中国学者开发小型化在体实时三维显微成像设备
“为了更关键的可行性验证，我们需要直接在人体上采集活体成像数据。不过毕竟仪器还处于实验室里的工程样机阶段，搬去临床科室的条件尚不成熟。这时候伊丽莎白希尔曼 （Elizabeth M. C. Hillman）教授当仁不让地站出来，成为了 Medi-SCAPE 系统的第一位志愿者。”中国科学技术大学特任研究员梁文轩回忆道，“这样的成像实验我们至少做了三次，每次都持续三四个小时，全都是希尔曼 教授自己做受试。因为她坚持表示，在充分验证安全性之前，必须由她自己承担风险。”梁文轩博士（图片来源于网络）2022 年春季，他选择回国加入中国科学技术大学。在此之前，其在美国哥伦比亚大学祖克曼研究所从事博士后研究。针对临床对在体实时三维病理学显微成像的需求，他研制了小型化的扫掠共焦对准的平面激发（swept confocally-aligned planar excitation，SCAPE）原型系统，并通过实验探索了其在实时在体病理学成像领域的应用潜力。2022 年 3 月 28 日，相关论文以《高速光片显微镜用于原位获取活体组织的体积组织学图像》（High-speed light-sheet microscopy for the in-situ acquisition of volumetric histological images of living tissue ）为题发表在 Nature Biomedical Engineering 上 [1]。图丨相关论文（来源：Nature Biomedical Engineering）实时在体三维病理学成像的需求组织病理学在医院各科室的疾病诊疗中应用广泛，是包括各种癌症在内的绝大多数临床疾病的诊断金标准。常规的组织病理学检查首先需要活检取材，即通过开放式活检、内窥镜活检、穿刺活检等方式，在（疑似）病变区域切取小块组织样本，然后将该组织样本送检病理科，之后经过固定、脱水、浸蜡、包埋等一系列处理步骤制成病理切片，并将其放在光学显微镜下，观察组织的微观结构与细胞形态，从而分析和获取相关的病理学诊断信息。不过，需要说明的是，这套传统的标准流程也存在一定的局限。首先是得到病理准确结果的等待时间长，至少要十几个小时。后来临床中发展出了术中冰冻病理切片，简化了组织处理的步骤，但依然需要大概 20 分钟，所以无论是常规的组织病理还是术中冰冻病理，都不适合需要实时诊疗反馈的场景。其次，活检取材加病理学切片观察本质上是离体的观测手段，难免会切除正常组织，影响患者体验和术后恢复。此外，离体的活检组织会失去其在体时的代谢和功能动态，而这些信息却对判断活体组织的状态和病变程度来说颇具价值。因此，需要探寻一种更为理想的解决方案。比如，研发一种在体、原位的光学显微成像方法，在不切除组织的情况下，能够直接可视化活体组织的三维微观结构乃至其功能动态，给医生提供实时或者至少是即时的组织病理学级别的图像信息。这样既可以在肿瘤切除手术中为医生提供实时的诊断反馈，推动提升手术的精准度和疗愈率，也可以在诸如早癌筛查、治疗随访等临床场景中，辅助医生更准确、更快速地评估待探查组织的健康或病变状况，及时采取相应的诊疗措施，在保证检测准确率和灵敏度的前提下，尽量减少对正常组织的损伤，最终改善诊疗效率和患者体验。据介绍，临床上现有的各种手术显微镜和内窥镜，大多是基于宽场照明的反射光显微镜，只能拍摄组织表面的形态，无法可视化皮下（或黏膜下）的组织形态。因此，要想在不切片的前提下直接获取厚生物样本（即使仅有几十微米厚）的三维层析图像，也即实现对原位在体组织的三维显微成像，需要开发具有光学层析能力的三维光学显微成像方法。过去几十年来，具备光学层析能力的活体显微成像技术取得了诸多进展，诞生了多种不同的成像机制。其中，与病理学显微成像密切相关的主要有两大类。第一类是基于“点扫描光学层析”的显微成像，典型代表包括共聚焦（反射或荧光）显微镜、双光子荧光显微镜等。但其成像速度不足，易受活体组织运动的影响，难以实施大范围或者三维扫描成像。第二类是光片荧光显微镜，也被称为层状光选择照明显微镜。但由于其狭窄的样本空间，这种显微镜不适用于临床场景的活体组织成像。所以，理想的适合于实时在体病理学成像的显微成像技术应该具备以下几个方面的特征。第一，能够实现“无需切片、胜似切片”的三维成像效果的光学层析能力。第二，微米级别的空间分辨率。第三，可以兼容不同的组织形状和前视式成像架构的开放的样本空间。第四，拥有尽可能高的三维体积成像速度，以有效对抗活体组织运动的干扰，使得快速、大范围、三维全景成像成为可能，为临床诊疗提供更丰富、更全面的图像引导。探索 SCAPE 显微术于实时在体病理学成像领域的应用据介绍，基于前述的临床需求和现有成像技术的局限，在导师的指导下，他所在的团队启动了将 SCAPE 显微成像技术应用于实时在体病理学成像的探索，并将此研究项目称之为 Medi-SCAPE。