手段就能治愈，到了中晚期的时候，需要用化疗为主的手段。欧阳学农主任指出，确诊患了淋巴瘤不必害怕，大量临床实验证实，50%—60%早期患者使用免疫化疗可以被治愈，晚期也有30%—40%的治愈率，疾病能否治愈的关键是首次治疗是否成功。 　　他提醒，工作压力大的白领、经常熬夜的人、长期过度疲劳者、经常处于电子辐射或射线环境者，都需要定期自查，触摸身体表层是否有肿大的淋巴结。平时，多接受日照，生活规律 尽量不要在新房装修好后即入住 购买新车后，进行甲醛测试，并保持较长时间开窗通风。此外，常吃葡萄、茶叶、海带、大豆、红萝卜、番茄、香蕉、橘子、菠菜等碱性食物，防止酸性废物的累积。

血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，其发病机制复杂，环境因素、遗传因素、免疫因素等都被认为与疾病的发生、进展密切相关。淋巴细胞亚群中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤淋巴细胞及淋巴细胞功能亚群调节性T细胞是细胞免疫检测的常用指标，广泛用于血液肿瘤患者的免疫状态评估、疾病复发或转移风险预测及治疗指导等。为了更加深刻认识淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的作用，加强其检测过程的质量管理，促进其规范地应用于临床，由中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会牵头组织国内血液肿瘤和临床检验领域多位专家，制定了该专家共识。该共识介绍了淋巴细胞亚群的检测方法，归纳总结了其对血液肿瘤筛查、复发转移预警及预后评估、合并感染风险预警、造血干细胞移植后免疫重建监测与移植物抗宿主病预防、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗后监测、用药指导与疗效监测等方面的应用，并对血液肿瘤患者的监测方案与随访时机选择做出了推荐。淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会通信作者：杨再林，E-mail:804728092@qq.com武坤, E-mail:wukun@ydyy.cn 刘耀, E-mail:liuyao77@cqu.edu.cn本文已被本刊录用并于5月9日在中国知网发表，转载、引用请注明出处。知网首发网址：https://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20230508.1716.002.html原文阅读：淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，具有高度异质性。2022版《造血与淋巴组织肿瘤WHO分类》根据肿瘤细胞的来源，将血液肿瘤主要分为髓系增殖和肿瘤、髓系/淋系肿瘤和其他谱系未定白血病、组织细胞/树突状细胞肿瘤、B淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、T淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、NK细胞肿瘤、淋巴组织间质源性肿瘤、遗传性肿瘤综合征8个大类。血液肿瘤的发生、发展和转归与其患者机体的免疫功能，尤其是细胞免疫功能密切相关[1-2]。随着疾病的发生发展，免疫微环境也随之发生相应变化，进而引起外周血中各种免疫细胞亚群的改变。淋巴细胞是构成人体免疫系统的主要细胞，根据淋巴细胞表面的标记物和功能，淋巴细胞可以分为许多不同的群体。临床上常用流式细胞术（FCM）对外周血中的不同群体的淋巴细胞进行鉴别和计数，包括CD3+T淋巴细胞，CD3+CD4+辅助/诱导T淋巴细胞，CD3+CD8+抑制/杀伤T淋巴细胞，CD3-CD19+B淋巴细胞，CD3-（CD16+CD56）+NK淋巴细胞，简称为TBNK，及CD3+CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞（Treg）[3]等。本共识中将TBNK和Treg统称为淋巴细胞亚群。血液肿瘤作为造血干细胞异常的恶性肿瘤，疾病的多种因素会影响免疫细胞的产生、增殖及分化，使外周血的淋巴细胞数量与功能产生异常[4]，导致免疫功能失调[5-6]，因此对血液肿瘤患者进行规范的淋巴细胞亚群检测十分必要。为了规范淋巴细胞亚群检测中的实验方案、技术操作，使更多相关领域的临床、科研和实验室技术人员认识到淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者诊断、预后评估、治疗指导中的作用及注意事项，进一步促进其在血液肿瘤中的应用，中国医药质量管理协会医学检验质量管理专委会结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。 1淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的意义 1.1 血液肿瘤的发生、进展、预后与免疫功能的关系正常情况下，免疫系统对肿瘤细胞有监视和清除作用，维持机体内环境的稳定。免疫功能异常可能会导致细胞免疫和体液免疫失调，从而为肿瘤的发生和发展提供条件[7-9]；在病原体感染时免疫系统也会受到影响，当免疫功能下降时，肿瘤发生的风险增加[10-11]。文献报道急性白血病、B细胞淋巴瘤等患者常见外周血T细胞数量及CD4+/CD8+比值下降，并伴免疫功能紊乱[12-13]。Treg的主要功能是抑制自身免疫应答，维持免疫平衡，避免过度的炎症反应和自身免疫性疾病的发生，在免疫系统中发挥重要的负向调控作用。在血液肿瘤中，Treg一方面可以通过抑制对肿瘤细胞的免疫反应来促进肿瘤生长；另一方面也可通过抑制炎症和防止可能导致肿瘤发展的自身免疫反应而发挥保护作用。研究发现，多种类型的血液肿瘤患者Treg数量呈现上升趋势，可能会导致肿瘤免疫逃逸的发生[14-15]。此外，一些淋巴细胞产生的细胞因子，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等，在血液肿瘤患者中异常表达，进一步说明了机体免疫功能异常和血液肿瘤之间关系密切[16-18]。近年来，一些新型的免疫治疗策略也在血液肿瘤的诊疗中发挥日益重要的作用，例如采用免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗、双重特异性抗体治疗等[19-22]，这些治疗手段主要是通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，来达到治疗目的。1.2 淋巴细胞亚群在血液肿瘤中的临床意义淋巴细胞亚群在血液肿瘤中的临床应用主要包括以下方面。（1）部分血液肿瘤的筛查。血液肿瘤包括多种类型，其中一些类型可表现为特定淋巴细胞亚群的增殖和分化异常，通过淋巴细胞亚群检测可以对这些类型的血液肿瘤进行初筛。如急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞增殖性疾病（CLPD）等[23]。（2）肿瘤复发及转移预警及预后评估。Treg在多种血液肿瘤中比例增加，可以通过抑制免疫细胞杀伤作用来帮助肿瘤细胞逃脱免疫监视，并且与恶性程度、转移倾向、复发率等预后指标密切相关[24-26]。（3）合并感染风险预警。（4）造血干细胞移植治疗患者的免疫重建评估与移植物抗宿主病（GVHD）预防。Treg可以作为急性和慢性GVHD的生物标志物[27-29]。（5）CAR-T治疗患者的规范化管理和评估。（6）靶向药物、免疫抑制剂和化疗药物的疗效监测，治疗指导[30-31]。 2 淋巴细胞亚群检测的主要方法和结果报告 2.1 外周血淋巴细胞亚群检测的主要方法淋巴细胞亚群主要通过FCM进行检测。根据中华人民共和国卫生行业标准（WS/T 360-2011）《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[32]，FCM检测淋巴细胞亚群时，可以采用双平台法或单平台法。首选乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝真空管进行外周静脉血标本采集，并在24 h内进行检测。送检时间超过30 h应该采用肝素钠或枸橼酸钠抗凝，可在室温下稳定保存至48 h，若用双平台法，应采用同一标本进行白细胞计数和分类，则应该选择EDTA-K2作为抗凝剂。若送检时间超过48 h，应该使用流式细胞检测专用的样本保存液或样本保存管，可稳定保存至14 d。TBNK检测推荐的单抗为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56，Treg检测的单抗为CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T细胞标记为CD3+，CD4+T细胞标记为CD3+CD4+，CD8+T细胞标记为 CD3+CD8+，B细胞标记为CD3-CD19+，NK细胞标记为CD3-（CD16+CD56）+，Treg细胞的标记为CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127low/-。T细胞表面CD127的低表达与T细胞质内FoxP3的高表达具有良好的相关性[33-35]，且以CD127为标志进行检测方法明显优于以细胞质内FoxP3为标志的检测方法[36-38]，因此也可以使用CD127替代FoxP3进行Treg细胞的分析。上机检测前应采用配套的标准微球对仪器进行全程质控。推荐每管获取淋巴细胞数应不小于10 000个，得到的检测数据可通过调整荧光补偿、圈门等将各种不同表型的淋巴细胞亚群区分开[39-41]，进而得到各群细胞的相对比例及计算绝对数。推荐同时报告淋巴细胞亚群的百分比和绝对计数结果。2.2 外周血淋巴细胞亚群检测的结果报告通常应报告以下内容：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞的相对计数（百分比）和绝对计数（绝对值）、CD4+/CD8+比值、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。2.2.1 外周血淋巴细胞亚群检测的参考区间近年来已有多篇文献发布了我国不同地区、年龄、民族健康人群的TBNK、Treg细胞参考区间[42-46]。在2023年2月中华医学会健康管理学分会发表的《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》中公布了一项对我国九省（湖北、河南、广东、吉林、山东、山西、江苏、浙江、四川）20~60岁健康成人TBNK淋巴细胞参考区间的研究结果[45- 47]，可供参考，见表1。在2017年一项研究中发布了健康成年人外周血Treg细胞参考区间[48]，可供参考，见表2。由于Treg在多种疾病的临床治疗与疗效观察方面具有重要探讨价值，近年来许多国内实验室均报告了疾病观察组与健康对照组中外周血Treg细胞占CD4+T细胞的参考区间，如张宁等[49]报道了健康对照组参考区间为（4.52 ± 0.50）%，陈赛英等[50]报道了健康对照组参考区间为（6.85 ± 1.86）%，XU等[51]报道了健康成人的参考区间为（5.52 ~ 7.70）%，QIU等[52]报道了健康对照组参考区间为（5.70 ± 1.43）%。淋巴细胞亚群参考区间的建立受年龄、性别、种族、地域及仪器试剂等众多因素影响[47]，建议有条件的实验室可以针对本地区、本实验室检测体系等建立自己的参考区间及评价体系。调查健康人群淋巴细胞亚群的参考范围，建立95%可信区间的参考值区间，应满足每组至少120例健康样本数量[53]。此外，鉴于人员、仪器、试剂、方法、环境等诸多变化因素，实验室应对已建立的参考区间定期进行验证，每次验证应不少于20例健康样本，分布在参考区间外的测定值应不超过10%[32, 53]。若分布在参考区间外的测定值超过10%，则需要重新验证或考虑实验室分析程序、人群差异等其他因素。2.2.2 外周血淋巴细胞亚群检测报告的审核和发布进行淋巴细胞亚群检测的实验室都应该参加国家卫生健康委员会或省市级临检中心组织的室间质评，从而保证本室检测结果的准确性。在检测患者样品前，实验室人员应确认仪器状态正常和室内质控在控。在报告结果时，实验室人员要审核数据采集阈值的设置、抗体的组合方案、与实验结果相关的所有设门等，以排除样本异常和实验操作导致的检测结果异常。实验室人员还应根据检测结果的内部关系初步判断结果的可靠性。例如，数据应满足：CD3+% + CD19+% + （CD16+CD56）+% ≈（100 ± 5）%；CD4+% +CD8+% ≈ CD3+% （变化范围为5%~10%）[32]。若不满足，则需充分检查，必要时重复实验，在排除仪器、样品、操作等问题后如实报告检测结果，并需要重点分析该样本中是否存在异常表型的淋巴细胞，并用该样本制作血涂片镜检及进一步进行免疫分型对异常细胞进行鉴定，并及时与临床进行沟通。目前，由于国内没有针对Treg细胞检测项目的室间质评，因此应进行实验室间比对。 3 淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者中的应用 3.1 血液肿瘤的筛查当出现以下情况：（1）B或NK淋巴细胞显著增高；（2）CD3+CD4+CD8+T淋巴细胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴细胞明显增高；（3）CD4/CD8比值大于10:1或小于1:10；（4）CD3+%+CD19+% +（CD16+CD56）+%明显大于或小于（100 ± 5）%、CD4+%+CD8+%明显大于或小于CD3+%（变化范围为5%~10%），在排除标本、仪器、设门、试剂及反应性改变等因素后，需要考虑标本中存在异常淋巴细胞，并结合临床进行血液肿瘤的筛查。血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变见图1，血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径见图2。注：A表示T淋巴细胞群比例增高；B表示B淋巴细胞群比例增高；C表示NK细胞群比例增高；D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴细胞比例之和小于95%，存在不表达CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴细胞；F表示CD4+T、CD8+T淋巴细胞群比例大致正常；G表示CD4+T淋巴细胞群比例降低，CD8+T淋巴细胞群比例增高；H表示CD4+T淋巴细胞群比例增高，CD8+T淋巴细胞群比例降低；I表示中CD4+CD8+T淋巴细胞群比例增高；J表示CD4-CD8-T淋巴细胞群比例增高。图1 血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变注：A表示T淋巴细胞群比例增高；B表示B淋巴细胞群比例增高；C表示NK细胞群比例增高；D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴细胞比例之和小于95%，存在不表达CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴细胞；F表示CD4+T、CD8+T淋巴细胞群比例大致正常；G表示CD4+T淋巴细胞群比例降低，CD8+T淋巴细胞群比例增高；H表示CD4+T淋巴细胞群比例增高，CD8+T淋巴细胞群比例降低；I表示中CD4+CD8+T淋巴细胞群比例增高；J表示CD4-CD8-T淋巴细胞群比例增高。注：MICM表示形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学分型。图2 血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径3.2 血液肿瘤的复发、转移风险预警及预后评估当血液肿瘤患者外周血中出现CD4+和CD8T细胞减少，CD4+/CD8+比值降低，而Treg细胞明显增加时，提示肿瘤复发和转移的风险增加；CD3+、CD4+、CD8+T细胞的数量和比例与患者的完全缓解（CR）率、无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）呈正相关，而Treg的数量和比例与CR率、RFS和OS呈负相关[54-58]。在急性髓系白血病（AML）患者中，NK细胞数量和比例与CR率、RFS、OS呈正相关[59]，NK细胞数量减少的AML和多发性骨髓瘤（MM）可能有更差的预后[60-61]3.3 血液肿瘤合并感染风险预警感染是血液肿瘤患者的常见并发症[62]，CD4+T淋巴细胞在免疫防御中发挥关键作用。当CD4+T淋巴细胞绝对计数＜500个/μL时，血液肿瘤患者机会性感染风险会大幅升高[63]。CD4＋T、CD8＋T淋巴细胞数量低下的淋巴瘤患者，化疗后感染风险明显升高[64]。初诊时Treg细胞比例升高的血液肿瘤患者，其住院期间感染率明显增加[65]。3.4 造血干细胞移植后免疫重建监测及GVHD预防3.4.1 移植患者免疫重建监测造血干细胞移植（HSCT）后造血能力持久恢复与免疫系统功能调节密切相关，主要表现为免疫细胞数量的增加和细胞功能状态的恢复[66-67]。免疫重建受移植物来源、移植物数量与组分、预处理方案、胸腺功能等众多因素影响，但自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者外周血中TBNK、Treg细胞的重建规律基本相似。NK细胞恢复较快，一般移植后2~3周可恢复。CD3+CD8+T淋巴细胞一般移植后1~3月逐渐恢复，CD3+CD4+T淋巴细胞恢复通常需1年以上。CD3-CD19+B淋巴细胞移植后恢复时间不定，短至3个月，长至1年半以上。Treg细胞在移植早期通常比例非常低，移植晚期逐渐增多。3.4.2 移植患者GVHD预防GVHD是allo-HSCT患者需要面临的重要挑战。发生GVHD的患者，其疾病及移植相关死亡率大幅上升，尽早判断是否发生排异反应及抢先治疗是决定移植成败的关键。高炎症状态是GVHD的主要特点[68-69]。具有负调控炎症反应功能的Treg细胞随GVHD等级的增加呈下降趋势，有望成为预测急性GVHD（发生于移植后100 d内）和慢性GVHD（发生于移植100 d后）的特异性指标[70-71]。同时，植移后NK细胞迅速增加会促使炎症因子的大量分泌，从而促进急性GVHD发生[72-73]。因此allo-HSCT患者在早期植入阶段（输注后2~4周）、移植后早期阶段（输注后1~3月）、移植后晚期阶段（输注后3月以后）都建议行淋巴细胞亚群检测。3.5 CAR-T治疗患者的规范化管理和评估3.5.1 CAR-T细胞增殖监测CAR-T细胞免疫治疗目前已被用于治疗复发/难治性的血液肿瘤。定期监测CAR-T治疗患者体内的CAR-T细胞水平、肿瘤负荷、免疫功能（主要包括淋巴细胞亚群的比例和数量）和相关不良反应（细胞因子释放综合征、神经毒性等），是治疗后病情评估的重要手段[74-75]。患者回输CAR-T细胞后，可通过FCM监测外周血中CAR-T细胞的比例和数量，结果报告中一般包括总CAR-T细胞（占淋巴细胞）、CD4+CAR-T细胞（占T淋巴细胞）和CD8+CAR-T细胞（占T淋巴细胞）的比例和数量。有条件的实验室还可开展荧光定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）监测CAR-T细胞增殖水平。多项临床试验数据显示，体内CAR‑T细胞增殖水平与疗效显著正相关[76-78]。3.5.2 淋巴细胞亚群监测淋巴亚群检测也被推荐与CAR-T细胞监测同时进行[75]。有研究通过检测患者CAR‑T细胞回输后第15天的外周血淋巴细胞水平，发现低水平的淋巴细胞数（血液肿瘤患者常伴有免疫功能失衡，细胞免疫功能往往处于免疫抑制状态，对突变细胞的识别和杀伤能力下降[94-95]。检测初诊时患者的淋巴细胞亚群，能有效判断患者免疫功能的初始状态。3.7.3 放化疗、免疫治疗及靶向治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访放化疗、免疫治疗及靶向治疗期间患者可呈周期性改变[96]，可通过检测患者每个周期治疗前后的淋巴细胞亚群变化，来评估患者治疗期间免疫功能恢复情况及肿瘤复发和转移的风险。建议有条件的情况下，可在治疗结束后半年内每3个月跟踪检测，半年后每6个月进行随访。3.7.4 造血干细胞移植患者的淋巴细胞亚群监测与随访建议造血干细胞移植后患者的淋巴细胞亚群检测时间可在移植后第14天、第21天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年随访[97-101]。3.7.5 CAR-T治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访建议连续监测患者CAR-T细胞回输前1天、回输后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴细胞亚群变化情况，及治疗后2个月、3个月、6个月随访。见图3。图3 血液肿瘤淋巴细胞亚群检测与随访路径图 4 结语随着流式细胞术的广泛应用，用于免疫功能评价的淋巴细胞亚群检测在临床已广泛开展，通过TBNK、Treg这些指标，可以评估血液肿瘤患者免疫状况，为疾病诊断、分型，治疗方案的选择、化疗后感染预防，疾病转归等提供实验室依据，以及为血液肿瘤患者的个性化治疗提供参考。机体免疫功能是动态变化的，由于受年龄、药物、感染、营养、生理等众多因素的影响，存在较大的个体差异。不同疾病状态下淋巴细胞亚群检测结果也可能呈现出较大的差异，因此在参考范围的建立、报告结果解读等方面依然存在挑战。针对血液肿瘤患者，临床工作中需要建立患者个体化的淋巴细胞亚群基线水平，动态监测淋巴细胞亚群结果的变化趋势，并结合多种免疫功能检测指标，综合分析患者的免疫状态，为临床决策提供更加全面的参考。淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中具有重要的临床意义和广泛的应用前景，本共识的发布将有助于推动淋巴细胞亚群检测临床实践中的应用，促进血液肿瘤的诊断、治疗和预后评估水平的提高，期望能够为我国血液肿瘤的精准诊疗做出贡献。专家组组长：杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）执笔人（按姓氏汉语拼音排列）：陈双（重庆大学附属肿瘤医院）、程沈菊（昆明医科大学第一附属医院）、蒋亭亭（重庆大学附属肿瘤医院）、李轶勋（昆明医科大学第一附属医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）、彭余（重庆大学附属肿瘤医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）专家组成员（按姓氏汉语拼音排列）：陈曼（北京陆道培医院）、陈朴（复旦大学附属中山医院）、池沛冬（中山大学肿瘤防治中心）、蒋能刚（四川大学华西医院）、李力（南部战区总医院）、李珍（南方医科大学南方医院）、李国盛（山东大学齐鲁医院）、李智伟（新疆维吾尔自治区人民医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）、刘艳荣（北京大学人民医院）、马骁（苏州大学附属第一医院）、毛霞（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、倪万茂（浙江省人民医院）、冉隆荣（重庆大学附属肿瘤医院）、任方刚（山西医科大学第二医院）、王卉（河北燕达陆道培医院）、王慧君（中国医学科学院血液病医院）、王剑飚（上海交通大学附属瑞金医院）、翁香琴（上海交通大学附属瑞金医院）、吴丽娟（西部战区总医院）、吴雨洁（江苏省人民医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、徐翀（上海市临床检验中心）、杨军军（温州医科大学检验医学院）、杨顺娥（新疆医科大学附属肿瘤医院）、杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）、岳保红（郑州大学第一附属医院）、张爱梅（中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院）、张会来（天津医科大学肿瘤医院）、赵明宇（重庆大学附属肿瘤医院）、朱杰（大连医科大学附属第二医院）、朱莉（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、朱明清（苏州大学附属第一医院）、朱明霞（北京大学第三医院）、郑金娥（华中科技大学同济医学院附属协和医院）、周辉（湖南省肿瘤医院）利益冲突声明所有作者声明无利益冲突