作为扫描斜光片三维显微成像方法的代表，SCAPE 显微术由希尔曼 课题组于 2015 年率先提出。简单来说，其基本的工作原理是，使用单个主物镜既产生（相对于主光轴）倾斜的激发光片，又收集光片所激发的荧光，即同一个物镜以“双肩挑”的方式既用作激发物镜也用作探测物镜，从而将传统光片显微镜的正交双物镜架构简化为 SCAPE 的单物镜前视式架构。在继承正交光片显微成像的光学层析能力的基础之上，SCAPE 显微镜的第一个优势是提供了开放的样本空间。无论是线虫、斑马鱼、果蝇等模式动物，还是人体的器官和组织，只要能放置于主物镜前面，就可以实施三维成像，视野范围大约为 0.8 毫米见方 0.3 毫米深。其单物镜前视式架构与宽场手术显微镜和内窥镜一致，天然适合临床中的实时在体成像需求。不仅如此，SCAPE 显微镜还巧妙引入了远程光片扫描与去扫描机制，整机除了扫描振镜以外，没有其他的机械运动部件，可以在主物镜与样本保持相对静止的前提下完成高速三维成像，极大程度地提升了二维帧率和三维体积率的上限。在实际中，受限于科研级互补金属氧化物半导体相机的帧率，现行 SCAPE 显微镜的体积率大约在 10 体积/秒左右，相较点扫描模式而言，已经有数量级的提升，这是 SCAPE 显微镜的另一个重要优势。尤为关键的是，SCAPE 的三维体积率优势，使得在体大范围三维全景成像成为可能。医生不再需要采集规则排布的三维体数据阵列，而是可以自由地操控 SCAPE 显微探头，在待探查组织的表面随意游走。即使存在活体组织与探头之间的无规则轴向相对运动，SCAPE 的高速三维体积率仍能保证相邻的两组体数据块之间有足够的三维空间重叠，从而支持后期通过三维配准和融合算法“去抖动”，实现“漫游式”扫描三维全景成像。“这对于肿瘤边界判别、早癌筛查等临床应用尤为关键，也是我们希望将 SCAPE 显微镜推向临床应用的重要动力和信心来源。”他表示。据其介绍，SCAPE 显微成像技术问世以后，首先在生命科学领域的研究中显示了强大的潜力，在基础科学和技术创新两方面，都取得了一系列重要进展。在以往的成像实验中，样本通常是表达了荧光蛋白或钙离子指示剂的转基因培养细胞或者模式动物，其拥有相对较强的荧光信号。但在临床活体成像应用中，显然不能在人体细胞中表达荧光蛋白，而临床上获批允许用于人体的荧光染料的种类和特异性也有限。因此，该团队更希望能够借助机体的自发荧光来实施无标记成像。不过，需要说明的是，自发荧光是相对较弱的。那么，SCAPE 显微镜能否利用无标记组织的自发荧光信号，获得与标准病理学图像一致的微观组织结构，以及其成像结果能否有效反映健康组织和病变组织，在微观形态学或功能学方面的区别呢？图丨用 Medi-SCAPE 对多种新鲜小鼠组织进行无标记成像（来源：Nature Biomedical Engineering）围绕这一问题，该团队首先在小鼠上试验了肝、脾、肺、肾、胰腺等新鲜离体的器官或组织，验证了 SCAPE 显微镜能够在不破坏目标组织的前提下，有效地可视化其三维微观结构，并得到了与组织病理学切片图像高度匹配的三维图像。并且，他们也在活体小鼠肾脏上诱导了缺血和再灌注的过程，并成功追踪了肾皮质中近端和远端肾小管的荧光信号在此过程中的动态变化，验证了 SCAPE 显微镜在快速三维结构成像的同时，也能够捕捉活体组织的功能动态。图丨小鼠大脑和肾脏的体内功能成像（来源：Nature Biomedical Engineering）进一步地，他们测试了被手术切除的慢性肾脏病患者的新鲜肾脏，从 SCAPE 图像中清晰地观察到了小血管粥状硬化等血管形态方面的诊断特征，分辨毛细血管簇、鲍曼囊腔等肾小球内部结构，并能够区分出正常和出现硬化症的肾小球等。研制小型化 SCAPE 显微镜样机，实现同等效能的高速三维体积成像上述在体或新鲜离体小鼠组织的成像实验，都是在台式 SCAPE 显微镜上进行的。由于该设备的占地面积约 1 平方米，体积庞大，结构复杂，所以并不适用于术中肿瘤边界判定或皮肤病变治疗随访等临床场景。梁文轩 表示：“要在这些场景下充分发挥 SCAPE 显微技术的潜能，就需要一台小型化、轻便化的 SCAPE 显微成像探头。能否小型化或微型化，以及能小型化到什么程度，这是 Medi-SCAPE 项目需要回答的第二个关键问题，也是我当时主力承担的课题任务。”他和导师经过仔细分析，决定在第一代样机设计中不追求极致微型化，而是尽量采用市面上可以买到的元件，以完成初步的可行性验证为重点。基于此，梁文轩 通过深入思考，提出了模组化的创新架构。首先将光片生成透镜与荧光探测物镜整合为远端收发模组，简化掉了台式 SCAPE 设计的二向色镜和分叉光路；然后优化折叠了从第二物镜到主物镜的近端级联 4f 光路，使得前端模组更加紧凑。由此配合选用尺寸小得多的光学元件，他成功研制了一台小型化 SCAPE 显微镜样机，使整机面积缩小至台式 SCAPE 的 20%，并取得了同等水平的荧光收集效率和三维分辨率（约 0.81.12.1 微米），能够以约 10 体积/秒的体积率扫描成像约 400×700×160 微米长宽深的三维视场，且同样能够利用内源性自体荧光进行高速三维体成像。小鼠新鲜无标记组织的成像实验表明，该样机能够清晰解析肝、肾、肠粘膜等多种器官的细胞级精细结构。“虽然该样机的前端探头部分与科学级互补金属氧化物半导体相机装配在一起，并没有完全做到轻便灵活的手持式探头形态，但其全面采用了尺寸更小的光学元件，依然为 SCAPE 显微镜的小型化提供了有力的可行性验证。”他补充说。图丨 Medi-SCAPE 系统设计（来源：Nature Biomedical Engineering）此外，在台式和小型化 Medi-SCAPE 平台上，该团队还利用健康志愿者的舌头，模拟了大范围漫游采集模式。实验中由志愿者随意地“舔过”主物镜来模拟漫游模式，然后从所得的高速“体数据流”中可以准确估计和恢复相邻体数据块之间的三维错位，进而通过配准与融合算法生成涵盖若干毫米范围的三维全景图像。拼接后的全景图像呈现不规则的边界，这说明在应用 SCAPE 进行全景三维成像时，并不需要仔细地控制漫游轨迹，这也是 SCAPE 显微术独特的优势所在。“等到将来研制出更加便携的手持式 Medi-SCAPE 探头时，医生可以灵活地操控该探头在各种组织表面自由地游走以及调整探头的倾角，无需担心这些操作对三维全景拼接的影响，大大提升探头的临床实用性。”他说。图丨人体口腔的活体成像（来源：Nature Biomedical Engineering）致力于为基础科学和临床应用提供切实有益的解决方案据梁文轩介绍，他本科和硕士就读于清华大学生物医学工程系，以医学影像为主要研究领域。在硕士阶段，其研发了基于数字信号处理器芯片（Digital Signal Processor，DSP）的高性能三维锥束 CT 重建算法，通过深入底层汇编语言的流水线并行算法，大幅刷新了 DSP 平台上的算法性能记录。硕士毕业后，他来到美国约翰斯霍普金斯大学生物医学工程系攻读博士学位，将研究目光转向生物医学光学与光子学领域。在博士阶段，他主导研发了两代基于光纤扫描的微型双光子显微内窥镜，在直径仅 2.2 毫米、重量不足 1 克的超微型内窥探头中集成了双光子激发、焦点扫描和荧光收集等全部功能。博士毕业后，其在约翰斯霍普金斯大学从事了半年多的博士后研究，后入职哥伦比亚大学祖克曼研究所，跟随 SCAPE 显微技术的发明人开展博士后研究。除了如前所述的小型化Medi-SCAPE 样机研发，他还提出了基于纤维光锥的跨介质中间图像耦合机制，解决了制约介尺度 SCAPE 显微镜的信号效率瓶颈，并据此研发了具备 440.4 毫米长宽深超大视场的 meso-SCAPE 系统。目前，他在中科大担任特任研究员，在合肥本部物理学院和苏州高等研究院生物医学工程学院同时开展教学与科研工作。关于该项研究，他表示会有两个方面的后续计划。一方面是进一步推进 Medi-SCAPE 的微型化，朝着 10 毫米直径的细长硬管形手持式 Medi-SCAPE 探头，以及直径 3 毫米以下的柔性光纤微型 SCAPE 探头等目标前进。另一方面是与临床专家紧密合作，深入理解不同科室的特点和对在体病理学成像技术的需求，从而定制化开发台式、手持式或内窥式架构的 Medi-SCAPE 成像设备，并联合开展成像实验和临床测试等。此外，他所带领的课题组，未来仍会围绕活体三维显微成像开展方法学创新与应用研究，探寻成像原理、采集策略、架构设计等方面的方法学创新，为基础生命科学研究和临床诊疗应用创制切实有益的前沿技术和解决方案。“欢迎具有交叉学科背景或是希望获得交叉学科训练、有志于推动自主知识产权国产高端科研和医疗仪器研发的同学加入课题组，也诚挚希望能与怀有同样愿景的学术界和产业界同仁取得联系，深入磋商，共同努力。”梁文轩 最后说。参考资料：1. Patel, K.B., Liang, W., Casper, M.J.et al. High-speed light-sheet microscopy for the in-situ acquisition of volumetric histological images of living tissue. Nature Biomedical Engineering 6, 569–583 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00849-72.Voleti, V., Patel, K.B., Li, W. et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods 16, 1054–1062 (2019). https://doi.org/10.1038/s41592-019-0579-4本文作者：路雨晴
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