课程主题：【小贝开讲】流式应用实例分享之儿童急性淋巴细胞白血病课程时间：2021/06/08 14:00课程简介：急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童常见血液病，其中B-ALL 约占85%，T-ALL约占15%。ETP-ALL占T-ALL的15%，即约占儿童ALL的2.25%，临床少见，是一类具有独特免疫表型的高危疾病。本文介绍一例儿童ETP-ALL，并回顾分析我院2006年-2020年的T-ALL病例，讨论国内国际ETP-ALL采用标准不同，ETP-ALL在T-ALL的比率存在差异。王维维 上海交通大学医学院附属新华医院副主任检验技师医学博士，临床检验副主任技师* 目前担任流式细胞术组组长，上海市医学会成员，上海市医学会检验分会形态诊断工作组学组秘书，上海市医学会检验分会流式和细胞分析学组成员。* 目前主要研究方向为肿瘤免疫和血液学诊断，主要从事流式细胞术在血液系统疾病如白血病、淋巴瘤和儿童实体肿瘤、及免疫缺陷等疾病中的检测及诊断工作，主持国家自然科学基金课题1项，获得人才培养项目2项，参与国家级及省市级课题多项，目前共发表及参与发表SCI论文20余篇，发表中文核心论文多篇。

研究背景T-LGLL是一种罕见的慢性淋巴细胞增生性疾病（Chronic Lymphoproliferative Disorder, CLPD），其特征是血液或组织中的成熟细胞毒性T细胞，如大颗粒T淋巴细胞（T- Large Granular Lymphocytes, T-LGL）的克隆性增生。由于缺乏特异性基因标志物，其表现（绝对计数变化、形态、免疫表型特征等）又常常与反应性扩增相似，因此，在T-大颗粒淋巴细胞白血病（T-Large Granular Lymphocytic Leukemia, T-LGLL）的诊断检测中，证明扩增的 T-LGL 的克隆性仍然是一个挑战，特别是在没有淋巴细胞增多（lymphocytosis）的情况下。利用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）分析T细胞受体β链恒定区1（Constant region 1 of T-cell receptor β chain, TRBC1）的表达（后续用TRBC1-FCM表示），已被证明是评估Tαβ细胞克隆性的一种有效、简单、快速和特异的方法。然而，由于更为成熟的Tαβ细胞相较于总Tαβ细胞，往往显示出更为宽泛的TRBC1+/TRBC1 -比值，TRBC1-FCM方法对于诊断T-LGLL 克隆性的实用价值，还有待进一步证实。研究目的研究者希望通过直接比较正常 Tαβ-LGL 与T-LGLL中 TRBC1+ 和 TRBC1-Tαβ 细胞的相对分布和绝对计数，验证TRBC1-FCM方法在诊断T-LGLL中特异性T细胞克隆的实用性。研究方法研究纳入了54例样本（EDTA抗凝的全血），样本分别来自17例正常对照（HD），8例反应性 Tαβ 淋巴细胞增多症，5例HDc（有T-LGL克隆的HD），及24例Tαβ-LGLL 患者（18 名 TαβCD8-LGLL、5 名 TαβCD4-LGLL和 1 名 Tαβ 双阴性 LGLL）。利用Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪，研究者设计了两组免疫分型方案（Panel I 和Panel II）对样本进行检测分析，整个过程严格遵循EuroFlow SOP进行。Panel I ，主要为TRBC1+细胞成熟标记（如CD27, CD28, CD45RA and CD62L等） Panel II，包括12个骨架抗体（TRBC1、成熟标记、LGL常见异常表型标记），4个主要系别标记（CD3, CD4, CD8 和 TCRγδ），TCRVβ和CD45。两组光谱流式免疫分型方案详细信息如下图1：图1-基于光谱流式的免疫分型方案结论利用Panel I，研究者比较了含有多克隆（n = 25）和单克隆（n = 29） LGL的血液中TRBC1+和TRBC1−的Tαβ-LGL的分布和绝对计数。总体而言，多克隆性TRBC1+或TRBC1− 的Tαβ-LGL细胞数量（百分比）在0.36 ~ 571细胞/μL之间（3.2 ~ 91% TRBC1+细胞），而单克隆性LGL的细胞数量（百分比）在51 ~ 11,678细胞/μL之间（96% TRBC1+细胞）。因此可以认为，通过总Tαβ细胞群体中TRBC1表达谱鉴定的病理性T-LGL的绝对计数不能作为检测Tαβ克隆性的通用（单一）标准，特别是在没有淋巴细胞增多和/或血液中携带相对较少（图2-TRBC1+和TRBC1−细胞的绝对计数和相对分布（多克隆vs.单克隆）接下来，研究者将TRBC1-FCM方案结合TCRVβ库和异常表型检测（Panel II），以进一步验证 TRBC1-FCM 方法在临床环境中对 T-LGLL 中 T 细胞克隆性进行高灵敏度评估的实用性，并提高其检测（小）LGL 克隆的特异性。一共有12个例的样本被纳入此步研究（6 个 HD、2 个 TαβCD8-HDc 和 4 个 TαβCD8-LGLL）。结果发现，T-LGLL 和 HDc 例中克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1-的 Tαβ 和 TαβCD8 细胞的绝对计数（32-5,515 个细胞/μL） ，显著高于来自正常/反应性例的多克隆 TRBC1+ 和 TRBC1- 的总 Tαβ（0-25 个细胞/μL）和 TαβCD8（0-21 个细胞/μL）细胞（图 3A&C）。但对TRBC1+ 细胞百分比的分析却并未观察到显著差异。提示，基于表达单个 TCRVβ 家族的细胞中 TRBC1 的表达模式识别 Tαβ-LGL 的克隆性，应该基于（表达单个TCRVβ 家族的克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1- Tαβ 和 TαβCD8 细胞）绝对细胞计数和/或异常表型表达的综合评估。关于Cytek

肿瘤浸润淋巴细胞（Tumour-infiltrating lymphocytes, TIL）具有天然的肿瘤特异性和抗原多样性，因此具有良好的实体肿瘤杀伤能力，其疗效依赖于分选得到的TIL细胞的高效恢复和扩增能力。然而，肿瘤中TIL细胞稀少、有效分离困难，限制了TIL疗法的进一步优化。　　近期，来自西北大学和多伦多大学的研究团队基于微流控技术和免疫磁珠技术研发了新型高通量细胞分选方法，实现TIL的高效识别与分选。研究成果发表于《Nature Biomedical Engineering》，标题为：Efficient recovery of potent tumour-infiltrating lymphocytes through quantitative immunomagnetic cell sorting。研究人员设计了MATIC （magnetic affinity targeting of infiltrating cells）的细胞分选方式，将微流控设备夹在永磁体中间，通过平衡磁力和流体拖拽力，对标记了磁性纳米颗粒的TIL细胞进行分选，实现了每小时处理32亿细胞的高通量，以及90%的捕获效率和95%的分选纯度。与常规细胞分选方法相比，该免疫磁性细胞分选方法可恢复多达30倍数量的TIL细胞，高数量和多活性的TIL细胞加速了TIL细胞扩增，增强了抗肿瘤效果。该分选方法还可识别和分选细胞亚群，在小鼠结肠癌细胞（MC-38）模型中，研究人员基于膜外三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（CD39）表达程度，对TIL细胞进行了进一步的分选，研究证明TIL细胞中CD39中等表达亚群具有最佳的肿瘤治疗效果。　　研究为增强TIL疗法的治疗效果提供了新的方法和思路，但是否普遍存在TIL细胞中CD39中等表达亚群具有更高抗肿瘤效果的现象，还需在更多模型和样本中深入验证。 　　注：此研究成果摘自《Nature Biomedical Engineering》杂志，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。　　原文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-021-00820-y

4月23日，国家卫健委重磅发布了《临床实验室生物安全指南（代替WS/T 442—2014）》、《刚地弓形虫试验临床应用》、《抗酵母样真菌药物敏感性试验标准 肉汤稀释法（代替WS/T 421—2013）》、《抗丝状真菌药物敏感性试验标准 肉汤稀释法（代替WS/T 411—2013）》、《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南（代替WS/T 360—2011）》、《血细胞分析校准指南（代替WS/T 347—2011）》共六项国家卫生行业标准。自2011年发布后首次修订《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》其中卫健委发布WS/T360-2014《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，于2011年首次发布，本次为首次修订。本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询,由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位:中国医学科学院肿瘤医院、北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市交通大学医学院附属第一人民医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海长征医院、苏州大学附属第一医院/江苏省血液研究所。本标准主要起草人:崔巍、彭明婷、屈晨雪、黄春梅、李莉、沈立松、周琳、朱明清、崔婵娟、李臣宾。主要更新变化内容：与WS/T360-2011相比除结构调整和编辑性改动外，主要更新如下：【1】增加了流式细胞仪性能验证内容(见5.1)；【2】完善了仪器质量控制和项目性能验证内容(见5.2、7.2.2)；【3】梳理和保留了检验前、检验中、检验后过程的内容及要求(见第6、7、8章)；【4】删减了标本采集和处理及临床意义内容(见2011年版的第4、10章)；【5】增加了淋巴细胞亚群六色分析方案(见4.1.3、附录C)。详情点击查看：https://www.instrument.com.cn/news/20240430/716213.shtml

2024年4月1日，卫健委发布WS/T360-2014《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，本标准于2011年首次发布，本次为首次修订。与WS/T360-2011相比除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下:【1】增加了流式细胞仪性能验证内容(见5.1)；5.1流式细胞仪的性能验证5.1.1 验证时机当新仪器启用前、搬移后、仪器发生重大维修(如更换激光、光纤、光电倍增管或流动室等)后、仪器软件系统更新后、仪器性能出现问题或环境严重失控时，需对流式细胞仪进行性能验证，所用流式细胞仪应符合医疗器械注册要求。荧光通道线性应在流式细胞仪常规使用过程中每年至少进行1次验证。5.1.2 验证参数验证参数应包括灵敏度、分辨率、荧光通道线性、仪器稳定性和携带污染率等。5.1.2.1 灵敏度5.1.2.1.1 散射光灵敏度采用己知大小的校准微球检测仪器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散点图上，应检测出直径0.5μm或更小的微球，或满足制造商声明的要求。5.1.2.1.2 荧光灵敏度即流式细胞仪能检测到标准荧光微球上的最少荧光分子数，可用等量可溶性荧光分子(MoleculesfEquivalent Soluble Fluorochrome，MESF)表示。可采用2~4种不同荧光素校准微球针对所用激发光源进行检测，其中FITC、PE及APC等通道的平均荧光强度(x)与其荧光分子数(y)分别进行双对数线性回归，得公式y=a+bx，其截距a的反对数值即为流式细胞仪的荧光灵敏度。FITC的荧光灵敏度应≤200MESF、PE的荧光灵敏度应≤100MESF、APC≤200MESF，或满足制造商声明的要求。5.1.2.2 分辨率5.1.2.2.1 散射光分辨率采用EDTA盐或肝素抗凝全血，取适量样品稀释后直接上机测定，标本在FSC/SSC散点图可将红细胞和血小板清晰地区分开 取适量样品裂解红细胞后上机测定，标本在FSC/SSC散点图可将淋巴细胞、单核细胞、粒细胞清晰地区分开，即认为散射光分辨率符合要求。示意图参见附录A。5.1.2.2.2 荧光通道分辨率采用校准微球上机测定，各荧光通道的分辨率CV值应符合制造商声明的要求。5.1.2.3 荧光通道线性可采用含有不同荧光强度的校准微球(已知其相应荧光素的可溶性荧光分子数)进行检测，计算每-种荧光微球的MFI，MFI与己知理论值的相关系数r应≥0.98，此方法适用于校准微球上的荧光素可被定量检测的荧光通道。亦可同时使用两种荧光强度不同的微球，在待测荧光通道下，通过改变光电检测器的电压，使两种荧光微球的实际MFI检测值由低到高分布,两种荧光微球的荧光强度比值应保持不变。此方法适用于流式细胞仪所有荧光通道。5.1.2.4 仪器稳定性连续开机条件下，采用荧光微球在开机稳定后0h和8h各检测一次FSC及各荧光通道的IFI，以第一次检测时间点测定的各通道MFI值作为基线值，荧光微球8h上机测定的每一通道的MFI变化范围均应在基线值土10%范围内。5.1.2.5 携带污染率使用浓度为5000个/HL~10000个/HL的校准微球上机进行测定，获取至少100000个颗粒，连续测定3次，计算检测通道内设定区域的颗粒数，分别记为H1、H2、H3:再使用空白溶液上机测定，获取颗粒303，连续测试3次，计算该检测通道内设定区域的颗粒数，分别记为L1、L.2、L3。按照此步骤重复循环3次。按携带污染率公式[(L1-L3)/(H3-L3)]X100%进行计算，取最大值。携带污染率应≤0.5%。【2】完善了仪器质量控制和项目性能验证内容(见5.2、7.2.2)；5.2外周血淋巴细胞亚群检测系统的性能验证5.2.1 验证时机及验证内容淋巴细胞亚群检测项目临床开展初期、更换试剂品牌、更换检测系统或仪器的重大部件维修后，应对检测项目的精密度、稳定性、线性范围、可比性和正确度等参数进行验证。5.2.2 验证方法建议使用配套试剂盒时开展性能验证，使用自选试剂时实施性能确认:需要分别描述性能验证和性能确认的方法和评价标准。5.2.2.1 精密度5.2.2.1.1 批内精密度选取至少5个新鲜全血样品，样品的淋巴细胞亚群细胞计数应覆盖低中高水平。每个标品从荧光染色到上机检测重复3次，并确保所有测试都在同一台仪器的同一批内测定，整个操作过程由同一个操作人员完成。先计算每个样品重复3次后检测结果的CV,然后计算所有样品的平均CV，所有样品的平均C宜10%，最大不超过20%。实验室可根据不同水平的淋巴细胞亚群细胞计数设定不同程度的可接受Q标准。5.2.2.1.2 日间精密度宜使用正常和异常两个浓度水平的全血质控品，每天从荧光染色到上机测定重复操作3次，至少市复4天，整个操作过程可由不同操作人员完成。先计算每天每个全血质控品重复3次检测结果的CV值，然后据此计算每个全血质控品4天的平均CV，最后得出两个全血质控品检测结果的平均CV。结果判定同本标准第5.2.2.1.1条。5.2.2.2 稳定性5.2.2.2.1 样品稳定性验证样品在确定的抗凝及处置条件下的稳定性。采集健康人或患者的样品至少5份，即刻染色-裂晖-固定并上机测定，以此结果作为基线参考水平，按照实验室的具体环境温度控制条件和预期的样品待检时间，在抗凝剂保存时间内，设置不同的时间点对上述样品进行重复处理和上机测定，获取检测结果，并与基线水平结果进行比较以相对偏差或绝对偏差表示,检测结果应符合实验室制定的验证要求。险证要求的制定应考虑不同水平的淋巴细胞亚群计数设定不同程度的偏差值，淋巴细胞亚群计数过低者，宜以绝对偏差进行验证:亦可对试剂说明书声明的稳定性条件进行验证。5.2.2.2.2 处理后标本稳定性旨在明确处理后标本的最长待检时间。采集健康人或患者的样品至少5份，对完成染色-裂解-固定后的标本即刻上机检测结果作为基线水平。按实验室获得检测结果的最长可接受时间为期限，设置不回的时间点对固定后标本进行上机检测。结果判定同本标准第5.2.2.2.1条。亦可对试剂说明书声明的稳定性条件进行验证。5.2.2.3 线性范围适用于淋巴细胞亚群绝对细胞计数。根据试剂说明书声明的线性范围，取一份淋巴细胞计数或亚群计数接近线性范围上限的临床样品，采用样品稀释液按照比例制备5~9个不同浓度的标本(如0、25%、50%、75%、100%等)，浓度范围应覆盖临床医学决定水平:通过染色-裂解-固定后，上机测定，每个标本重复测定4次，取均值。分析实际测定的亚群细胞数量均值与理论值之间的相关性，相关系数应≥0.975。5.2.2.4 可比性5.2.2.4.1 不同检测系统间的可比性验证宜使用至少5份新鲜全血样品(样品的淋巴细胞亚群细胞计数应覆盖低中高水平)和2份不同浓度水平的全血质控品，完成染色-裂解-固定后，分别采用待评价检测系统和比对检测系统进行检测。比对检测系统应为仪器性能良好、规范开展室内质量控制、室间质量评价成绩合格的淋巴细胞亚群常规检测系统，以比对检测系统的测定结果为参考，计算相对偏差或绝对偏差。检测结果应符合实验室制定的验征要求。验证要求的制定应考虑不同水平的淋巴细胞亚群计数设定不同程度的偏差值，淋巴细胞亚群计敬过低者，宜以绝对偏差进行验证。5.2.2.4.2 抗体试剂批次变更前后的可比性验证宜使用至少3份健康人的新鲜全血样品和2份不同浓度质控品采用新批号抗体试剂和当前批号抗体试剂进行荧光染色、上机检测，以当前批号试剂检测结果为参考，计算相对偏差或绝对偏差。检测结果立符合实验室制定的验证要求,验证要求的制定应考虑不同水平的淋巴细胞亚群计数设定不同程度的偏叁值，淋巴细胞亚群计数过低者，宜以绝对偏差进行验证。5.2.2.4.3 不同检测人员间的可比性验证宜使用至少5份新鲜全血样品和2份不同浓度水平的全血质控品分别由实验室内淋巴细胞亚群检测培训合格的不同检测人员完成染色-裂解-固定、上机检测和数据分析，计算不同检测人员间检测结果的相对偏差或绝对偏差。验证结果应符合实验室制定的验证要求。5.2.2.5 其他可使用室间质评回报结果验证淋巴细胞亚群项目的准确度亦可采用包含正常和异常浓度水平的具有溯源链的定值样品验证正确度，每一样品重复测定3次，每次测量值均在给定范围内且3次测量值的均值与标准值的偏倚在允许范围内为通过。选择至少20份表观健康人样品按照常规方法进行淋巴细胞亚群参考区间验证。7.2.2 仪器稳定性验证7.2.2.1 光路/液路稳定性验证检测当天宜使用校准微球进行光路/液路稳定性验证。记录每个检测通道的分辨率的变异系数(CV)，CV值应满足本标准第5.1.2.2.2条荧光通道分辨率要求。7.2.2.2 检测通道电压稳定性验证和调整应使用标准微球进行各检测通道电压验证检测通道电压的浮动应在标准微球的说明书允许范围或者实验室自建的可接受范围内。自建方法如下:在相同的电压设置下，10~20个工作日内检测标准微球20次，使用Levy-Jennings图建立每个参数的可接受范围(均值士2SD和均值士3SD)。【3】梳理和保留了检验前、检验中、检验后过程的内容及要求(见第6、7、8章)；【4】删减了标本采集和处理及临床意义内容(见2011年版的第4、10章)；【5】增加了淋巴细胞亚群六色分析方案(见4.1.3、附录C)。以下为完整内容：本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询,由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位:中国医学科学院肿瘤医院、北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市交通大学医学院附属第一人民医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海长征医院、苏州大学附属第一医院/江苏省血液研究所。本标准主要起草人:崔巍、彭明婷、屈晨雪、黄春梅、李莉、沈立松、周琳、朱明清、崔婵娟、李臣宾。

FDA批准艾伯维突破性抗癌药Imbruvica一线治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）美国生物技术巨头艾伯维（AbbVie）抗癌管线近日在美国监管方面传来特大喜讯，FDA已批准突破性抗癌药Imbruvica（ibrutinib）用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的一线治疗。此次批准，首次为CLL群体提供了一种无化疗（chemotherapy-free）的一线治疗选择，同时也使得Imbruvica在美国的治疗适应症达到了5个之多。此前，Imbruvica已获FDA批准用于：复发性或难治性套细胞淋巴瘤（MCL）、经治慢性淋巴细胞白血病（CLL）、携带17p删除突变的CLL、Waldenstrom巨球蛋白血症（WM）。在美国，大约有11.5万例慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者，每年新增约1.5万例。CLL患者多为老年患者，平均诊断年龄为71岁。此次批准，标志着CLL临床治疗的一个重大飞跃，将为CLL群体提供除传统化疗之外的一种新的一线治疗选择。Imbruvica最初由美国医药巨头强生（JNJ）与Pharmacyclics公司共同开发，之后，强生在去年3月计划以超过170亿美元收购Pharmacyclics，但却被艾伯维以210亿美元成功抢婚。通过此次收购，艾伯维获得了这款“钱”途无量且与自身肿瘤学管线完美互补的突破性抗癌药Imbruvica在美国市场的销售权，该药在美国监管方面先后获得了突破性药物资格、优先审查资格、加速批准及孤儿药地位。去年，Imbruvica在美国已获批的4个适应症，为艾伯维带来了近10亿美元的收入。业界对Imbruvica的前景也十分看好，预计该药的年销售峰值将突破50亿美元。此次，Imbruvica一线治疗CLL新适应症的获批，是基于一项随机、多中心、开放标签III期RESONATE-2（PCYC-115）临床研究的数据，该研究在269例初治（既往未接受治疗）慢性淋巴细胞白血病（CLL）或小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）老年患者（年龄≥65岁）中开展，调查了Imbruvica相对于苯丁酸氮芥（chlorambucil）的疗效和安全性。根据独立审查委员会（IRC）的评估结果，与苯丁酸氮芥相比，Imbruvica显著延长了无进展生存期（中位PFS：未达到 vs 18.9个月），疾病进展或死亡风险显著降低84%，达到了研究的主要终点。此外，与苯丁酸氮芥相比，Imbruvica也与显著更高的IRC评估的总体缓解率相关（ORR：完全缓解+部分缓解，82.4% vs 35.3%，p＜0.0001）。Imbruvica治疗组有5例（占3.7%）实现完全缓解，苯丁酸氮芥治疗组有2例（占1.5%）实现完全缓解。Imbruvica（ibrutinib）是一种首创的口服布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，通过抑制肿瘤细胞复制和转移所需的BTK发挥抗癌作用。Imbruvica能够阻断介导恶性B细胞不可控地增殖和扩散的信号通路，帮助杀死并降低癌细胞数量，延缓癌症的恶化。在临床试验中，Imbruvica单药及组合疗法针对广泛类型的血液系统恶性肿瘤展现出了强大的疗效，包括慢性淋巴细胞白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、Waldenstrom巨球蛋白血症（WM）、弥漫性大B细胞淋巴癌（CLBCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、多发性骨髓瘤（MM）及边缘区淋巴瘤（MZL）等。

人NK/T细胞淋巴瘤细胞的处理方法与培养步骤！ NK/T细胞淋巴瘤（NK/T cell lymphoma）是起源于成熟NK/T细胞的淋巴系统恶性肿瘤。NK细胞和T细胞具有共同的祖细胞，两者在功能和某些抗原的表达上具有相似之处，NK/T细胞淋巴瘤因起源于这两种细胞而得名。 细胞说明信息平台编号：Bio-129794规格：1×10⁶ Cells/T25培养瓶细胞信息：SNK-6细胞名称：人NK/T细胞淋巴瘤细胞细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。组织来源：淋巴细胞培养条件：1640培养基（GIBCO,货号11875093） +10%澳洲来源进口胎牛血清（GIBCO,货号10091148）+1%双抗形态：悬浮；淋巴母细胞样规格：1×10^6 cells/瓶用途：细胞系注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 细胞收到后的处理方法细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用 75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置 2-4 小时。镜下观察：未超过 80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入 6ml 完全培养基，放入 37℃、5%CO2 孵箱培养；超过 80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松） 细胞培养步骤1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入 6cm 皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。3）细胞冻存：1、细胞生长至覆盖培养瓶的 80%面积时，弃 25cm2 培养瓶中的培养液，用 PBS 清洗细胞一次；2、添加 0.25%胰蛋白酶消化液约 1ml 至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至 15ml 离心管中，1000rpm 离心 5min；3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；4、先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃。 对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。2、加 1-2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加 5ml 以上含 10%血清的完全培养基终止消化。3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在 1000RPM 条件下离心 8-10 分钟，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。4、按 5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按 1：2 的比例分到新的含 5-6 ml 培养液的新皿中或者瓶中。PS：若客户收到 2ml 小管细胞，收到细胞后，用 75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至 T25 培养瓶或 6cm 培养皿，加入 5ml 左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过 80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过 80%，可直接进行传代（方法同上）。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

时间：2018年11月1日 19:30 - 21:00内容简介：淋巴瘤是发生于淋巴结和/或结外淋巴组织的一组造血系统恶性肿瘤，不同类型的淋巴瘤在临床病程、治疗方案及总体预后方面具有很大的差异性，因此准确的诊断及分型至关重要。但淋巴瘤的确诊和分型则必须依赖免疫表型的检测分析。那流式细胞学是如何检测免疫表型的？在淋巴瘤诊断中具体有何应用？结果如何判读？检测过程又是怎样的呢？此次讲座，我们非常荣幸的邀请到了上海瑞金医院血液学研究所流式细胞室负责人翁香琴老师，主要围绕《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的专家共识》，给我们分享一下流式细胞学在淋巴瘤检测中的应用。主讲人简介：翁香琴 上海瑞金医院血液学研究所流式细胞技术平台 助理研究员遗传学专业，助理研究员，2003年开始负责上海瑞金医院血液学研究所流式细胞技术平台。 主要研究方向：多参数流式细胞术在血液系统肿瘤诊断及MRD监测中的应用，并以第一作者身份发表相关SCI论文数篇。参与执笔撰写《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识》和《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微量残留病专家共识》。 担任中华医学会免疫学分会流式细胞学组全国委员。

上海，中国——贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司——作为一家成立百年的专门从事诊断和生命科学相关产品生产和服务的技术型公司，在流式细胞产品有着完备的流程和系统，除了有流式细胞仪的生产工厂之外，还在在全球有3家配套流式试剂生产工厂：美国迈阿密、法国马赛、印度班加罗尔，为全球临床和科研用户提供高质量的流式试剂来满足当今流式细胞实验室的需求。试剂类型除了有传统的液体试剂也有最新型的干粉试剂。适应不同实验室、不同环境对于检测试剂的要求。ClearLab LS(淋巴瘤筛选方案) P/N B74074试剂用于各种血液淋巴样细胞异常样本的筛选研究。该试剂可以帮助鉴别诊断血液淋巴恶性肿瘤。该检测主要针对T，B及NK淋系细胞进行定性，其结果可以与其他实验结果进行综合解读。*一管即用型淋巴瘤筛选方案*采用贝克曼库尔特独家干粉专利技术，常温存储*预混10色共计12个抗体*用于Navios等3L10C高端流式*简化样本制备流程*可检测外周血，骨髓及淋巴结样本，适用于EDTA，肝素及ACD等多种抗凝样本*25人份包装更适合临床研究*CE注册*WHO 2008修订分类指导方案该方案的克隆及染料搭配基于能更契合临床研究的需要，鉴别样本中所有主要淋巴瘤型别，以及在正常和肿瘤阶段中主要造血细胞系别。ClearLab Compensation Kit 多色补偿试剂盒 P/N B74074 提供即用型干粉十色补偿管，可用外周血或补偿微球进行多色的流式补偿条件设置。*每盒5套*CE注册DURACLONE IF T细胞活化检测方案如今单细胞水平的细胞因子检测可以通过更为简单、灵敏的实验流程实现。即用型干粉试剂DuraClone§ IF T活化方案消除了由于抗体移液带来的误差，并采用简单快速的PerFix-nc通透方案，为您的细胞功能分析提供一套标准化工作流程！ 细胞免疫功能测定的往往操作方法繁琐，重复性差。DuraClone IF T活化试剂无需重复的抗体移液和避免不同抗体间效期问题，并且在紫光、蓝光和红光三个激光都提供了开放的检测的通道，为检测方案增添灵活性。红激光开放通道选取串色程度最低的灵敏度最高的APC染料，确保了在该检测通道的优先用于检测弱表达标记。DuraClone RE管贝克曼库尔特联合该领域的权威专家，对血液疾病（比如B淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤）临床研究中用于稀有细胞流式检测的灵敏抗体进行优化，推出了现在的DuraClone RE§管。该方案一共包含三个独立panel，可以对B细胞发育分化的不同阶段中含量极少的异常细胞进行检测，B80393针对成熟B淋巴异常细胞，含有ROR-1抗体，被认为是区分慢淋和正常B细胞以及套白MCL的一个全新标志物。B80394针对浆细胞中异常细胞。C00163针对未成熟B细胞中的异常细胞。三个方案均留有开放通道允许外加抗体或染料如核染色SYTO41，满足研究灵活便利的需要。DuraClone RE CLB管826,000个CD45+细胞数据分析示例。异常B细胞群以红点表示（568个，0.069% CD45+），正常B细胞群以蓝点表示（16,003个）。Kaluza§雷达图通过ROR-1、CD5、CD43、CD81、CD79b和CD20的多元视角确定了布尔设门策略。数据由Navios流式细胞仪分析全血样品获得。DuraClone RE PC管2,660,000个CD45+细胞数据分析示例。异常浆细胞群以红点表示（52个，0.003% CD45+），正常浆细胞群以绿点表示（30个）。Kaluza§雷达图通过全部8个参数CD45、CD38、CD138、CD19、CD56、CD200、CD81和CD27的多元视角确定了布尔设门策略。数据由Navios流式细胞仪分析全血样品获得。DuraClone RE ALB管1,228,000个CD45+细胞数据分析示例。异常浆细胞群以红点表示（132个，0.011% CD45+），正常B细胞群以绿点表示（39，898个）。结合采用CD58、CD34、CD10、CD38、CD20分析异常细胞。数据由Navios流式细胞仪分析全血样品获得。*以上产品仅用于科研，不用于临床诊断。

2019年11月26日，刊登在Nature communication上的研究报告指出，一种与T淋巴细胞结合的抗体衍生物，重新定向T淋巴细胞以溶解肿瘤细胞。T细胞的免疫疗法正在改变当前癌症治疗的前景。但是，缺乏合适的靶抗原，将这些策略限制在极少的肿瘤类型上。在这里，本文报道了一种T细胞结合抗体衍生物，该衍生物分为两个互补的半部分，并针对抗原组合而不是单个分子。现在，每半个部分都是半抗体，包含与抗CD3抗体的可变轻链(VL)或可变重链(VH)融合的抗原特异性单链可变片段(scFv)。当两个半抗体同时在单个细胞上结合各自的抗原时，它们会对齐并重组原始CD3结合位点以与T 细胞结合。本文表明，通过这种方法，T淋巴细胞可专门消除双重抗原阳性细胞，同时保留单个阳性癌旁细胞。这使不适合当前免疫疗法的精确靶向治疗成为可能。抗癌单克隆抗体代表了现代药物治疗中增长最快的领域之一。在临床前和临床研究中目前列出的数百种治疗性抗体和抗体衍生物中，有一些脱颖而出，其重点是将细胞毒性T淋巴细胞重新靶向恶性细胞。其中，最先进的是将嵌合抗原受体(CARs)转染到T细胞和双特异性T细胞结合抗体(BiTE)，两者均使用单特异性单链可变片段(scFv)作为靶向装置。总的来说，这些抗体衍生物所针对的靶分子是存在于恶性细胞及其未转化的对应物上的分化抗原，它们的结合常常引起严重的，甚至致命的不良事件。由于适用于基于抗体疗法的真正的肿瘤特异性抗原很少见，因此本文在这里研究一种组合方法，该方法可以解决由某些类型的白血病或淋巴瘤，实体癌和其他来源的癌干细胞异常表达的抗原组合。此外，鉴于结合T细胞疗法的临床有效性，本文以双重抗原限制的方式重定向T淋巴细胞以裂解肿瘤细胞。半抗体消除体内已建立的肿瘤为了测试半抗体的潜在治疗适用性，对免疫缺陷的NOD/SCIDγ(NSG)小鼠进行了体内免疫接种。在第1天接种萤光素酶基因标记的THP-1肿瘤细胞。在第1、22和28天，尾静脉接种HLA-A2阴性的CD4和CD8供体T淋巴细胞。在第7天植入肿瘤细胞后，每天皮下分别注射：盐水、单个半抗体、两个半抗体的组合及这是双特异性T细胞结合抗体(BiTE)对照。直到第39天。为了研究半抗体是否可以相互发现以实现靶标功能互补，将构建体彼此分开注射在较远的位置，一个在颈部，另一个在后肢上。尽管所有接受盐水或单个半抗体的小鼠疾病发展迅速，并在53天内达到了安乐死的标准，但用两个半抗体对或BiTE对照治疗的小鼠却排斥了已建立的肿瘤（下图a）。接受半抗体对或BiTE对照的小鼠的总生存期显著延长。上图：体内高精度靶向癌细胞a.通过IVIS Lumina XR实时生物发光成像，每周评估一次荧光素酶基因标记的THP-1肿瘤细胞的生长b.每天监测生存期，直到第110天半体技术的组合性质为特异性治疗开辟了新的领域。它可能选择性消除不适合当前免疫疗法的人类癌症，并且与旨在增强对靶标亲和力的其他双重或三重抗原特异性策略大不相同。尚不清楚半抗体是否会诱导细胞因子释放综合征，这是双特异性T细胞结合抗体(BiTEs)或针对抗原（例如CD19）的CAR-T细胞的主要缺陷。在这种情况下，甚至用半抗体处理单个靶分子也是合理的，以便将T细胞活化专门限制在肿瘤部位，同时减少血管内T细胞活化和全身细胞因子分泌。 综上所述，本文研究的半体技术将成为用于组合高精度免疫靶向以消除恶性细胞及其他恶性肿瘤的通用平台。

自然杀伤细胞（Natural Killer, NK）是先天淋巴细胞的亚群之一，但缺少抗原特异性。NK细胞的效应功能和靶细胞的识别是由对NK细胞表面受体的激活和抑制来平衡调节的，这些表面受体可以区分“自身”抗原、“改变的自身”抗原和“缺失的或非自身”抗原，因此，在消灭异常细胞的同时，可以避免攻击正常的细胞。1-3（图1）图1 – NK细胞识别自身/缺失的/非自身抗原细胞示意图NK细胞在抗肿瘤和抗病毒反应中起关键作用4-6。目前，各种转化研究和临床试验正在利用NK细胞独特的信号通路及其强大的抗肿瘤活性，通过多种手段比如CAR-NK细胞，来治疗血液和实体肿瘤。6研究显示，NK细胞表达的NK细胞受体和其他标记物种类繁多，因此，高参数流式细胞术对于全面的NK细胞表型分析是很有必要的。考虑到越来越多的NK细胞研究需求，Cytek推出了一款 16色 （18标记）NK 细胞免疫分型试剂，该试剂可在3激光以上配置的Cytek® 全光谱流式细胞分析系统上使用，仅需一管样本，研究者即可方便快捷的对人NK细胞免疫表型进行全面深入的分析。（图2）图2- Cytek® 16色人NK细胞免疫分型试剂Cytek® 16色人NK细胞免疫分型方案可识别和表征三种主要的人类NK细胞亚群：早期NK细胞（CD16- CD56bright），成熟NK细胞（CD16+CD56dim）和晚期NK细胞（CD16+CD56-），并支持对这三种NK细胞亚群的成熟和激活状态、迁移潜力、以及NK细胞表面的激活和抑制受体的表达进行分析。此外，该方案还可分析更多NK亚群，如CD226-CD56dim NK细胞，及CD57+CD56dimCD16+ NK细胞7-11。（图3）图3- 不同状态下的NK细胞示意图Cytek® 16色 NK 细胞免疫分型方案是一款预优化的试剂组合产品，避免了耗时的、耗费劳动力的、且昂贵的方案设计与优化。该方案详细的试剂组成请参考下表1。同时，方案经过系列测试，证实可以很好兼容人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）样本和EDTA采集管收集的血液样本。表1：Cytek® 16色NK细胞免疫分型方案（P/N R7-40011）的组成。方案可添加ViaDye&trade Red Fixable Viability Dye Kit (P/N R7-60008)作为死活染料。Cytek® 16色 NK 细胞免疫分型方案识别NK细胞及其激活状态的数据分析设门策略如下图4所示，依次进行单细胞门和非红细胞（non-RBC）设门后，通过进行谱系（CD14、CD19、CD123）阴性、CD3-、淋巴细胞、及HLA-DR-CD127- 系列设门，识别出NK细胞。利用CD56和CD16绘制二维点图，以确定三种主要的NK细胞亚群：早期NK细胞（CD16- CD56bright），成熟NK细胞（CD16+CD56dim）和晚期NK细胞（CD16+CD56-）。在代表总NK细胞群的密度图中，显示了各个NK细胞标记 vs. CD56，以及CD159a vs. CD159c 的表达情况。（图4）图4- 使用Cytek® 16色NK细胞免疫分型方案数据分析设门策略。数据来自于EDTA管收集的健康供者的全血样本。Cytek 还提供以下工具来进一步优化您的实验室工作流程，提高工作效率： &bull 完整的样品制备、染色和获取操作流程 &bull 实验及分析模板参考文献：Arachchige, A.S.P.M. (2021) Human NK cells: From development to effector functions. Innate Immunity 27(3): 212-229.Sivori, S., et al. (2019) Human NK cells: surface receptors, inhibitory checkpoints, and translational applications. Cellular & Molecular Immunology 16: 430-441.Kumar, V., McNerney, M. A new self: MHC-class-I-independent Natural-killer-cell self-tolerance. Nat Rev Immunol 5, 363–374 (2005). https://doi.org/10.1038/nri1603Bjö rkströ m, N.K., et al. (2022) Natural killer cells in antiviral immunity. Nature Reviews Immunology 22: 112-123. Cooper, M.A., et al. (2001) The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol. 22(11): 633-640.Ghaedrahmati, F., et al. (2023) Targeting immune checkpoints: how to use natural killer cells for fighting against solid tumors. Cancer Commun. 43(2): 177-213Stannard, K.A., et al. (2019) Human peripheral blood DNAM-1neg NK cells are a terminally differentiated subset with limited effector functions. Blood Adv. 3(11): 1681-1694.Lopez-Vergès, S., et al. (2010) CD57 defines a functionally distinct population of mature NK cells in the human CD56dimCD16+ NK cell subset. Blood 116(19): 3865-3874.Martinet, L.A., et al. (2015) DNAM-1 expression marks an alternative program of NK cell maturation. Cell Rep. 11: 85-97.Kurioka, A., et al. (2018) CD161 Defines a functionally distinct subset of pro-inflammatory natural killer cells. Front. Immunol. 9: 486Bjö rkströ m, Niklas K., Hans-Gustaf Ljunggren, and Johan K. Sandberg. "CD56 negative NK cells: origin, function, and role in chronic viral disease." Trends in immunology 31.11 (2010): 401-406.

近日，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心发文，建议将肺外结核纳入结核病防治规划管理。肺外结核常累及多系统和多器官，病变部位分布广，临床表现复杂多样，隐蔽性强，无特异性；且样本获取困难或获取的样本含菌量少，相关实验室诊断技术较落后，不能为其快速诊断提供有效方法。这使得其早期诊断较为困难，误诊率和漏诊率较高。而淋巴结结核在肺外结核中占比最大，如何进行早期精准诊断已成为临床亟需解决的问题。一、我国淋巴结结核的流行现状淋巴结结核是结核分支杆菌侵入淋巴系统导致的淋巴结增大或坏死性炎症，好发于儿童和青壮年，女性患者明显多于男性。在肺外结核中，淋巴结结核是最常见的类型，占所有结核病的4.0％－5.1％，占肺外结核的20.3％－50.0％［1］。肺结核可与肺外结核并发，据我国的一项多中心研究显示，肺结核并发肺外结核的患者中，颈部淋巴结核并发率为1.93%，仅次于结核性脑膜炎的2.72%［2］。男性肺结核患者并发颈部淋巴结核的并发率为1.44%，低于女性［3］。儿童最常见的肺外结核依次为淋巴结核、结核性脑膜炎、支气管结核［4］。二、淋巴结结核的临床表现及危害淋巴结核一般既往有结核病史或者结核接触史，早期典型的临床表现极少，影像学缺乏特异性，多由于淋巴结肿大形成无痛包块而被发现，包块可自行消散，可继续肿大发展为干酪样病变甚至形成脓肿、破溃或窦道，严重者会出现全身中毒症状。不仅造成患者形象上的改变，还会引起疼痛、活动受限、感染灶迁延等并发症，给患者的生理和心理都带来严重不良影响。三、淋巴结结核常用的实验室诊断方法目前，淋巴结结核实验室诊断方法主要有抗酸杆菌涂片镜检、分离培养、免疫学检测、分子生物学检测和质谱检测[包括微生物质谱、液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)和核酸质谱(MALDI-TOF)]等。细菌学检查是结核病诊断的“金标准”。通常情况下，淋巴结结核取其分泌物进行检测，涂片染色受分泌物质量的影响较大，而且难以取得，其灵敏度低，特异性差；细菌培养周期长，阳性率低，漏诊概率大，导致淋巴结结核的细菌学确诊异常困难［5］。随着分子生物学技术的发展，分枝杆菌的病原学诊断得到长足的发展。PCR作为一种简便、高效的基因扩增技术，已成为结核病分子生物学诊断最有力的工具，被广泛使用。但经大量临床验证，PCR的检测结果有很多不确定因素，存在一定程度的假阳性和假阴性，故目前仍不能取代现有的其他实验室检查手段。近年来，免疫学检测技术的研发也成为热点之一，γ-干扰素释放试验（IGRAs）已得到广泛应用。该方法通过采集患者外周静脉血进行检测，对刺激后产生分泌γ-干扰素的外周血单个核细胞进行定量检测，通过数量来判断患者是否感染了结核分枝杆菌，采样第二天出结果。有研究［6］显示IGRAs方法学的灵敏度在80%左右，特异性在75%-80%之间，在临床中会造成一定程度的漏诊和误诊，而且无法区分机体是新近感染还是潜伏感染或是活动性结核病，主要用于筛查结核分枝杆菌感染。因此，临床急需新的检测手段和方案帮助临床医生对淋巴结核进行精确的诊断。四、淋巴结结核的治疗及效果评估目前国内外对淋巴结核的治疗以内科保守抗痨治疗为主, 对久治不愈的进行外科手术治疗及术后抗痨，且抗痨联合手术治疗效果优于单纯抗痨治疗［7］。中药内服［8-9］、外敷［10］、局部用药［11］通过观察肿块大小、症状和副作用来判断治疗效果，高频超声［12］会监测包括结核结节大小、形态、内部回声、周边组织关系、血流分布情况、弹性成像分级等因素的变化。这些方法对患者的疗效评估具有重要指导作用，但均未涉及患者在治疗过程中体内结核菌的变化情况。五、迪澳双因子（IFN-γ和IL-2）联合检测 淋巴结结核诊断更优解决方案结核分枝杆菌特异性细胞因子检测试剂是“十三五”国家科技重大专项传染病防治专项成果转化产品，是目前国内首个获批的“双因子”联合检测试剂。该产品通过采集人外周血单个核细胞，与特异性抗原刺激共培养之后，检测结核特异性T细胞分泌的γ-干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）的浓度，来判断机体是否受到结核杆菌的感染。通过双因子检测，能够及时发现活动性淋巴结结核患者，同时对于非淋巴结结核患者能够进行及时、准确的排筛。其主要特点有： ○双阳结果高度警示活动性结核病通过双因子筛查，及时发现活动性结核患者，提高活动性淋巴结结核检出率，从而更好辅助临床医生制定治疗方案及防控措施。 ○菌阴结核病检出率高对于病原学检测结果为阴性，而临床又高度怀疑为结核的患者，使用双因子检测可以提高检出率的同时还可以提示活动性结核。 ○鉴别诊断特异性强淋巴结结核的临床症状通常不典型，且与其他炎症性疾病存在相同的病理细胞学特征和临床症状，“双因子”联合检测特异性更高，能够极大地提高筛查的准确性，减少漏诊误诊情况的发生。 ○能够为患者用药治疗的疗效评估提供更多的参考依据通过治疗过程中定期监测双因子，观察IFN-γ和IL-2的数值变化，为患者用药治疗效果的评价提供更多参考。【参考文献】[1] 王黎霞，成诗明，陈明亭，等. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志, 2012(08):485-508．[2] 杨松, 王乐乐, 李同心, 严晓峰, 唐神结. 肺外结核流行病学研究进展[J]. 中华流行病学杂志, 2021, 42(1): 171-176.[3] 李敬新, 庞学文, 张丹, 等. 2015-2017年天津市肺外结核流行病学分析[J]. 预防医学情报杂志, 2019, 35(4): 407-411.[4] 唐神结, 李亮, 高文, 等. 中国结核病年鉴(2019)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2020: 07.[5] 黄少君. 分子生物学诊断新方法在淋巴结结核诊断中的应用研究[D].北京, 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2016.[6] Wang L, Tian XD, et al. Evaluation of the performance of two tuberculosis interferon gamma release assays (IGRA-ELISA and T-SPOT.TB) for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Data Brief. 2018，21: 2492–2495[7] 李玥莹, 李群宝. 抗痨联合手术治疗淋巴结核的疗效分析[N]. 新疆医科大学学报, 2009(6).[8] 梅英, 黄金鹏. 小柴胡汤加减方治疗颈淋巴结结核的疗效观察[J]. 中国现代医生, 2019, 57( 27 ):128-130.[9] 张亮, 梅月志, 李坤, 戴宇彪. 结核灵联合西医常规治疗颈部淋巴结结核的疗效观察[J]. 罕少疾病杂志, 2019, 26(3 ):40-42.[10] 何益平,钟骏慧. 肿意膏外敷治疗颈淋巴结核400例临床观察[J]. 中国药业, 2017,26(22).[11] 万荣, 李明武 朱惠琼, 刘永莉. 抗结核药物超声导入治疗淋巴结结核的临床观察[J]. 云南医药, 2016,37(06).[12] 戴宇彪, 李坤, 梅月志. 高频超声在颈部淋巴结核疗效评估中的价值探讨[J]. 临床医学工程，2018,25 (5): 545-546.

近日，中国科学院上海营养与健康研究所研究员章海兵团队在Cell Death and Differentiation上在线发表题为Caspase-8 auto-cleavage regulates programmed cell death and collaborates with RIPK3/MLKL to prevent lymphopenia的研究成果。该研究揭示了细胞凋亡起始蛋白caspase-8的自我剪切抑制细胞程序性坏死并协同坏死关键蛋白RIPK3/MLKL抑制淋巴细胞减少的免疫缺陷性疾病的发生。 　　细胞程序性坏死（Necroptosis）是一种由激酶RIPK1/RIPK3的级联磷酸化调控的促炎细胞死亡形式。细胞程序性坏死通过MLKL蛋白聚合在膜上打孔裂解细胞膜，执行细胞死亡并释放损伤相关分子模式（DAMPs）触发炎症反应。已知细胞程序性坏死参与调控系统性炎症反应综合征（SIRS）、系统性红斑狼疮及自身免疫性的淋巴增生综合征（ALPS）等多种疾病。因此，对于细胞程序性坏死机制及其生物学意义的研究对于相关疾病的防治具有重要意义。　　Caspase-8是天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，最初被鉴定为细胞凋亡途径的起始蛋白。近几年的研究表明，caspase-8通过剪切RIPK1来抑制细胞程序性坏死。除此之外，caspase-8还参与细胞免疫稳态调控。临床上Caspase-8基因突变的病人会出现免疫缺陷疾病，并伴有免疫系统紊乱，表现为多器官的免疫细胞浸润并出现肉芽肿。研究发现Caspase-8通过其催化活性发挥功能，并且caspase-8的完全激活需要进行自我剪切。因此，探究caspase-8的自我剪切在调控免疫稳态中的作用机制，对于深入了解caspase-8的作用机制及相关临床疾病的治疗具有重要意义。　　该研究中，研究人员首先发现在细胞程序性坏死刺激条件下，caspase-8的自我剪切出现诱导性增强，因此推断caspase-8的自我剪切可能参与程序性坏死的调控。通过构建caspase-8自我剪切突变小鼠（Casp8ΔE385/ΔE385）发现，该小鼠可以抵抗细胞凋亡诱导的急性肝损伤，但高度敏感于程序性坏死诱导的全身炎症反应综合征（SIRS），该结果在动物水平证明caspase-8自我剪切可以促进细胞凋亡并抑制程序性坏死。同时，研究人员进一步通过分离原代细胞实验证明caspase-8自我剪切负调控死亡复合体II的形成和稳定，从而抑制细胞程序性坏死的发生。此外，研究人员发现Casp8ΔE385/ΔE385小鼠患有轻微的脾脏肿大及CD8+T淋巴细胞减少性疾病（T cell lymphopenia）。在Casp8ΔE385/ΔE385小鼠中同时敲除坏死关键蛋白RIPK3/MLKL时，Casp8ΔE385/ΔE385Ripk3-/-和Casp8ΔE385/ΔE385Mlkl-/-小鼠出现更为严重的脾脏肿大及淋巴结肿大，其脾脏、淋巴结、外周血以及骨髓中的B细胞和T细胞及其各亚群均出现明显减少，鉴定为淋巴细胞减少的免疫缺陷性疾病（lymphopenia）。研究人员通过减少Casp8ΔE385/ΔE385Ripk3-/-和Casp8ΔE385/ΔE385Mlkl-/-小鼠中另一坏死调控蛋白RIPK1的表达剂量可以逆转上述表型，证明RIPK1在调控淋巴细胞减少疾病中的剂量调控效应。　　该研究发现caspase-8通过自我剪切破坏死亡复合体II的稳定性，进而抑制细胞程序性坏死的发生。同时证明了caspase-8通过自我剪切协同坏死调控蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL抑制淋巴细胞减少的免疫缺陷性疾病的发生，为免疫系统稳态调控的研究及淋巴细胞减少为特征的免疫缺陷性疾病的治疗提供新思路。　　论文链接

肿瘤异质性对癌症预后和治疗反应有显著影响。传统的基因组和转录组分析被广泛用于研究不同的癌症类型，在预测预后和对不同治疗的反应以及为癌症治疗提供靶点方面具有潜在作用。不同癌症类型的单细胞分析表明，肿瘤免疫微环境的详细信息在多种癌症类型之间共享。目前，自从发现检查点抑制剂以来，免疫治疗彻底改变了癌症治疗并引起了越来越多的关注。肿瘤免疫微环境由非细胞成分(血管、细胞外基质、信号分子等)和细胞成分(T细胞、髓细胞、成纤维细胞等)组成。尽管传统的基因组和转录组学分析，也强调免疫相关途径和计算方法，并已应用于预测免疫细胞成分，但技术限制阻碍了时间的精确表征。传统的批量基因组和转录组分析获得的信号均来自不同细胞，掩盖了特定细胞类型和状态的识别。原位杂交和免疫组织化学已被用于探索单个细胞的基因组、转录组和蛋白质组学特征，但其产量相对较低。流式细胞术能够分析数千或数百万个单细胞蛋白质组学图谱；然而，这些方法需要事先选择感兴趣的抗体。随着细胞分离和测序技术的突破，单细胞转录组测序已经能够在单次运行中在单细胞水平上对许多细胞进行无偏好的全基因组分析。单细胞转录组测序已被用于分析单个细胞的转录组学，用于解析细胞间的异质性。肿瘤免疫微环境在诊断、治疗和预测不同类型癌症的预后方面显示出了潜力。与传统方法相比，scRNA-seq可用于识别新的细胞类型和相应的细胞状态，加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。1.介绍了scRNA-seq的原理，并比较了不同的测序方法。2.根据肿瘤免疫微环境中新的细胞类型、持续的过渡状态以及肿瘤免疫微环境成分之间的相互通讯网络找到了癌症的预后预测和治疗的潜在靶点。3.总结出在肿瘤免疫微环境中应用scRNA-seq后发现的由癌症相关成纤维细胞、T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞组成的新型细胞簇。4.提出了肿瘤相关巨噬细胞和耗尽的T细胞的发生机制，以及中断这一过程的可能靶点。5.对肿瘤免疫微环境中细胞相互作用的干预治疗进行了总结。几十年来，肿瘤免疫微环境中的细胞成分定量分析已被应用于临床实践，预测患者生存率和治疗反应，并有望在癌症的精确治疗中发挥重要作用。总结目前的研究结果，我们认为单细胞技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以导致发现癌症治疗的新观点，并应用于临床。最后，作者提出了肿瘤免疫微环境研究领域的一些未来方向，并认为通过scRNA-seq对这些方向进行辅助。相关会议预告：8.30召开，点击报名scRNA-seq在刻画肿瘤免疫微环境中的应用scRNA-seq技术进展scRNA-seq程序主要包括单细胞的分离和提取、cDNA合成、核酸扩增、测序和数据分析。与传统的批量测序相比，scRNA-seq单个细胞中的RNA量相对较少。因此，需要更有效的扩增方法。研究人员已经成功建立了稳定的单细胞文库构建过程，以产生足够的cDNA用于测序。单细胞分离和捕获是scRNA-seq在不同方法中的基本程序。目前单细胞分离和捕获的常用方法。这些程序分为四大类：激光捕获微切割、油滴包裹技术、流式细胞荧光分选技术和微流控微孔技术。scRNA-seq技术的未来发展可能会降低成本并增加细胞产量，使scRNA-seq成为研究单个细胞转录组的标准工具。肿瘤免疫微环境的细胞成分肿瘤免疫微环境的细胞成分包括淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)、成纤维细胞和其他免疫细胞。成纤维细胞传统上被归类为基质细胞，因为它们在构建细胞外基质中发挥着重要作用。在这里，作者将肿瘤免疫微环境的癌相关成纤维细胞包括在内，因为它们分泌丰富的促炎和抗炎因子来重塑免疫微环境。细胞毒性CD8+T细胞识别肿瘤细胞上的特异性抗原并随后消除它们，是免疫微环境最常见和最有效的免疫细胞。CD8+T细胞的细胞毒性功能依赖于CD4+T Th1细胞。其他CD4+T细胞，包括Th2细胞和Th17细胞，也促进肿瘤微环境中的免疫反应。调节性T细胞抑制肿瘤免疫微环境并加剧肿瘤进展。自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞也参与其中。它们的受体识别肿瘤细胞，从而激活其他免疫细胞。作为先天免疫的重要组成部分，骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞，在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。巨噬细胞通常分为促炎M1和抗炎M2表型。肿瘤相关巨噬细胞主要由M2巨噬细胞组成，通过产生生长因子和细胞因子促进肿瘤生长、肿瘤存活和血管生成。DC对于T细胞的抗原呈递至关重要，连接先天免疫和适应性免疫。癌症相关成纤维细胞在肿瘤免疫微环境中维持增殖和分泌调节因子，可分为炎症性CAF和肌纤维母细胞CAF。炎症性CAF具有较高的细胞因子和趋化因子分泌，而肌纤维母细胞CAF高度表达收缩蛋白，成纤维细胞对免疫微环境起相互抑制作用。研究表明，成纤维细胞募集M2巨噬细胞和调节性T细胞，抑制肿瘤微环境中的免疫反应。肿瘤相关成纤维细胞也被发现在某些情况下会支持抗肿瘤免疫。除了分泌抗体，B细胞还通过产生与T细胞相互作用的细胞因子参与细胞免疫。研究表明，B细胞抑制细胞毒性T细胞并诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞。B细胞也是最近引入的三级淋巴结构的重要组成部分，富含B细胞的三级淋巴结构与各种肿瘤的生存和免疫治疗反应有关。先前的研究强调了细胞成分在时间中的重要作用。然而，免疫细胞的鉴定常基于有限的细胞标记，并借助免疫组织化学。个体免疫细胞的转录组图谱是探索不同免疫细胞及其相应功能所必需的。为了理解细胞进化过程及其决定因素，有必要应用scRNA-seq观察每个细胞的转录动态。利用scRNA-seq探索免疫微环境的新发现聚类和注释对于解释scRNA-seq数据探索至关重要。根据细胞相似性对数据进行划分，挑战在于在不提供先验知识的情况下估计固有的簇数或密度。可能的解决方案是采用分层聚类方法来揭示细胞的分层结构，这也与细胞本体相一致。给定聚类方法产生的数据划分结果，需要细胞类型注释来提供生物学意义。注释的主要挑战是确定每个聚类中存在多少细胞类型，以及是否存在当前未发现的细胞类型。在实践中，研究人员通常首先识别每个聚类的标记基因，然后根据专业知识和文献对其进行注释。scRNA-seq使研究人员能够以更高的分辨率将免疫细胞分类为具有不同功能的亚群，描述了免疫细胞的常规亚型。利用scRNA-seq发现的淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和成纤维细胞的组成(图2)。人和小鼠样本的scRNA-seq表明，成纤维细胞可分为抗原呈递CAFs、癌症相关成纤维细胞或肌成纤维细胞。抗原提呈CAFs独特地表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因，包括激活CD4+T细胞的CD74。在结直肠癌中也观察到类似的抗原提呈CAFs亚群。乳腺癌症基因工程小鼠模型中成纤维细胞的scRNA-seq进一步鉴定了血管CAF、基质CAF、发育CAF和循环CAF。血管CAF、基质CAF和发育CAF似乎起源于固有成纤维细胞和恶性细胞发生上皮-间充质转化时的血管周围位置。循环CAF是血管CAF群体中增殖的部分。在其他小鼠模型中也发现了血管CAF和基质CAF，它们在患者乳腺肿瘤样本中是保守的，并且发现它们会增加乳腺癌症细胞的转移。提高CAF的分辨率为开发精确靶向CAF的药物提供了生物标志物。另一项关于乳腺癌症的scRNA-seq研究将调节性T细胞分为五类：共表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的调节性T细胞、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，以及相互或仅表达相同基因的GITR和其他调节性T细胞，它们具有不同的功能。不同预后的患者具有不同比例的调节性T细胞簇，为个性化治疗提供了靶点。免疫微环境对T细胞和髓细胞进行了更详细的泛癌研究，发现存在颗粒酶K+T细胞、干扰素刺激基因+T细胞、杀伤细胞免疫球蛋白样受体在记忆性T细胞和NK细胞上表达、转录因子7+CD8+T细胞，ficolin 1+常规DC2、分泌性磷酸蛋白1+TAM，以及肿瘤微环境中的叶酸受体β+TAMs。基于scRNA-seq数据，免疫微环境还发现了新的免疫细胞亚群。葡萄膜黑色素瘤的scRNA-seq鉴定了以前未识别的细胞类型，包括主要表达检查点标记LAG3而不是程序性死亡-1或CTLA-4的CD8+T细胞。同时，在肝细胞癌中发现浸润耗尽的CD8+T细胞和具有高表达layilin的记忆T细胞的克隆富集，这些研究为癌症免疫治疗提供了新的靶点。因为CD8+T细胞是参与消除恶性细胞的主要成分。大肠癌CXC基序趋化因子的scRNA-seq鉴定配体BHLHE40+Th1样细胞与干扰素-γ调节转录因子BHLHE40。在不稳定肿瘤中，这些细胞对免疫检查点阻断有良好的反应，可能会提高免疫疗法的疗效。树突状细胞对于呈递抗原以激活肿瘤免疫微环境中的T细胞是必不可少的。胃癌的scRNA-seq揭示了一个新的树突状细胞簇，表达吲哚胺2,3-双加氧酶1和趋化因子C–C基序趋化因子配体(CCL)22、CCL17、CCL19和白细胞介素-32，它们参与T细胞的募集。胰腺导管腺癌的scRNA-seq还鉴定了除了常规细胞标记物之外还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶1的树突状细胞簇。吲哚胺2,3-双加氧酶1对于催化色氨酸消耗和犬尿氨酸产生、抑制T细胞增殖和细胞毒性至关重要，这揭示了树突状细胞和T细胞之间的密切相互作用。此外，通过scRNA-seq鉴定了溶酶体相关膜蛋白3+树突状细胞，并且似乎是经典树突状细胞族的成熟形式。溶酶体相关膜蛋白3+DC可以迁移到淋巴结，并高度表达与T细胞相互作用的配体。这些表达特异性标记物的新型树突状细胞簇的发现为癌症免疫治疗提供了一个新的视角。使用scRNA-seq在肺腺癌中发现了肿瘤相关巨噬细胞的新特征基因，包括髓系细胞触发受体2、CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体和载脂蛋白E。此外，乳腺癌症的scRNA-seq表明，除了M2型基因如CD163、跨膜4域A6A和转化生长因子β1外，血管生成因子纤溶酶原激活剂、尿激酶受体和IL-8也在肿瘤相关巨噬细胞中表达。肿瘤相关巨噬细胞中这些新的基因特征图谱与患者生存相关，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。肿瘤样本scRNA-seq显示，一个肿瘤相关巨噬细胞亚群呈现出SPP1、巨噬细胞清除剂受体MARCO和MHC II类基因的高表达。MARCO和SPP1是巨噬细胞激活中的抗炎和免疫抑制信号，而MHC II类基因与促炎功能有关。其他scRNA-seq研究表明，肿瘤相关巨噬细胞经常同时具有促炎和抗炎特征。这一现象表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与传统的M1/M2极化不一致。图2：利用scRNA-seq揭示免疫微环境中的新的免疫亚群单细胞数据揭示免疫细胞进化大多数免疫细胞都处于细胞发育过程中。大量的免疫细胞处于发育轨迹的瞬态状态，而不是分化良好的细胞的离散状态。借助scRNA-seq和深入分析，研究人员可以探索分化细胞的特征、特定细胞类型的转变及其可能的机制。最常用的计算方法是拟时序分析。轨迹描述了细胞的发育过程，其特征是基因表达的级联变化。分支点代表细胞分化的显著差异。各种机器学习计算方法已被用于构建轨迹，包括Monocle3、DTFLOW、DPT、SCORPIUS和TSCAN，这些方法已在单独的综述中进行了评估和比较。由于肿瘤相关巨噬细胞和T细胞代表了免疫微环境中最丰富的免疫细胞类型，这里主要关注这两种细胞类型。scRNA-seq显示，TAMs经常共表达M1基因，包括TNF-α和M2基因，如IL-10，并且肿瘤相关巨噬细胞的分化和状态与其抗肿瘤作用直接相关。拟时序轨迹分析证实，肿瘤相关巨噬细胞在M1和M2表型之间连续转换。转录因子IRF2、IRF7、IRF9、STAT2和IRF8似乎在决定TAMs分化中很重要，并可作为表观遗传学靶点诱导肿瘤相关巨噬细胞的M1极化，从而产生促炎和抗肿瘤的微环境。使用环境刺激和抗原T细胞受体(TCR)刺激测定T细胞表型。不同状态的细胞之间TCR库的重叠，即TCR共享，也可用于研究T细胞的进化。结合scRNA-seq和TCR追踪在结直肠癌中发现20个具有不同功能的T细胞亚群。在黑色素瘤肿瘤的耗竭T细胞中发现了28个基因的耗竭特征，包括TIGIT、TNFRSF9/4-1BB和CD27，并且在大多数肿瘤的高耗竭细胞中也被发现上调。另一项关于T细胞的研究进一步鉴定了CD8+T细胞中的其他耗竭标记物，如LAYN、普列可底物蛋白同源物样结构域家族A成员1和突触体相关蛋白47。拟时序轨迹分析表明，T细胞在时间上处于连续激活和终末分化(衰竭)状态(图3)。已经进行了额外的研究来研究耗尽的T细胞的进化和逆转T细胞耗尽的潜在靶点。scRNA-seq与TCR分析相结合表明，功能失调的衰竭T细胞和细胞毒性T细胞可能在时间上与发育有关。因此，研究集中在CD8+T细胞从效应细胞到衰竭T细胞的过渡过程。scRNA-seq鉴定出两个CD8+T细胞簇为非小细胞肺癌中预先耗尽的T细胞。在肺腺癌中，预先耗尽与耗尽的T细胞比率与更好的预后相关。因此，在耗尽前中断预先耗尽的T细胞可能对癌症免疫治疗至关重要。由于免疫细胞和恶性细胞之间的密切相互作用，恶性细胞的进化在免疫细胞进化中也起着至关重要的作用。拟时序轨迹分析表明，转移性肺腺癌的轨迹分支不同于向纤毛细胞和肺泡型细胞的正常分化。受恶性细胞进化的影响，正常的骨髓细胞群体被单核细胞衍生的巨噬细胞和新型树突状细胞取代。T细胞也被发现会衰竭，从而构建免疫抑制的肿瘤微环境。同样，另一项研究表明甲状腺癌症细胞来源于乳头状甲状腺癌症细胞亚簇，其中构建了不同的肿瘤免疫微环境，导致预后显著恶化。图3：肿瘤相关T细胞和巨噬细胞的进化过程免疫微环境中不同细胞间的通讯网络免疫微环境上的细胞通讯与肿瘤进展有关。配体-受体相互作用是一种重要的细胞通讯类型，对于构建免疫微环境和识别潜在的治疗靶点至关重要。scRNA-seq是在细胞基础上进行的，这使得研究未发现的细胞相互作用变得可行。已经开发了许多基于scRNA-seq数据研究配体-受体相互作用的分析工具，包括iTALK、CellTalker和CellPhoneDB。这些工具利用了已知配体-受体对相互作用的数据库。其中，CellTalker利用差异表达的基因，而CellPhoneDB包括配体和受体的亚基结构。其他工具，如NicheNet，也考虑了受体细胞下游通路的变化。在肿瘤进展过程中，恶性细胞导致免疫细胞的募集和功能障碍，从而相互影响肿瘤的发生和恶性细胞的进化，形成恶性循环(图4)。发现TAMs通过表皮生长因子受体-双调节蛋白配体受体对与恶性细胞相互作用。在基底样乳腺癌细胞系中AREG的调节导致抗炎TAMs的招募。同时，基于scRNA-seq，发现了一种EGFR相关的反馈回路可促进胰腺腺鳞癌的进展。来源于TAMs的抑瘤素M也与其在恶性细胞上的受体相互作用，以激活信号转导子和转录激活子3。研究人员通过整合素受体与胶原蛋白、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白1配体和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-R-反应蛋白3的相互作用，发现CAF与胃癌细胞之间的通信，这些配体调节干细胞。此外，胰腺导管腺癌的scRNA-seq揭示了TIGIT与T细胞和NK细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体2之间的相互作用，以及它们在恶性细胞中的相应配体PVR和LGALS9，导致免疫细胞功能障碍和胰腺癌症进展。因此，基于单细胞数据探索免疫细胞和恶性细胞之间的细胞相互作用提供了可能治疗靶点，以打破肿瘤进展的恶性循环。除了恶性细胞外，scRNA-seq和随后的分析还预测了免疫细胞之间在时间上的相互作用，这表现出相反的功能(图3)。例如，研究发现TAM降低了CXCL12-C-X-C基序趋化因子受体3和CXCL12-CXCR4的相互作用，增强了鼻咽癌细胞毒性T细胞和Tregs之间的CD86-CTLA-4相互作用，导致肿瘤免疫微环境加重癌症进展。此外，CAFs通过分泌CXCL12募集Tregs，并通过periostin与M2巨噬细胞相关。图4：免疫微环境中的细胞通讯网络基于scRNA-seq的肿瘤免疫微环境的临床应用和潜在靶点几十年来，临床实践中一直采用时间的量化来预测患者的生存率和对治疗的反应。利用免疫组化分析的免疫评分，量化肿瘤中的原位免疫细胞浸润。与传统的免疫评分相比，scRNA-seq在免疫微环境上提供了前所未有的渗透免疫细胞分辨率。已经鉴定出与预后相关的新的免疫细胞簇。例如，在早期复发的肝细胞癌中发现了一种独特的低细胞毒性先天性样CD8+T细胞表型。这些T细胞过表达KLRB1，同时下调共刺激和耗竭相关分子，包括肿瘤坏死因子受体超家族、成员9、CD28、诱导型T细胞共刺激因子、TIGIT、CTLA-4和HAVCR2。这种T细胞簇的浸润与癌症的不良预后相关。此外，基于scRNA-seq的细胞相互作用也被计算在预测模型中。基于细胞间通讯相关基因构建了机器学习模型，以预测肺腺癌的复发。将八个细胞间通讯相关基因和患者的临床信息相结合，获得了0.841的受试者-操作者特征曲线下面积。除了预后预测外，肿瘤免疫微环境中独特的细胞相互作用也与免疫疗法的反应有关。scRNA-seq分析发现，抗PD-1治疗的应答者和非应答者之间存在不同的细胞-细胞通信网络，有可能预测患者对抗PD-1疗法的反应。因此，在scRNA-seq的帮助下，可以更准确地预测患者的预后和对免疫疗法的反应。利用scRNA-seq在精准医学中具有启发性，例如帮助靶向治疗克服耐药性。例如，医生在使用替比法尼治疗的非CR肌肉浸润性膀胱癌症患者治疗前后应用患者衍生异种移植物的scRNA-seq。在治疗后的PDX中发现PD-L1的上调，并降低了免疫细胞的抗肿瘤作用。因此，选择了用PD-L1抑制剂进行额外治疗。随后，患者获得了良好的反应。此外，在单药耐药性肿瘤中，通过scRNA-seq鉴定了新的免疫亚型。用抗集落刺激因子1受体阻断TAMs不能减少胆管癌的肿瘤进展。scRNAs-eq鉴定了表达APOE的粒细胞髓系衍生抑制细胞的补偿富集，其介导T细胞抑制。TAMs和粒细胞性骨髓源性抑制细胞的双重抑制与抗CSF1R和抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G治疗联合增强了小鼠的免疫检查点阻断效果小鼠模型，这在临床实践中很有前景。除了治疗耐药肿瘤外，scRNA-seq在免疫微环境上的应用也突出了需要进一步研究的潜在新靶点。T细胞是免疫微环境中去除恶性细胞最重要的免疫细胞。然而，在不同的肿瘤中，耗尽的CD8+T细胞会导致不利的预后。除了众所周知的免疫抑制检查点外，scRNA-seq还鉴定了高表达内皮前体蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1和内皮素受体B型的耗尽CD8+T细胞，这些细胞可以作为新的潜在靶点。髓细胞是免疫微环境招募免疫细胞所必需的。通过scRNA-seq鉴定TREM2/APOE/补体组分1，q亚组分阳性巨噬细胞浸润为透明细胞肾癌复发的预后生物标志物。另一项研究证实，小鼠中靶向TREM2的抗体与缺乏MRC1+和CX3CR1+巨噬细胞以及表达免疫刺激分子的髓系簇的扩增有关，这促进了T细胞反应并导致更好的预后。细胞相互作用也可以用作治疗靶点。肝内胆管癌的scRNA-seq揭示了血管CAFs与肝内胆管细胞之间的串扰。血管CAFs分泌的IL-6诱导Cajal间质细胞细胞的表观遗传学改变，从而增强恶性肿瘤。因此，IL-6信号在Cajal间质细胞的中断变得非常有趣。表1总结了scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点。表1：scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点总结scRNA-seq可以绘制全面的肿瘤免疫微环境细胞图谱，为各种肿瘤的临床应用提供了新的视角。此外，免疫微环境的细胞成分和通讯为癌症治疗提供了潜在靶点，并有助于精确医学的发展。技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以发现癌症治疗的新观点，助力临床研究。作为突破性的新技术，单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，可以代替或补充分子、细胞和组织病理检测的现有技术，也可以用于新兴的细胞治疗。

CAR-T细胞免疫治疗技术自2017年10月，美国政府批准第二种基于改造患者自身免疫细胞的疗法以来，在治疗癌症方面效果显著。CAR-T治疗全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T技术已经出现了很多年，基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。CAR-T治疗的机理，我们进行简单的介绍。人体内有一系列的细胞，构成了人体内免疫系统，包括产生抗体的B细胞，吞噬异物的巨噬细胞，直接杀灭有害病毒或有害细胞的T细胞等，其中T细胞，也叫T淋巴细胞。T细胞如同一支守护健康的卫队在人体内巡逻，遇到对人体健康不利的病毒，细胞等就会进行消灭和清除。癌细胞有着很好的伪装能力，伪装成人体正常细胞。T细胞会将这些癌症细胞认为是人体自身健康细胞，并不对齐其进行攻击。科学家从病人体内取出一定数量的T细胞，对T细胞的抗原受体进行修饰，经过修饰的T细胞，能够识别特定的癌细胞。科学家对经过修饰的T细胞，在体外通过仪器设备进行扩大培养。大量培养经过修饰后的T细胞，再注入病人体内。注入病人体内的经过修饰和扩大培养的T细胞，相当于给人体提供了一支可以识别并杀死癌细胞的T细胞军队。这些强化后的T细胞卫队在体内巡逻，癌症细胞的伪装在这些强化后的T细胞面前失去作用。T细胞会像杀死普通入侵异物一样，将癌症细胞杀死并清除，从而达到治愈癌症的疗效。INFORS的细胞培养专用摇床、细胞生物反应器，WIGGENS二氧化碳振荡培养箱，广泛用于CAR-T细胞免疫治疗领域。在业内获得了客户极高的评价，为医疗健康领域做出了应有贡献。 INFORS的细胞培养专用摇床WIGGENS二氧化碳振荡培养箱

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其变异株Omicron由于高传播率目前已取代其它毒株成为全球新冠的主要流行毒株。各国已采取大规模疫苗接种，通过其产生的中和抗体和抗病毒T细胞来缓解和对抗新冠肺炎。有研究报道，病毒特异性T细胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗体滴度减弱的COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞会持续很长时间。因此需要充分了解新冠肺炎中T细胞免疫过程，对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。COVID-19患者中的T细胞免疫反应T细胞免疫反应是高度特异性的，在引发有效的抗病毒反应方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，树突状细胞(DC)和巨噬细胞可以吞噬病毒感染的细胞，通过抗原呈递启动T细胞反应。随后，CD4+T细胞刺激B细胞产生病毒特异性抗体，细胞毒性CD8+T细胞靶向病毒感染的细胞。有研究报道，SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞在COVID-19症状发作后的前2周内的外周血中很明显。大多数SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞表现出中枢记忆表型，主要产生Th1细胞因子，而CD8+T细胞具有更高水平的穿孔素表达的效应表型。另外有研究报道COVID-19患者T细胞活化的异质性，并提供证据表明CD4+和CD8+T细胞都能够产生有效的免疫反应，并出现受损或过度的T细胞反应。轻度COVID-19患者的T细胞升高，产生强大的抗病毒免疫反应。特别是CD8+T细胞表达更高水平的细胞毒性分子，例如颗粒酶A和FAS配体，它们有利于消除病毒感染的细胞。然而，在严重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，细胞毒性T细胞）比例减少，同时幼稚和中枢记忆CD8+T细胞的百分比也均较低。此外，与健康对照组相比，COVID-19患者的终末分化效应CD4+和CD8+T细胞的百分比更高。且重症COVID-19患者的调节性T细胞(Tregs)水平低于轻症患者。总之，T细胞亚群（包括Treg、Th1、幼稚和记忆T细胞）平衡中的这些失调可能导致严重的炎症状况，并可能导致COVID-19复发。尽管由CD4+和CD8+T细胞介导的早期抗病毒反应最有可能具有保护作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T细胞难以通过限制I型和III型干扰素反应来产生有效的抗病毒反应。COVID-19恢复期患者和健康人中的T细胞免疫反应恢复康复患者的T细胞计数可以为T细胞在抗病毒反应中的作用提供重要参考。有研究报道，超过70%的COVID-19恢复期患者存在SARS-CoV-2特异性T细胞。100% CD4+T细胞和70% CD8+T细胞在康复患者中具有SARS-CoV-2 Spike特异性反应。功能测定证实CD4+T细胞表现为Th1表型并产生大量IFN-γ，和针对S蛋白较低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同样，大多数SARS-CoV-2刺突特异性CD8+T细胞产生IFN-γ，绝大多数IFN-γ+CD8+T细胞也共表达颗粒酶B和肿瘤坏死因子α (TNFα)。这些数据表明，康复患者中的大多数CD4+和CD8+T细胞产生了针对S蛋白的大量抗病毒免疫反应，说明功能性T细胞在病毒清除和恢复中的重要性。此外，这些数据也说明利用SARS-CoV-2的S蛋白作为疫苗生产关键候选者的重要性。T细胞反应在无症状和未接触过的个体中观察到的T细胞反应最低。但是即使没有并发的体液反应，无症状/轻度恢复期的COVID-19患者也可以产生强大而持久的记忆T细胞反应来预防复发性感染。有研究报道，与有症状的个体相比，无症状患者的免疫反应较弱，并且相当一部分有症状的患者在恢复期早期表现出中和抗体量减少。COVID-19恢复期患者在出院后2周内也显示出与针对人ACE2的中和抗体滴度和病毒特异性T细胞计数的强相关性。细胞因子风暴细胞因子风暴是指在各种病理条件下检测到的大量促炎细胞因子和趋化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中观察到的关键病理特征之一。在重症COVID-19患者中记录到高细胞因子水平。各种免疫细胞类型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、DC，以及NK、B和T细胞，可导致COVID-19患者的细胞因子风暴和炎症反应的过度激活状态。由先天免疫细胞释放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者发生细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动力之一，其中一些可能是导致这些患者淋巴细胞减少或Th1反应不足的潜在机制之一。另据报道，在COVID-19重症病例中，血清TNFα和IL-6水平升高与总T细胞计数呈负相关，表明这些细胞因子可能参与淋巴细胞减少和T细胞丢失。相反，处于恢复期的患者上述细胞因子的血清水平显著降低，并显示T细胞计数恢复。鉴于这些发现，有人提出IL-6阻滞剂，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受体阻滞剂用于治疗重症COVID-19患者以解决过度炎症和控制炎症的传播。趋化因子和细胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板衍生生长因子亚基B（PDGFB），促进其它白细胞向组织的募集，导致组织损伤。基于T细胞反应的疫苗研究SARS-CoV-2完整基因组的快速可用性可用于开发多种疫苗，使其在刺激幼稚T细胞后产生效应和记忆T细胞，发挥免疫保护。成功的SARS-CoV-2疫苗应该产生对有效免疫反应具有高度特异性的SARS-CoV-2反应性T细胞，而不会产生炎症或疾病开始的不良影响。SARS-CoV-2的蛋白被确定为最适合疫苗开发的靶标，以触发病毒特异性T细胞反应和体液免疫反应。表达S蛋白的腺病毒病毒载体疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康个体(NCT04313127)中检测其疫苗的安全性和耐受性，观察到2周后成功产生特异性抗病毒T细胞和体液免疫反应。Moderna开发了基于mRNA的疫苗，编码SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通过脂质体递送系统给药。因mRNA疫苗可以模拟天然病毒感染，并仅编码抗原蛋白并且不能整合到宿主染色体中。因此，基于mRNA的疫苗更能发挥细胞免疫和体液免疫。T细胞免疫检测---细胞因子释放检测（CRA）疫苗中的抗体测试是常规进行的，但因为特异性病原体的T细胞在血液中存在的总T细胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在从全血中纯化的细胞中进行。而这些检测都需要复杂的设备和高度专业化的人员，这可能不是每个常规实验室都可以使用的。杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队采用了一种快速和简单的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定(Cytokine release assay, CRA)实验：直接将刺激性抗原或肽添加到全血中，导致血浆中细胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后进行定量。该检测方法通过简单地将Spike肽库添加到全血中，可以轻松快速地检测和相对定量接种疫苗个体中的Spike特异性T细胞反应。此方法检测时间比常规方法缩减了7个小时，总时间缩短了12个小时。总结因T细胞免疫反应在疾病的早期阶段表现出保护作用，也可能导致致命症的发生，因此COVID-19的治疗和预防中需要深入地了解疾病过程中的免疫反应。特别是在症状轻微的患者中阻断促炎细胞因子的早期治疗干预可能会产生有害影响，并导致免疫反应不足和病毒清除受损。在危重COVID-19患者中恢复T细胞耗竭和改善过度炎症反应的晚期治疗干预可能具有更好的临床结果。在疫苗开发中，也要充分考虑其是否可以增强抗病毒免疫和特定T细胞反应从而加强疫苗保护的持久性。参考文献Robust T Cell Immunity in ConvalescentIndividuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.Rapid determination of the wide dynamicrange of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated andnaturally infected.T cell immunity to SARS-CoV-2 followingnatural infection and vaccination.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

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文章来源：中华检验医学杂志, 2022,45(8) : 790-801作者：中国中西医结合学会检验医学专业委员会摘要嵌合抗原受体（CAR）-T细胞免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域一个举世瞩目的重大成果。流式细胞术（FCM）在CAR-T细胞免疫治疗相关检验的每一个步骤中都起到非常重要的作用，包括靶点筛查、CAR-T细胞产品成分鉴定、毒性预估、微小残留病（MRD）检测、免疫功能评价、免疫微环境研究等。为了深刻认识FCM在CAR-T细胞免疫治疗这一新兴领域的作用，规范每一项应用中的操作，进一步促进其在CAR-T细胞免疫治疗中的应用，中国中西医结合学会检验医学专业委员会制定了此专家共识。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域一个举世瞩目的重大成果［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］，尤其是CD19-CAR-T细胞免疫治疗难治复发B细胞急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）获得了90%左右的缓解率［1, 2, 3］，单独使用或者桥接异基因造血干细胞移植均极大程度地提高了患者的完全缓解率和生存率；CAR-T细胞免疫治疗其他类型白血病、淋巴瘤、骨髓瘤以及实体瘤也在不断探索并取得巨大进步［4, 5, 6, 7］。流式细胞术（flow cytometry，FCM）在CAR-T细胞免疫治疗相关检验的每个步骤中都起到非常重要的作用 ［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］。作为一项免疫治疗，CAR-T细胞免疫治疗相关检验中涉及的FCM与临床常规不同，体现在靶点评估需要精确设门并且同时关注正常细胞的表达，CAR-T细胞免疫治疗后微小残留病（minimal/measurable residual disease，MRD）需要考虑靶点丢失以及输入的CAR-T细胞影响，而CAR表达细胞比例和数量的检测以及免疫相关检测均缺乏规范化，给临床工作带来不确定性等。为了能使更多相关领域的科研、临床和实验室检测人员认识FCM在CAR-T细胞免疫治疗中的作用和注意事项，规范在每项检验中的实验方案和技术操作，进一步促进其在CAR-T细胞免疫治疗中的应用，中国中西医结合学会检验医学专业委员会组织专家结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。适用范围、术语和定义一、适用范围各类医疗机构临床实验室、商业化实验室和科研单位在使用FCM进行CAR-T细胞免疫治疗相关临床检验时，均可采用或参照使用本专家共识。鉴于CAR-T细胞生产过程中的创新性和复杂性，并且该步骤极少在临床诊断实验室中进行，本共识不涉及此研发过程。二、术语和定义1.多参数流式细胞术（multiparametric flow cytometry，MFC）：虽然MFC的术语出现于20世纪80年代，当初指代两色以上FCM，后期对此也没有明确定义，但是现在普遍建议采用三激光八色或者以上机型。2.CAR-T细胞免疫治疗：人体免疫细胞（来自自体或异体均可），在体外经过基因修饰后具备了特异性识别和杀伤表达特定抗原的肿瘤细胞的能力，输入患者体内以实现清除肿瘤细胞或者其他病态细胞的免疫治疗方法［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］。CAR-T细胞免疫治疗技术包括几个步骤：（1）从患者或者供者血液中分离出自体或者异体T淋巴细胞；（2）用CAR编码的病毒载体进行体外修饰、培养；（3）最后输入患者体内。近年来为了增强治疗效果降低副作用，已发展到第4代CAR-T细胞免疫治疗技术。3.细胞因子：细胞因子是由多种免疫细胞分泌的一类小分子蛋白质，具有介导和调节免疫过程等作用。目前已经发现的人类细胞因子有200多种。根据结构和功能一般可分为白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、集落刺激因子、趋化因子和生长因子等。4.细胞因子释放综合征：细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）是一种发生在任何免疫治疗后，由于内源性或者输注的T细胞和/或其他免疫效应细胞活化或者聚集导致的超生理反应。症状多样，但是必须包括初发时发热，可能伴有低血压、毛细管渗漏（低氧）和终末器官衰竭。尽管没有将细胞因子检测纳入定义，而CRS分级也主要是根据临床表现，但是鼓励进行C反应蛋白、细胞因子、铁蛋白等相关检测，便于为将来的研究提供依据［8］。5.趋化因子及其配体：趋化因子是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，其配体很多是免疫功能检测中区分淋巴细胞亚群的重要标志物，例如半胱氨酸-半胱氨酸基序趋化因子受体（cysteine-cysteine motif chemokine receptor，CCR）系列，半胱氨酸-氨基酸-半胱氨酸基序趋化因子受体（cysteine-X-cysteine motif chemokine receptor，CXCR）系列［9］。6.抗原表达率：精确设门后，特定细胞上抗原表达的百分比。临床工作中由于受到抗体和荧光素选择、抗原抗体结合过程、温度光照和放置时间导致荧光信号改变、仪器设置、设门精确度、个体差异、细胞异质性、对照细胞群、检测目的等多种因素影响，以诊断为目标的临床实验室，一般由流式操作人员排除各种影响因素后，按照表达、部分表达、不表达进行定性描述［10］，以方便临床和实验室对目的细胞群进行简单直观的性质判断。7.抗原表达强度：与某种抗原分子在细胞上表达量的多少有关，FCM的直观体现为荧光强度。根据抗原表达强度将阳性细胞表达分为强表达（bright，bri）、中等强度表达、弱表达（dim）和异质性表达［10］，可能会随着治疗和疾病或者活化状态发生改变。8.单链可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）：构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒载体或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。CAR基因正常表达时，形成跨膜的CAR结构，细胞外域的重链可变区和轻链可变区通过15~20个氨基酸短肽连接而成的部分即为scFv。编码的scFv元件既是CAR-T细胞识别肿瘤抗原的重要成分，也可作为FCM评价CAR表达情况的检测靶点之一。9.同型阴性对照：用于检测抗体与细胞表面可结晶段受体非特异性结合导致背景信号的阴性对照。应该用与检测抗体相同标记、同种属来源、相同亚型、相同浓度的免疫球蛋白进行染色，如果是间接标记抗体，还需要做二抗的荧光素背景对照，其作用是设置仪器条件，消除背景染色。对于正常标本中不存在的未知标志或者与阴性细胞界限不清的标志，或者标本中比例极低需要精确检测的标志，同型阴性对照是普遍采用的对照。CAR-T细胞免疫治疗相关检验中的FCM项目CAR-T细胞的生产研发、临床治疗每个环节都与FCM检测密不可分，包括靶点筛查、患者选择、CAR-T细胞成分鉴定、毒性预估、MRD检测、回输物和患者标本免疫功能评价、免疫微环境和复发机制研究等。鉴于CAR-T细胞治疗这一全新领域集合了肿瘤细胞和正常细胞免疫表型、肿瘤干细胞免疫表型、免疫细胞亚群、细胞因子检测、CAR-T细胞检测、因部分病例靶点丢失甚至系别转变导致需要调整方案的FCM MRD检测、肿瘤异质性和免疫微环境检测等（表1），以及CAR-T细胞治疗设计的多样性和复杂性、临床工作中使用不同靶点或者联合靶点CAR-T细胞治疗、使用其他细胞因子或者信号分子靶向药物控制副作用等，这些都对FCM检测提出更高的要求。因此深入了解每个环节需要使用的标本类型、检测方案以及最低检测要求，将有助于进一步规范检测流程，提高检测水平，保证检测质量。FCM在CAR-T细胞免疫治疗靶点筛查中的应用随着CAR-T细胞治疗技术的不断完善，CAR-T细胞的功能和治疗的安全性都有了很大提升，并有CAR-自然杀伤（natural killer，NK）细胞、双特异性靶点CAR-T细胞等类似靶向细胞免疫治疗产品出现。但是作为特异性免疫治疗，胞外抗原识别区的设计，尤其是有效靶点的选择始终是每一种CAR-T细胞治疗相关产品的关键环节。理想的靶点应该满足下述要求：高覆盖率（某种疾病的群体中，肿瘤细胞表达该抗原的患者比例高）、高表达率（阳性个体中几乎所有肿瘤细胞都表达）、高表达强度（在肿瘤细胞表面抗原分子数量多，表现为同一种荧光标记时，荧光强度高）、高特异性（在正常细胞中不表达或者少表达，对患者不会造成严重影响）［11］。FCM作为一项快速、简便、直观、定性定量的技术，是目前实现这一目的的重要检测手段，而CAR-T细胞治疗靶点的选择虽然都是在免疫分型或者MRD的基础上进行，但是比常规临床诊断有更严格的特殊注意事项［12, 13］。共识2：为了尽可能给CAR-T细胞免疫治疗提供客观评价，建议一项研究或治疗过程中尽量采用相同的方案，至少是关键抗体和组合相似的方案。同一患者的随访监测尽量在同一台仪器上进行，且尽量仪器条件（包括补偿）相同，或者进行仪器间条件比对。推荐强度：建议执行。）专家组成员（按姓名字母顺序排列

p style=" text-indent: 2em " 据《自然· 通讯》杂志发表的一项概念验证研究，英国弗朗西斯· 克里克研究所和伦敦大学学院的科学家利用人类干细胞和生物工程支架，重建了人类免疫系统中的重要器官——胸腺，该项研究朝着构建可用于移植的人工胸腺迈出了重要一步。 /p p style=" text-indent: 2em " 胸腺是一个胸部器官，在免疫系统中起着至关重要作用的T淋巴细胞成熟于此。如果胸腺无法正常工作或无法在子宫内胎儿发育期间形成，则可能导致疾病，例如人体无法抵抗传染病或癌细胞的严重免疫缺陷疾病，或是免疫系统错误攻击患者健康组织的自身免疫疾病。 /p p style=" text-indent: 2em " 在新研究中，科学家们使用了在手术期间必须切除的患者器官的干细胞来重建胸腺。当被移植到小鼠体内时，经过生物工程改造的胸腺能够支持成熟的功能性人类T淋巴细胞的发育。这是科学家首次成功地重建完整人类胸腺。 /p p style=" text-indent: 2em " 为了重建该器官，研究人员从患者那里收集了胸腺，并在实验室中将捐赠组织的胸腺上皮细胞和胸腺间质细胞培养成数十亿个细胞的菌落。为获得胸腺的结构支架以便于用培养的胸腺细胞重新组装，研究人员开发了一种从小鼠胸腺中去除所有细胞仅保留结构支架的新方法。 /p p style=" text-indent: 2em " 研究人员给器官支架注入了多达600万个实验室培养的人类胸腺上皮细胞以及间质细胞。细胞生长在支架上，仅5天后，器官已发展到与9周大的胎儿相似的阶段。最后，研究人员将这些胸腺植入小鼠体内。他们发现，超过75％的胸腺能够支持人类淋巴细胞的发育。 /p p style=" text-indent: 2em " 研究人员表示，胸腺移植后常常导致免疫系统排斥移植体。通过移植从器官供体的胸腺中提取的细胞生长出的胸腺，或许能克服这一问题，从而消除患者在余生中服用免疫抑制剂的需求。 /p p br/ /p

近日，国家药监局药审中心发布了《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》，原文如下：为指导我国免疫细胞治疗产品研发，提供可参考的技术标准，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心组织制定了《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》（见附件）。根据《国家药监局综合司关于印发药品技术指导原则发布程序的通知》（药监综药管〔2020〕9号）要求，经国家药品监督管理局审核同意，现予发布。 特此通告。 国家药品监督管理局药品审评中心 2021年2月9日免疫细胞治疗是什么？免疫细胞治疗是利用患者自身或供者来源的免疫细胞，经过体外培养扩增、活化或基因修饰、基因编辑等操作，再回输到患者体内，激发或增强机体的免疫功能，从而达到控制疾病的治疗方法，包括过继性细胞治疗（ adoptive cellular therapy， ACT），治疗性疫苗等。根据作用机制的不同，目前的细胞免疫治疗研究类型主要包括：肿瘤浸润淋巴细胞（ tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）、嵌合抗原受体 T 细胞（ chimeric antigen receptor modified T cells， CAR-T）以及工程化 T 细胞受体修饰的 T 细胞（ T-cell receptor-engineered T cells，TCR-T）等，此外，还存在基于自然杀伤细胞（ natural killer cells，NK）或树突状细胞（ dendritic cells， DC）等其它免疫细胞的治疗方法，如细胞因子诱导的杀伤细胞（ cytokine-induced killer cells, CIK）等 。中国细胞治疗产品的研发和注册申报数量明显增加2017 年，原国家食品药品监督管理总局发布《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》，对细胞治疗产品按照药品管理相关法规进行研发时的技术要求进行了总体阐述。该指导原则发布以来，我国细胞治疗产品的研发和注册申报数量明显增加，特别是免疫细胞治疗产品。 当免疫细胞治疗产品进入临床试验时，应遵循《药物临床试验质量管理规范》（ GCP）、国际人用药品注册技术协调会（ ICH） E6 等一般性原则要求。同时，免疫细胞治疗产品的细胞来源、类型、体外操作等方面异质性较大，治疗原理和体内作用等相较传统药物更加复杂。为了获得预期治疗效果，免疫细胞治疗产品可能需要通过特定的操作措施、给药方法或联合治疗策略来进行给药。严谨科学的临床试验对保障受试者安全、产生可靠的临床试验数据至关重要，鉴于免疫细胞治疗产品特殊的生物学特性，在临床试验研究中，需要采取不同于其他药物的临床试验整体策略。因此，在上述指导原则的框架下，有必要进一步细化免疫细胞治疗产品开展临床试验的技术建议，以便为药品研发注册申请人（以下简称申请人）及开展药物临床试验的研究者（以下简称研究者）提供更具针对性的建议和指南。完整目录如下：附件可下载查阅《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》.pdf

文章来源：中华检验医学杂志, 2023,46(08)：792-801.作者：国家医学检验临床医学研究中心（中国医科大学附属第一医院） 中华医学会检验医学分会 国家卫生健康委临床检验中心 中华检验医学杂志编委会摘要流式细胞术在临床血液及免疫相关疾病的精准诊治中具有重要作用。随着流式细胞仪普及程度的不断提高，临床实验室开展流式细胞术检测，服务临床诊疗的能力和水平也逐渐提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和需求，加强质量控制，结合近年来国内外相关领域研究进展，对2013年发表的《流式细胞术的临床应用共识》进行更新，制定此共识。随着医学的进步及疾病精准化诊治需求的增加，我国临床实验室流式细胞仪的普及水平得到提高，开展流式细胞术检测服务临床诊疗的能力和水平亦不断提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和临床检验需求的更新，我们延续2013年《流式细胞术临床应用的建议》［ 1 ］的编写初衷，并在此前版本的基础上，经专家组讨论，适时对相应内容进行修订和扩增。本共识由国家医学检验临床医学研究中心、中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委临床检验中心及中华检验医学杂志编委会组织专家进行讨论撰写并发布。一、流式细胞仪及器材的准备（一）流式细胞仪的选择2017年12月，我国颁布《流式细胞仪》国家行业标准［ 2 ］，规定了流式细胞仪的产品分类、技术要求、试验方法及使用方法等。在临床检验工作中，应选择有临床注册证的流式细胞仪，满足检测灵敏度和收集速率等的要求；根据检测项目所需参数，确定适宜激光器和检测器，使其检测参数与临床使用的荧光抗体匹配；考虑操作的简便性和兼容性，以及未来可升级满足新检测需求的空间；兼顾临床实验室场地、仪器维护、人员培训、试剂和耗材供应稳定性、售后服务等因素。（二）流式细胞仪的设置1.仪器质控：流式细胞仪的仪器性能与检测结果准确与否密切相关。为保证仪器运转正常，每日开机流程后应运行仪器的质控微球等，保证仪器处于最佳性能状态，变异系数小于仪器软件中的可接受范围。如有可接受范围外的偏离，应及时进行校准和维修。2.仪器维护：（1）环境温湿度可影响激光器、光纤和棱镜等光学元件，使用时可参考仪器说明书推荐的温湿度，推荐室温18~25 ℃；（2）灰尘可损伤激光器和光学元件，降低检测的灵敏度，日常工作中注意仪器的整洁，清洁频率依据环境而定；（3）使用1%的次氯酸或75%医用乙醇每日清洁进样针，宜定期（或按需）清洁流动室，避免黏性大和聚集成团的细胞堵塞进样针；（4）过滤器影响荧光信号的稳定性和压缩空气的供应，在需要时排除气泡并定期更换；（5）鞘液桶、废液桶需维持密闭性，定期清洁和更换；（6）电脑数据定期备份，存储数据不超过硬盘的一定容量，避免损坏和拖慢系统性能；（7）定期对仪器性能进行全面评估、校准和保养，并应出具书面报告。3.补偿设置：传统的多色流式细胞仪存在荧光溢漏，合适的补偿是获得可靠数据的关键［ 3 , 4 , 5 ］。（1）补偿对照可以使用新鲜血细胞制品（更贴近待检测细胞）和商品化的荧光微球（操作简便）。使用荧光微球建立的补偿，宜用待检细胞进行优化；（2）如流式细胞仪具备“自动补偿”功能，可采用自动补偿进行条件设置并进一步手动优化；（3）同一通道检测的相似荧光，建立补偿时不能互相替代，如PE-Cy5、PerCP、PerCP-Cy5.5等，应分别建立补偿；（4）补偿设置的染色处理过程宜与待测项目一致，细胞膜染色和经过固定、破膜的胞浆（或胞核）染色会有不同，建议分别设置补偿；（5）补偿矩阵并非永久适用，当建立新的实验或仪器性能出现允许范围外的变化，应重新建立补偿。（三）移液器、离心机、标本前处理系统等的维护及定期校准上述仪器除日常清洁维护，应按照实验室认可标准（例如ISO15189）的相关要求，定期对不同量程的移液器、离心机和标本前处理系统的性能进行全面评估和校准，并出具书面报告。共识1 临床检测选用的流式细胞仪应有国家有关机构核发的注册证。建议根据临床实验室及流式细胞术检测项目的特点，选择技术性能符合使用要求的流式细胞仪，宜同时考虑相关技术培训及售后服务等。流式细胞仪的使用应注意每次检测过程中的仪器质量控制，应按要求进行维护保养和校准评估。流式细胞术检测相关的器材也应注意日常清洁维护和定期校准评估。推荐强度：强烈建议。二、流式细胞术检测试剂（一）荧光抗体的选择和搭配流式细胞术使用的抗体应符合国家相关标准［ 6 ］。在搭配多色抗体组合时需要考虑［ 5 ］：（1）流式细胞仪的检测通道特性：根据流式细胞仪的配置，选择可使用的荧光抗体；（2）荧光染料本身的强弱、荧光标记物的稳定性、荧光素分子大小、荧光抗体克隆号等，例如同一荧光标记物，不同克隆号抗体对某些抗原的检测效果也会出现差异［ 7 , 8 ］；（3）待测抗原表达强弱：弱表达抗原选择强荧光标记，强表达抗原可选择弱荧光标记；（4）尽量避免光谱重叠多的荧光染料搭配如PE-Cy5和APC等，对细胞共表达的抗原进行染色时，尽量避免选用串色和荧光溢漏大的通道［ 5 ］。（二）抗体的滴定设置通过抗体滴定计算染色指数（stain index，SI），判断荧光染色后阴性群和阳性群的分离效果，是确定最佳抗体使用浓度的重要方法。SI计算公式为：［中位荧光强度（median fluorescent intensity，MdFI）阳性群-MdFI阴性群］/（2× rSD阴性群）［ 5 ］。SI受荧光强度、抗原表达强度、抗体结合力及流式细胞仪设置等影响［ 5 ］。在更换抗体或抗体批号之前，宜进行抗体滴定以确定最佳浓度，避免因抗体浓度不合适，导致弱表达抗原检测不到或强抗原超出检测限。（三）对照的设置和选择选择适宜的对照是流式细胞术检测中正确获取和分析数据的基础［ 5 ］。“荧光减一”（fully stained minus one fluorochrome或fluorescence minus one，FMO）对照是目前确定阴性和阳性细胞群cutoff值的最佳对照，对于弱阳性或阳性细胞比较少的情况尤为适用，可排除交叉干扰等；同型对照可评估Fc受体或蛋白的交叉反应，排除非特异性染色。生物品对照如血液制品质控，可根据制品的cutoff值来确定检测样品的阴阳性。（四）其他试剂红细胞裂解是流式细胞术检测血液白细胞或骨髓有核细胞时不可或缺的过程［ 9 , 10 ］，宜选择相应品牌的裂解液或自行配制。由于裂解液可对粒细胞和单核细胞等造成不同的影响，也会影响染色的效果［ 9 , 10 ］，建议根据检测目的不同进行比对，择优选用。细胞的稀释、洗涤和重悬需使用缓冲液或稀释液［ 11 , 12 , 13 ］，宜依据反应的最适pH值（如中性）、副作用（如磷酸盐缓冲液会导致一些激酶反应的抑制）、可能的络合作用、对光谱的吸收以及成本等进行选择［ 13 ］。日常工作中可选用商品化的缓冲液或PBS，依据检测目的确定是否添加胎牛血清/牛血清白蛋白，以及是否加入叠氮化钠用于保存。此外，细胞培养基和医用生理盐水等也可用作稀释液和缓冲液。不同于细胞表面（细胞膜）的染色，对细胞内（细胞浆或细胞核）的分子进行染色，需要经过“固定”（如甲醛等），保持目标抗原的位点和结构，再通过“破膜”（如Triton-X）使抗体进入细胞。不同品牌破膜剂对细胞内染色有不同程度的影响，建议根据检测效果进行比对，择优选用［ 14 ］。共识2 流式细胞术检测中，建议合理选择和搭配所需荧光抗体，通过滴定确定抗体使用的最佳浓度，并合理选择和设置对照；染色过程中，选择适宜的红细胞裂解液、缓冲液以及固定破膜剂。推荐强度：强烈建议。 三、标本的采集、存储、运输及制备（一）外周血标本（1）患者准备：流式细胞术检测同其他项目外周血采集无异，因脂血等会对检测结果造成影响，采血前尽量清淡饮食；（2）抗凝剂选择：同时进行白细胞分类和流式细胞术检测时，建议使用乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝真空管进行标本采集，室温保存，尽快送检［ 15 ］。如进行T细胞功能的检测如IFN-γ分泌时，因EDTA可螯合钙离子，影响T细胞激活效果，建议采用肝素钠等抗凝。（二）其他标本骨髓标本、造血干细胞采集物的抗凝剂选择可以参照外周血。脑脊液标本一般不需要抗凝剂，渗出液性质的浆膜腔积液常有凝块，建议抗凝处理。因体液标本久置会导致细胞破裂，影响细胞计数、分类等检测结果，所以需要尽快送检。一般要求在采集后立即送检［ 16 ］，如使用特殊保存剂，可以适当延长送检时间［ 17 ］。样品应离心浓缩调整细胞浓度后进行染色。对于淋巴结等组织标本，一般不需要抗凝剂，活检取材后应尽快送检。标本可经过物理研磨法和酶消化法获得单细胞悬液，调整细胞浓度后进行细胞染色。体外培养的细胞（如胞内细胞因子染色时，需刺激后加入蛋白转运抑制剂），根据细胞储存状态（冻存与否）、细胞特性（贴壁或悬浮），进行复苏或消化、洗涤，调整细胞浓度后染色。（三）标本制备流式细胞术标本的制备，需考虑新鲜度和检测项目的要求。（1）细胞浓度：一般不建议超过1×106 cells/ml（参照试剂说明书）；（2）全血体积：一般建议50~400 μl［ 18 ］；（3）活细胞染料：常规新鲜外周血可以不使用活细胞染料，但造血干细胞计数、白血病微小残留病（minimal residual disease，MRD）筛选与监测等，建议添加活细胞染料如7-AAD等，以去除死细胞的干扰；（4）细胞染色、固定与破膜：需考虑细胞膜染色、细胞浆染色和细胞核染色的区别，选择相应适宜的固定破膜剂；（5）染色温度：一般室温染色即可［ 18 ］，但造血干细胞染色、使用某些固定破膜剂时，要求在融冰或4 ℃完成；一些特殊项目（如中性粒细胞吞噬二氢罗丹明辅助诊断慢性肉芽肿）需经过37 ℃孵育；（6）染色时间：受荧光抗体和染色体积影响，一般建议10~30 min［ 18 ］。根据目的抗原的位置分布不同（细胞膜、细胞浆和细胞核），染色时间不同，可依据说明书及检测需求，探索最优染色时间。另外，如染色体积在200 μl以上，可适当延长抗体孵育时间［ 18 ］。共识3 建议根据检测标本的种类及实验需求的差异，选择适宜的抗凝剂，采样后应尽快送检；样品制备时确保细胞浓度在合理的范围内，根据检测项目的特性，选择最优的染色方法和染色条件。推荐强度：建议执行。四、流式细胞术的临床应用（一）淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析是目前流式细胞术临床应用范围最广泛的项目，可获得淋巴细胞亚群，包括CD3+总T细胞、CD3+CD4+辅助T细胞（Th）、CD3+CD8+细胞毒性T细胞（Tc）、CD3-CD19+B淋巴细胞和CD3-（CD16+CD56）+NK细胞的相对百分比（%）和细胞绝对值（cells/μl），在临床诊治中发挥了重要作用。国家卫生健康委员会发布的《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》［ 19 ］（该行标处于修订过程中），以及《流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用共识（2019版）》［ 20 ］和《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》［ 21 ］等，对此项目的开展及应用具有重要的指导意义。（二）免疫细胞精细分型1.淋巴细胞：（1）T细胞：对T细胞的精细分型，根据细胞表面标记区分T细胞，如调节性T细胞（Treg）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、Th1、Th2、Th9、Th17和Th22［ 22 ］，初始（naive）、效应（effector）、效应记忆型（effector memory）和中央记忆型（central memory）亚群、活化细胞亚群等［ 22 , 23 , 24 , 25 ］。（2）B细胞：根据CD27、IgD、CD24、CD38、CD5等表达，可以将B细胞分为不同亚群［ 23 ， 26 , 27 , 28 , 29 ］。（3）NK细胞：根据CD16和CD56表达的不同，可以将NK细胞细分为不同亚群 ［ 23 ， 30 , 31 ］。目前精细分型的方案并未统一， 表1 汇总了文献报道的常见淋巴细胞精细分型方案，可供参考。2.髓系细胞：（1）粒细胞：根据CD45和SSC，CD13和CD16以及CD66、CD123、CD203c、HLA-DR等的表达不同，可以将粒细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞［ 23 ， 30 ］。（2）单核细胞：根据CD45和SSC，CD13、CD14和CD16的表达不同，可以将单核细胞分为不同亚群［ 23 ， 30 ］。（3）树突状细胞（dendritic cell，DC）：使用系列抗原（lineage：CD3、CD14、CD16、CD19和CD56）排除T细胞、B细胞、NK细胞、单核、粒细胞等，再根据CD123、HLA-DR、CD11c、CD1c、CD141等的不同表达，可以将DC细胞分为不同亚群 ［ 23 ， 30 ， 32 ］。（4）髓源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）：根据CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD33等指标的表达，可以将MDSC分为3个不同亚群 ［ 33 , 34 ］。 表1 汇总了文献报道的常见髓系细胞精细分型方案，可供参考。（三）白血病免疫表型分析及微小残留病监测1.白血病免疫表型分析：（1）急性白血病：对于急性白血病免疫分型，2013版《流式细胞术临床应用的建议》［ 1 ］及《四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（2015年版）》［ 35 ］均有详细介绍。在上述《建议》和《共识》中，对白血病免疫表型分析均主要推荐采取“2步法”，但对于某些跨系别表达的抗原或是混合表型的白血病，可能会因为检测抗原不足导致漏检的现象。国家卫生健康委发布的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗规范（2018年版）》［ 36 ］和《儿童急性早幼粒细胞白血病诊疗规范（2018年版）》［ 37 ］，对于急性白血病免疫分型，建议使用多色流式细胞仪，至少检测上述《诊疗规范》提及的35个CD分子，视情况增加更多抗原检测，同时检测的CD分子越多，准确性相对越高。（2）慢性淋巴细胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）/非霍奇金淋巴瘤：流式细胞术检测的抗原可以参考《流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识（2017版）》［ 38 ］。但是对于B淋巴细胞，由于慢淋/非霍奇金淋巴瘤的细胞可能来源于淋巴结的多个结构部位［如DLBCL分为生发中心型GCB型、非生发中心non-GCB型和活化B细胞样（ABC）型］，需注意其免疫表型的多样性［ 39 ］；对于T细胞，如出现异常免疫表型或TCRVβ的单克隆，需要与病毒感染等鉴别。（3）霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）：对于HL，因背景含有大量表型相对正常的淋巴细胞，寻找低比例的Reed-Sternberg细胞存在一定困难。Reed-Sternberg细胞在免疫表型上可以表现为CD45-CD30+CD15+CD71+CD40+CD95+CD3-CD19-等免疫学特征，需要与其他一些表达CD30+的肿瘤细胞进行鉴别［ 40 ］，多色流式细胞术在HL中具有一定的辅助诊断价值，HL最终诊断需要结合组织病理学。2.白血病微小残留病（MRD）监测：（1）急性白血病MRD监测：基于白血病相关免疫表型（leukemia-associated immunophenotype，LAIP，根据非白血病细胞的表达背景来定义）和/或细胞“异于正常（different from normal，DFN）”的表型，可以鉴定出异常的细胞群，进行MRD细胞监测［ 41 ］。急性白血病MRD监测可以参考已发表的中国专家共识［ 42 , 43 ］。（2）慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤MRD监测：典型的CLL免疫表型为CD19+CD5+CD23+CD22+CD200+CD43+CD79blow/-且CD10-FMC7-CD103-CD20lowsIgMlow［ 44 ］，可用于CLL诊断和MRD监测。上述表型可以通过固定的MRD组合进行监测，推荐方案包括CD5/CD19/CD20/CD38/CD81/CD22/CD79b/CD43等［ 44 , 45 ］，需注意美罗华（Rituximab，利妥昔单抗）治疗会使CD20出现假阴性，鉴于CD200在CLL和其他CD5+淋巴瘤如套细胞淋巴瘤中的作用，也可推荐CD200［ 46 ］和CD160［ 47 ］作为CLL的MRD监测指标。对于免疫表型不典型的淋巴瘤等进行MRD监测，需结合其初发时的免疫表型特征。淋巴瘤的分布具有异质性（如可能涉及外周血、骨髓、淋巴结、肝脏、脾脏等），当采样不同时，MRD监测结果可能也不一致。目前，骨髓是使用最广泛的MRD监测标本，但脾脏、肝脏和淋巴结中的MRD监测亦可在疾病复发中起重要作用［ 45 ］。（3）多发性骨髓瘤MRD监测：可参考已经发表的相关共识进行检测［ 42 ］。MRD监测需要获取足够的细胞数，确定检测的最低检出限（limit of detection，LOD）和最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ），推荐固定和规律的取样时间进行MRD监测 ［ 45 ］。（四）细胞因子检测通过流式细胞术检测细胞因子，主要包括2类方法：（1）基于流式微球阵列技术（Cytometric beads array，CBA），可检测血清、血浆或体液等标本中细胞因子水平。其原理为样品中细胞因子与细胞因子抗体预包被的微球及荧光标记检测抗体结合，形成“双抗体夹心”复合物。此方法使用标本量少，2个荧光检测通道可以同时检测多种细胞因子。（2）可检测激活后胞内细胞因子如IFN-γ等表达，用于评估免疫细胞的功能等。此方法需要新鲜肝素抗凝外周血或分离获得的外周血单个核细胞，使用刺激剂激活细胞，并用阻断剂阻断胞内蛋白质转运，使得刺激产生的细胞因子聚集在细胞内。细胞膜抗原染色后，再使用固定破膜剂固定及破膜对胞内细胞因子如IFN-γ等进行染色。共识6 流式细胞术检测的质量控制应贯穿始终，包括检验前的标本、试剂和仪器，检验中的染色、数据获取和数据分析，检验后的报告发放和结果解释，重视人员质控。推荐强度：强烈建议。

仪器信息网讯 4月16日，中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会2021年学术峰会在安徽池州隆重召开。学术峰会旨在促进标记免疫领域人才成长和科技成果转化，从而推动我国标记免疫分析产业快速健康发展。峰会首日，来自上海透景、深圳爱康、苏州翊曼、深圳普门、中元汇吉5家国内IVD企业发布了最新产品技术。第二天，峰会围绕检验医学基础研究转化、分析性能评估、免疫性疾病、流式细胞分析、慢病诊断新技术、肿瘤、感染、生殖检测等主题奉献了诸多精彩的大会主旨报告，吸引了全国近四百位来自医院、体外诊断企业专家、学者参会。中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会2021年学术峰会现场会议伊始首先进行了中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会第一次换届大会，由中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所所长李红梅和军事医学科学院生物工程研究所研究员叶棋浓担当主持。中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所所长李红梅和军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓主持池州市人民医院党委委员工会主席王细宏、中国分析测试协会常务副秘书长张渝英先后致贺词，预祝大会圆满成功。池州市人民医院党委委员工会主席 王细宏中国分析测试协会常务副秘书长 张渝英中国分析测试协会组织部主任尹碧桃宣读换届文件，宣读换届、选举事项，现场进行差额选举，从候选人中选举产生主任委员1人、秘书长1人、副主任委员14人。中国分析测试协会组织部主任 尹碧桃投票结果公布，解放军总医院研究员颜光涛连任第二届中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主任委员，北京地坛医院检验科主任王雅杰当选专委会秘书长，北京天坛医院实验诊断中心主任张国军等14位代表当选专委会副主任委员。第二届选举换届委员合影中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主任委员颜光涛致辞随后，大会进入主旨报告环节，8位报告嘉宾分别作精彩大会主旨报告。中国医学科学院肿瘤医院检验科主任崔巍重点介绍了多组学整合分析方法。多组学研究技术在早期恶性肿瘤的发现中起到重要作用，为基于液体活检技术恶性肿瘤的筛查和监测提供了更多的检测靶标。报告从基因组学、转录组学, 蛋白质组学和代谢组学切入，多组学整合分析方法的应用研究推动肿瘤检测技术从单参数模型向多参数系统模型的转变，并有望发现有价值的新的肿瘤生物标志物。中国医学科学院肿瘤医院检验科主任 崔巍报告题目：《基于多组学的液体活检技术用于肿瘤检测的应用前景》张国军主任在《浅谈医学检验学科发展的抓放管服？》的报告中分享了大医改背景下如何搭建学科发展平台。以天坛医院举例，分别从抓、放、管、服四大要素分享学科发展方法。实现学科管理之放，给年轻人更多发挥的空间。实现学科管理之管，管安全、管文化、管教育、管落实。实现学科管理之服，做到搭平台、创机会的服务，以集体利益为先的服从，让人发自内心的信服。北京天坛医院实验诊断中心主任 张国军报告题目：《浅谈医学检验学科发展的抓放管服？》在来势汹汹的新冠肺炎疫情中, 临床检测者作为疫情防控的“吹哨人”，在疫情防控中发挥重要作用。北京地坛医院检验科主任王雅杰在《新冠疫情对临床检验能力建设的导引作用探讨》的报告中重点以新冠肺炎为例，探讨新发突发传染病临床实验室检测需求，并讨论了新冠疫情对于检验医学发展的导引作用。北京地坛医院检验科主任 王雅杰报告题目：《新冠疫情对临床检验能力建设的导引作用探讨》肝素结合蛋白（HBP）作为一种急性时相蛋白，是评估脓毒症患者疾病严重程度的有效生物标志物，在脓毒性休克患者的早期诊断和疗效监测中更为重要。北京同仁医院检验科副主任刘向祎讲述了HBP在细菌感染标志物及感染严重程度的评估、脓毒症及器官功能障碍相关（预测、诊断、预后评估）、指导药物治疗中的临床应用。北京同仁医院检验科副主任 刘向祎报告题目： 《新的感染指标—肝素结合蛋白的临床应用》分子分类是未来肿瘤治疗的发展方向，上海市口腔医学研究生所长陈万涛从精准医疗背景下分子分类研究意义、头颈鳞癌分子分类现状、口腔鳞癌分子分类研究现状、组织样本和生物信息库等方面讲述了腔癌分子分类技术的研究进展，并对分类技术的未来进行了展望。上海市口腔医学研究生所长 陈万涛报告题目：《腔癌分子分类技术研究进展和展望》在临床检验中，阿尔兹海默症（AD）早期诊断相关标志物的研究非常有意义。北京医院主任技师赵昕在分享中探讨了AD患者血清中脂蛋白相关磷脂酶 A2（LpPLA2）、高敏 C-反应蛋白（hs-CRP）、补体成分 C1q（C1q）和血清同型半胱氨酸（HCY）的表达水平，为 AD 患者的实验室检测指标提供依据。北京医院主任技师 赵昕报告题目： 《阿尔茨海默病患者血清脂蛋白相关磷脂酶 A2、高敏 C-反应蛋白、补体成分 C1q 和血清同型半胱氨酸表达水平的 对照研究》人类生存史就是与微生物斗争的历史，近年来，多种新发传染病的流行，特别是新冠流行，让大家更加关注人类感染病原体后的差异表现，这种差异的产生与个体的免疫基础息息相关已经成为共识，如何评价免疫力成了个体防疫的重要基础。解放军总医院第三医学中心检验科主任杨晓莉一直致力于推广淋巴细胞技术在临床的应用，经过十余年的临床推广，率先在器官移植患者术后管理中进行了实线应用，科学指导了患者在免疫抑制药物管理。她在报告中分享了淋巴细胞技术经验，并号召同仁共同推广淋巴细胞亚群绝对计数在临床中的应用。解放军总医院第三医学中心检验科主任 杨晓莉报告题目：《淋巴细胞亚群绝对计数的临床应用》在监测人体健康方面，微芯片和纳米材料检测拥有高通量、低消耗、便携化等好处。蒋兴宇教授课题组唐立雪博士针对这一方面进行讲解，把液态金属和用弹性高分子的微芯片整合成柔性电子电路后，这些柔性电子电路可以在人体表面以及脏器表面贴附并发挥长期检测的的作用。例如，使用液态金属 - 弹性高分子微流控可以制备全柔性血氧传感器、全柔性的汗液检测装置以及薄到和纹身一样的检测器件。还可以用这些新材料制备具有长期检测血液中的生理与生化指标的电子血管。南方科技大学生物医学工程系 唐立雪博士报告题目：《人体内外表面的原位检测》中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会2021年学术峰会全体委员合影留念本次学术峰会精彩继续，敬请关注仪器信息网后续报道。

仪器信息网讯 第十九届北京分析测试学术报告会暨展览会（BCEIA2021）于2021年9月27-29日在北京中国国际展览中心（天竺新馆）盛大召开。作为BCEIA学术报告会的重要组成部分，9月29日，由中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主办的BCEIA 2021学术报告会标记免疫分析分会在学术会议区E301举行，会议为期一天，旨在推动标记免疫分析领域的发展，为国内外同行提供充分交流的平台，吸引逾百位学者与会。会议现场本次会议主席，也是中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会委员颜光涛研究员为会议致辞。颜光涛研究员本次会议主题为“创新融合，精准诊断”，围绕“精准诊断新检测技术、新检验指标临床验证转化、检验质量控制、检验参考物质及溯源”4个专题方向，邀请了10位国内标记免疫领域权威专家，针对前沿热点领域的研究重点进行学术报告。以下是部分精彩报告摘要：上下半场会议主持人 （左上：崔丽艳 北京大学第三医院 右上：敬华 战略支援部队特色医学中心检验科 左下：陈建魁 解放军总医院第五医学中心 右下：徐国宾 北京大学肿瘤医院）张国军 首都医科大学附属北京天坛医院报告题目：一种新型缺血性卒中标志物（ACS）化学发光法及开发临床评价为了建立自动化学发光免疫分析法(CLIA)测定人体液中凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的方法，探讨脑卒中患者血清ASC的临床意义，首都医科大学附属北京天坛医院张国军主任采用自行研制的CLIA法检测血清ASC浓度，评价新biomarker的临床意义。所在团队以磁性颗粒-FITC-FITC抗体为固相分离体系，FITC标记了一株抗ASC单克隆抗体，吖啶酯标记了另一株抗ASC单克隆抗体，建立了ASC自动CLIA检测方法。一共收集了167例急性缺血性中风(AIS)患者和238例健康对照者的血清。结果发现自行研制的ASC自动CLIA检测方法满足临床检测的要求。AIS患者血清ASC水平显著升高，是鉴别脑卒中患者的良好指标，可用于监测脑卒中的发病、治疗及预后。叶棋浓 中国军事科学研究院报告题目：肿瘤糖代谢基因表达控制癌症是严重威胁人类健康的常见疾病之一。葡萄糖代谢是最重要的代谢过程之一，包括葡萄糖的厌氧氧化、戊糖磷酸途径、三羧酸循环、糖异生和糖原合成。在恶性肿瘤转化过程中，糖代谢的重编程为癌细胞的生长和转移提供了能量和物质支持。中国军事科学研究院叶棋浓研究员在研究中发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞葡萄糖摄取水平升高，需氧糖酵解和戊糖磷酸途径通量增加，三羧酸循环异常，糖异生水平下降。肿瘤细胞葡萄糖代谢的调节机制主要包括蛋白质的转录调控、转录后调控和翻译后修饰。癌细胞可以通过HIF-1、c-Myc、p53等转录因子调控糖代谢相关基因的表达。其所在团队发现SIX1是调控肿瘤糖酵解的关键转录因子，SIX1的翻译后修饰在调控糖酵解中发挥重要作用，SIX1是肿瘤诊断和治疗的候选靶标。刘向祎 首都医科大学附属北京同仁医院报告题目：新型质谱技术在临床检验实践核酸质谱技术已开始越来越被大家了解和熟悉，很多体外诊断产品在注册中。在报告中，首都医科大学附属同仁医院的刘向祎主任所在实验室利用MALDI-TOF技术，采用毅新博创的飞行时间质谱仪，在耳聋基因筛查、老年性黄斑变性和疫苗在人群有效性评估方面进行初步检测和评估，为尽快走向临床起到一定推动作用。周洲 中国医学科学院阜外医院 报告题目：高敏肌钙蛋白检测性能评价周洲教授主要研究方向为遗传性心血管疾病的分子机制研究及基因诊断方法开发。报告当天恰逢世界心脏日，中国医学科学院阜外医院周洲主任对高敏肌钙蛋白检测的性能评价等作了专业归纳与表述。周主任认为，高灵敏度肌钙蛋白检测方法的分析性能评价是临床应用的前提。评价标准应包括空白限、检出限、定量限、报告范围、印痕和一致性等，且不同样品类型和“目标”机器的一致性是必要的。宗金宝 青岛大学附属青岛市海慈医院报告题目：流式细胞术在淋巴细胞亚群及细胞因子检测的临床应用青岛大学附属青岛市海慈医院宗金宝主任对流式细胞术的原理及特点作了详细介绍。团队利用流式细胞术进行了淋巴细胞亚群检测，细胞内外细胞因子检测等一系列详实实验。结果表明流式细胞术是检测淋巴细胞亚群和细胞内细胞因子非常重要而且不可或缺的手段，此外流式细胞术也可以检测细胞外细胞因子，其中流式荧光技术将在细胞外细胞因子的检测中发挥重要作用。李海霞 北京大学第一医院报告题目：膀胱癌肿瘤异质性及液体活检的应用膀胱癌(BC)是一种异质性疾病，以基因组为特征，具有不稳定性和高突变率。液体活检技术是一项很有前途的技术，可以在多个时间点分析体液(如血液和尿液)中的肿瘤成分，并提供一种微创的方法，可以跟踪进化动态和监测肿瘤异质性。北京大学第一医院李海霞主任在报告中对膀胱癌基因组和转录水平上异质性的多重面，以及它们如何影响临床护理和结果进行了系统阐述。高艳红 解放军总医院第一医学中心报告题目：流式荧光技术在临床应用及发展精准医学模式对临床实验室诊断提出了越来越高的要求，要求其具有预防性、预测性、个体化以及参与性等。因此快速、灵敏、高通量对疾病的生物标志物进行定性和定量分析，是当今生命科学领域的研究热点。流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析的高新技术，是继化学发光、生物芯片技术之后的新一代高通量分子诊断技术平台。在报告中，解放军总医院第一医学中心高艳红详细介绍了流式细胞仪的基本原理以及在免疫学、肿瘤学等领域的应用。郭建巍 北京市第一中西结合医院报告题目：临床实验室助力肠癌的早期发现结直肠癌是全球发病率和病死率居首位的消化系统恶性肿瘤，平均每一分钟就有一人确诊结直肠癌，每两分钟就有一人死于结直肠癌。然而结直肠癌发生、发展需要十余年时间，所以早期筛查可以显著降低肠癌死亡率，让肠癌止步。传统的结直肠癌筛查方法使用粪便潜血试剂盒或者肠镜进行检测判断，但平均漏诊率高达41%。北京市第一中西结合医院郭建巍在报告中介绍了几类新型的结直肠癌筛查方法，并分别对比了其优缺点。最后他认为FIT+便DNA（单靶点或多靶点）模式为肠癌筛查的主要手段，DNA甲基化检测是主要方法，并号召提高医务人员认知，他认为这将在结直肠癌的防控中发挥不可或缺的重要作用。李永哲 北京协和医院报告题目：自身免疫病实验诊断技术临床应用进展北京协和医院李永哲主任介绍了自身免疫病实验诊断技术的临床需求，自身免疫病新标志物临床应用进展，检测技术临床应用现状及发展趋势。首先明确了检查的一些基本要素，如免疫细胞、免疫分子、基因分型、自然抗体等等。随后介绍了自身免疫指标的应用，作为伴随诊断提供疾病预警判断等。李永哲主任重点介绍了自身抗体在炎性疾病中的应用，自身抗体与中毒的关联性，狼疮脑病与类风湿关节炎等新型标志物，以及新冠病毒与自身抗体的关系。陆予非 安捷伦科技（中国）有限公司报告题目：超亮荧光蛋白拓展免疫检测新征程荧光藻胆蛋白(RPE)是由多个小亚基组成的生物大分子，是一种高吸收荧光分子，具有良好的检测性能。当高灵敏度对检测和准确性至关重要，荧光藻胆蛋白是首选的荧光色素。荧光藻胆蛋白偶联物用于流式细胞术、免疫测定、MHC四聚体测定和珠基测定。陆予非展示了安捷伦科技能够提供的链霉亲和素、藻胆蛋白和广泛选择的结合产品。会议设置颁奖环节，会务组为本次获得优秀论文的年轻科研学者颁发了荣誉证书。优秀论文获奖者合影部分报告嘉宾合影留念（一）部分报告嘉宾合影留念（二）

2022年10月，南方医科大学南方医院郑磊教授牵头申报的“流式细胞技术应用推广”项目入选“国家卫生健康技术推广项目”，同时入选“国家卫生健康技术推广应用信息服务平台技术备选库”。为做好流式细胞技术的推广工作，中国民族卫生协会于2022年12月30日成立流式细胞临床应用推广组（简称：流式推广组）并举办流式细胞技术推广论坛。本次大会由中国民族卫生协会和广东省医学会联合举办，郑磊教授、王前教授担任大会主席，欧阳涓教授担任大会主持，著名检验专家崔巍教授、关明教授，中国民族卫生协会钱阳明副会长兼秘书长莅临大会并致辞，多位国内血液、检验等领域专家分享了流式细胞技术的发展趋势、行业标准、研究进展和临床应用。线上2500余人次点击观看。开幕式会议伊始，大会主席南方医科大学南方医院郑磊教授就流式推广组的成立背景、宗旨、组织架构、推广内容以及工作计划进行了详细地介绍。中国流式细胞技术的临床应用主要面临两大发展问题：专业技术人才紧缺、临床医生认知不足。流式推广组的宗旨是致力于流式细胞技术的人才培养、技术规范化、科研转化和临床应用推广，推动流式行业发展，服务临床诊疗工作。流式推广组的成立将打破限制发展的两大瓶颈问题，为中国流式细胞技术临床推广和应用开创新局面。大会主席南方医科大学珠江医院王前教授在致辞中指出，在国家医疗体制改革和分级诊疗政策推进的大背景下，县级诊疗水平和服务能力的提升是国家迫切需要解决的问题，此时，成立流式推广组，充分发挥协会的力量、专家的力量，将流式细胞技术推广到基层医院，帮助解决实际的问题，是非常有意义的。特邀嘉宾复旦大学附属华山医院关明教授出席会议并进行了致辞。关明教授指出，流式细胞术在临床各学科，尤其是疑难病的诊疗中，发挥重要作用，且应用价值得到不断地拓展，其具有自动化、多参数等优点，能更好地在各级医院中进行推广和应用。他坚信，流式推广组将在全国流式细胞术的发展中发挥引领和支撑的作用。特邀嘉宾中国医学科学院肿瘤医院崔巍教授出席会议并进行了致辞。崔巍教授指出流式细胞术的应用已经不限于血液系统疾病领域，在细胞亚群及功能检测需要更多的推广，所以在检验领域成立流式推广组具有重要的现实意义。流式推广组为全国流式细胞技术的发展搭建了一个很好的平台，这将有利于建立规范化的人才培养体系，推动流式细胞技术的推广和转化。特邀嘉宾中国民族卫生协会副会长兼秘书长钱阳明教授在致辞中指出，由郑磊教授牵头成立流式细胞技术临床应用推广组，聚集全国优秀的流式专家、平台和资源，专门致力于流式专业技术人才的培养、技术规范化、科研转化和临床应用推广，这将有利于促进流式行业的发展和技术下沉基层，切实提高各级医疗机构的诊疗水平，这是一项利国利民的工作。成立仪式中国民族卫生协会副会长兼秘书长钱阳明教授为推广组、推广单位、技术指导单位授牌，为推广组核心成员颁发聘书。中国民族卫生协会流式细胞临床应用推广组组长：郑磊顾问：王前、崔巍、关明副组长：欧阳涓、易斌、岳保红、谢丽、刘灿、桑圣刚、汪峰、李俊明秘书：褚帅首批推广单位南方医科大学南方医院、中山大学附属第一医院、广西医科大学第二附属医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、南昌大学第一附属医院、海南医学院第一附属医院、中南大学湘雅医院、福建医科大学附属第一医院、郑州大学第一附属医院首批技术指导单位南方医科大学南方医院、中山大学附属第一医院、广东省人民医院、中山大学肿瘤防治中心、广东省中医院、佛山市第一人民医院、广州市妇女儿童医疗中心大会报告报告题目：规范流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群报告专家：崔巍 中国医学科学院肿瘤医院 崔巍教授为我们讲授了外周血淋巴细胞亚群的流式细胞技术规范化检测。崔巍教授为我们介绍了外周血淋巴细胞亚群检测的临床意义，并分析了外周血淋巴细胞亚群检测流程中的影响因素，强调了外周血淋巴细胞亚群检测质量控制的重要性。随后崔巍教授为我们解读了2021新版《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，与2011版相比，新版指南完善了仪器质量控制和项目性能评估的内容，增加了流式细胞仪性能评估内容，梳理了分析前、分析中、分析后的内容及要求，增加了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的6色分析方案。报告题目：新版WHO分类浆细胞肿瘤的归属及流式克隆性分析应用报告专家：欧阳涓 中山大学附属第一医院 欧阳涓教授首先为我们讲解了第五版的淋巴浆细胞和浆细胞肿瘤的WHO分类，指出在第五版指南中浆细胞肿瘤将属于新设立的浆细胞肿瘤和其他伴副蛋白疾病这一独立类别，并且单克隆丙种球蛋白病被重新作为意义未明IgM单克隆丙种球蛋白病、意义未明非IgM单克隆丙种球蛋白病这2种疾病的上一级病名，并加入冷凝集素病CAD和有肾脏意义的单克隆丙种球蛋白病MGRS。欧阳教授还讲述了这些疾病的临床表现和实验室诊断，重点介绍了流式细胞方面的相关指标。随后，欧阳教授重点为我们介绍了浆细胞克隆性疾病的流式评估方法，分析了流式细胞术检测异常浆细胞的注意事项，综合分析前、分析中和分析后的要素为我们提出了了流式细胞术检测异常浆细胞的难点和一些可能存在的陷阱。最后，欧阳教授提出了浆细胞流式检测面临的挑战和实现检测的规范化、标准化的展望。报告题目：流式细胞术的临床应用和发展报告专家：郑磊 南方医科大学南方医院 郑磊教授为我们讲述了流式细胞术的临床应用和发展。郑磊教授首先介绍了流式细胞术临床应用发展的现状，存在基层医院开展不足、普及率低等问题，总结了流式细胞术临床应用发展两大瓶颈问题：临床医生认知落后以及专业技术人才匮乏。接着，郑磊教授指出疫情后大众对流式细胞术的认知提高，需求增大，并为我们讲解了近年来的国家对流式细胞术的扶持政策。随后，郑磊教授讲述了流式细胞术在传统领域（血液恶性肿瘤）、热门领域（细胞免疫检查）疾病的全程管理以及健康管理中的应用，并指出了技术革新、质量管理优化、临床服务创新、专业人才培养、平台支撑、产业发展等多个发展驱动要素。最后，郑磊教授提出了对流式细胞术的展望，认为流式细胞技术临床应用非常广阔，是提升临床诊疗水平的重要着力点，并且流式细胞技术发展前景良好，技术推广势在必行。报告题目：流式细胞术细胞因子测定在血液病诊疗中的应用报告专家：岳保红 郑州大学第一附属医院 岳保红教授对细胞因子的概述、历史、分类、检测方法及热点进行了讲解，重点给我们讲述了细胞因子在噬血细胞综合征的诊断与监控、细胞因子风暴的监控、PD-1治疗疗效的评估、移植物抗宿主病以及病毒感染性疾病中的应用。随后，岳教授通过案例分析为我们讲解了脓毒血症中相关细胞因子联合检测的重要性以及细胞因子检测对病毒感染转归的提示作用，并提出了对细胞因子检测在临床应用中的展望。报告题目：宿主免疫功能评估项目介绍和临床应用报告专家：汪峰 华中科技大学同济医学院附属同济医院汪峰教授首先对免疫功能评估项目进行了介绍并讲解了项目质量控制的要点，包括室内质控和室间质评等。汪峰教授指出除了细胞数量和功能检测（包括淋巴细胞绝对计数，中性粒细胞呼吸爆发试验以及CD34干细胞计数等）之外，还可以进行细胞表型的检测（如T、B细胞细分类检测，Treg细胞检测，单核细胞细分类等）。此外，汪峰教授还提出了评估方案“三位一体”和免疫状态“三位一体”两个概念。接着，汪峰教授通过临床案例为我们讲述了淋巴细胞功能检测的重要性以及免疫功能评估项目在疾病鉴别诊断与预后判断应用。最后，汪峰教授提出了对免疫功能评估的展望，除了在临床上的应用之外，还希望能在临床研究上有更好的发挥。大会总结最后，欧阳涓教授对大会进行总结：“流式细胞术在血液病、感染、肿瘤等领域有着广泛的应用价值，也是检验医学发展的热点之一。但是在发展的过程中，人才培养、技术标准化、科研转化和临床应用推广等方面还有待加强。郑磊教授牵头成立的这个中国民族卫生协会流式细胞技术临床应用推广组，召集了全国相关领域的专家，本次大会的学术环节也邀请了像崔巍教授、岳保红教授、汪峰教授这样的资深专家授课。大会会将这些专家的经验带到全国，并进一步深入基层医院进行推广。在此，我谨代表郑磊教授和流式推广组，欢迎全国各地的流式专家加入我们的推广组，也欢迎需要交流的单位积极联系我们”。回顾本次会议，多名国内相关专业的顶级专家针对流式细胞行业备受关注的热点问题献上了一场丰富的学术盛宴，剖析了流式细胞技术的发展现状、发展趋势、发展策略，解读了最新行业标准和共识，详细介绍了热点项目细胞因子检测和宿主免疫功能评估的临床应用，充分展现了推广组专家团队的临床和科研水平，让各位参会人员收获满满。流式推广组的成立，致力于推动流式细胞技术在各级医院的应用，服务于临床诊疗工作，欢迎全国范围内的流式从业人员积极与推广组联系，加入推广组，推动流式细胞技术临床应用。最后，感谢会务组辛勤的付出、感谢赞助公司的大力支持、感谢所有参会代表的积极参与！

导 读:100 多年来，科学家一直试图让免疫系统参与抗击癌症的斗争。在两位获奖者的开创性发现之前，仅有有限的临床研发。而检查点治疗现在已经彻底改变了癌症治疗方法，从根本上改变了我们对癌症治疗方式的看法。——诺贝尔奖官网癌症免疫疗法2018年斩获诺贝尔奖！在免疫治疗炙手可热的当口，无疑更添一笔旺火。 2018 年诺贝尔生理学或医学奖授予James P. Allison 和 Tasuku Honjo（中文翻译：本庶佑），以表彰他们在癌症免疫领域中做出的贡献。 “通过刺激患者自身的免疫系统攻击肿瘤细胞的能力”——人类抗击癌症的斗争中的一个重大里程碑 癌症每年夺去数百万人的生命，是人类最大的健康挑战之一。通过刺激我们的免疫系统的内在能力来攻击肿瘤细胞，今年的诺贝尔奖获得者为癌症治疗建立了一个全新的原则。 20世纪90年代，艾利森在加利福尼亚大学的实验室对已知蛋白——细胞毒性T细胞相关蛋白-4（Cytotoxic T lymphocyte associate protein-4，简称CTLA-4）进行了深入研究。艾利森发现，CTLA-4可以起到抑制免疫系统的作用，相当于患者免疫系统的“刹车器”。 抑制CTLA-4分子，则能使T细胞大量增殖、攻击肿瘤细胞。他意识到，如果解除这种抑制，患者的免疫细胞可以再次获得攻击肿瘤的防御能力。 与此同时，本庶佑在淋巴细胞膜上发现了一种免疫球蛋白受体，当时认为与细胞程序性死亡有关，故命名为PD-1（Programmed cell Death 1）。仔细研究它的功能后，最终揭示该蛋白也是作为一个“刹车器”，但作用机制不同。 詹姆斯 艾利森（左）本庶佑（右） 艾利森和本庶佑多年的研究展示了如何解除患者自身免疫系统的“刹车器”来治疗癌症。在他们两人取得重大发现之前，癌症临床研究陷入了瓶颈，他们的开创性发现被认为是人类抗击癌症的斗争中的一个重大里程碑，并为彻底治愈癌症带来了曙光。 医学界的bian革，正式走进细胞治疗时代！ 类似癌症免疫疗法已经给某些类型癌症的治疗带来了“ge命”，让一些患者以前无法治疗的肿瘤萎缩到近乎零。 与干细胞疗法一样，免疫治疗也基于一个变革性的理念：人类与其借助与药物治疗疾病，更应尝试“控制”细胞，让它们发挥或加强原有的作用，达到更好的疾病治疗目的——正是这样革新的理念，推动着医学界的变革，带领我们走进了细胞治疗时代。

当我们提到GABA（γ-氨基丁酸）的时候我们会想到什么？GABA是一种主要的抑制性神经递质，调节神经元间的通讯。在大脑之外，在肠道、脾脏、肝脏和胰腺中也检测到了GABA这种神经递质的存在【1,2】。但是GABA在免疫系统中是否会“跨界”发挥作用还不得而知。2021年11月3日，日本横滨理化研究所Sidonia Fagarasan研究组发文题为B cell-derived GABA elicits IL-10+ macrophages to limit anti-tumour immunity，发现B细胞来源的GABA诱导巨噬细胞从而限制抗肿瘤免疫反应，为免疫系统中除了细胞因子和膜蛋白之外的小分子代谢产物的免疫调节功能提供了新的见解。小分子水溶性代谢产物不仅是细胞内生物化学反应过程的重要中间产物，也是释放到细胞外环境中的“信号分子”，从而影响临近的细胞【3-5】。淋巴细胞受到多种受体和可溶性小分子代谢产物的调节，但是仍然有很多小分子代谢产物的功能尚未被了解清楚。因此，作者们希望能够找出其中发挥关键调节作用的水溶性代谢产物，该代谢产物可能作为环境线索发挥作用从而介导免疫细胞之间的相互作用。为了找出参与免疫系统的小分子水溶性物质，作者们对处于稳态以及激活状态淋巴细胞中进行水溶性代谢产物的分析。这两种淋巴细胞之间有200种左右的代谢产物存在显著的不同。其中主要涉及的代谢特征的不同是丙氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸通路的差异，另外嘌呤和嘧啶代谢以及三羧酸环也与免疫激活密切相关。在这些代谢产物中，一个以前被广泛认为在神经系统中发挥作用的因子GABA引起了作者们的兴趣。先前并没有研究表明B细胞能够产生GABA，因此GABA在免疫系统中的作用也很不清楚。首先，作者们确认了免疫系统中的B细胞的确是GABA产生来源，并且通过对GABA合成的关键酶分析发现小鼠和人类B细胞中GAD67（Glutamate decarboxylase 67）而非GAD65的表达水平会上升。该结果说明无论是小鼠还是人类中谷氨酸的代谢的确能够刻画B细胞谱系的变化。那么B细胞中所产生的GABA是如何在免疫系统中发挥作用的呢？为此，作者们采用了MC38结肠癌模型，该模型中B细胞已经被证明通过抗原非特异性机制抑制抗肿瘤T细胞反应【6】。作者们发现B细胞缺乏的小鼠品系中肿瘤的生长比野生型的肿瘤控制的更好。另外，与接受安慰剂的小鼠相比，植入缓释GABA颗粒会导致B细胞去除的小鼠肿瘤生长显著增加。通过加入GABA受体激动剂木防己苦毒素，作者们发现会限制肿瘤的生长并提高肿瘤浸润性CD8+T细胞的细胞毒性活性。因此，作者们发现减少GABA或影响GABA受体信号通路会增强细胞毒性T细胞反应和抗肿瘤免疫，而分泌GABA使宿主对肿瘤生长产生免疫耐受。那么GABA影响免疫功能系统的细胞生物学机制是如何的呢？先前的研究表明肿瘤相关巨噬细胞（Tumour-associated macrophages，TAMs）可以抑制抗肿瘤免疫反应。作者们发现GABA影响巨噬细胞生理的过程，促进向抗炎表型极化的反应。进一步地，作者们想知道GABA如何调节巨噬细胞。研究表明TAMs起源于单核细胞（Monocytes），因此，作者们猜测GABA是通过影响单核细胞向巨噬细胞的分化来调节巨噬细胞的。为了验证这一假设，作者们将GABA加入到培养基中，发现会导致细胞数量增加、细胞存活增加同时也促进抗炎巨噬细胞特征因子FRβ（Folate receptor β）的表达。基因转录本分析也证明细胞周期相关以及叶酸代谢相关的基因出现了明显地上调。因此，作者们确认GABA促进具有抗炎特性的巨噬细胞的分化、扩张和存活。进一步地，为了确认B细胞中GABA的作用，作者们构建了特异性在B细胞中敲除GAD67的小鼠品系，发现条件性失活GAD67后会导致B细胞中GABA含量显著降低，而且发现B细胞产生的GABA会显著限制抗肿瘤T细胞反应。总的来说，该工作发现作为代谢产物以及神经递质的GABA会通过激活的B细胞被合成和分泌出来，作为细胞间相互交流的线索影响机体免疫系统的响应。该工作说明B细胞谱系产生的小分子代谢产物具有炎症调节的作用，可能会成为未来免疫反应调节的药物靶点。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04082-1

NK细胞（自然杀伤细胞）在机体抵御癌症和多种感染性疾病上扮演着重要的角色，近日，一项刊登在国际杂志The Journal of Immunology上的研究报告中，来自瑞典隆德大学等机构的科学家们通过研究绘制出了这些来自于骨髓造血干细胞中的超级细胞成熟过程的不同阶段以及其被调节的分子机制，相关研究对于开发抵御癌症的新型免疫疗法至关重要。在机体免疫系统中，NK细胞是机体防御机能的前线细胞，其能够识别并且杀死癌细胞及被病毒所感染的细胞；由于其具有重要的功能，目前很多研究都重点调查如何利用NK细胞来开发抵御癌症的新型免疫疗法；机体免疫系统中的两个主要角色：T淋巴细胞和B淋巴细胞都来自造血干细胞，而且科学家们对其也进行了大量研究，而对于NK细胞的成熟过程却研究甚少。研究者Ewa Sitnicka教授说道，为了能够在细胞疗法中充分利用NK细胞的特性，我们首先就需要理解NK细胞产生的机制，通过绘制出其从造血干细胞开始产生成熟的不同过程以及调节机制，或许就能帮助研究人员更好地控制NK细胞的发育以及功能，这项研究中，研究人员还阐明了干细胞分化以及产生不同类型淋巴细胞的机制。对于NK细胞功能和成熟至关重要的信号通路Notch蛋白属于高度保守的信号沟通系统中的一类受体家族，Notch信号能够控制动物和人类机体中细胞的发育工程。文章中，研究热源调查了当通过Notch蛋白激活产生的信号通路被关闭后所发生的状况，研究者指出，Notch信号通路对于NK细胞的发育以及正常功能的维持至关重要，当研究人员对小鼠机体血细胞中处于失活状态的Notch功能进行研究时，他们发现，NK细胞的数量和功能都会被影响。研究者Ewa Sitnicka解释道，如果没有Notch信号通路，NK细胞就不会正常成熟，而且其数量也会下降，这对于NK细胞有效抵御癌症和感染性疾病具有重要的意义；后期研究人员还将通过更为深入的研究来理解如何产生正常功能的NK细胞来用作癌症免疫治疗。