红色荧光蛋白检测

托摩根DFP荧光蛋白观测镜可用于检测动植物以及微生物中绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（DsRed）。 DFP荧光蛋白观测镜便于野外作业，检测效率高， 操作方便，开机后不需热机，可直接检测，系统稳定，可长时间持续作业，无需化学底物显色，直接进行观测，不损坏被检测对象的细胞。DFP荧光蛋白观测镜中科院华南植物园是我国历史最久、种类最多、面积最大的南亚热带植物园，此次购买托摩根DFP荧光蛋白观测镜，主要用于植物基因检测。托摩根一直致力于科研事业，产品凭借过硬的品质、完善的售后服务，赢得了众多用户的好评。 Thmorgan咨询热线：4000-688-151. 市场部2017年4月13日

Ca2+作为普遍的第二信使在细胞信号转导过程中起着非常重要的作用，是单个细胞生存和死亡的信号。它参与了神经传导、血液凝固、肌肉收缩、心脏收缩、大脑功能、酶功能以及内分泌腺的激素分泌等各种生理机能。而人们对Ca2+在信号转导中作用的认识，则很大程度上取决于Ca2+测定技术。目前常用的Ca2+检测方法主要有：Ca2+选择性微电极测定法、同位素示踪法、核磁共振法和水母发光蛋白检测法等。01Ca2+选择性微电极测定法:Ca2+选择性微电极一种电化学敏感器。利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是Ca2+对数的线性函数，遵循Nernst方程。优点：直接、敏感地测定组织或细胞内的Ca2+，不需使用指示剂，不影响结合钙和游离钙的平衡。缺点：反应速度慢而无法测定Ca2+的快速变化，而且穿刺损伤细胞可引起渗漏，且不适用于太小的细胞。02同位素示踪法：用放射性核素45Ca2+对Ca2+进行示踪，可测量出通过细胞膜转运到细胞内Ca2+增加的速度及浓度的大小，揭示Ca2+泵的作用，目前主要用于测定跨膜Ca2+的流动。优点：测量方法简单易行，比普通化学分析法的灵敏度高。确定放射性示踪剂在组织器官内的定量分布，可以达到细胞、亚细胞乃至分子水平。缺点：静态效果差，需要特定的同位素测定仪，并且要注意示踪剂的同位素效应和放射效应问题。03核磁共振法：是一种新的、非光学技术的Ca2+检测方法。由于正常生物体内氟含量很少，为了得到足够的响应，在检测时需要使用含氟指示剂。该指示剂经过化学修饰后进入细胞，进而被水解成游离状态，然后与Ca2+结合，根据获得的波谱图计算出Ca2+的浓度。优点：具有非破坏性和无损伤性，能够在接近生物样本生理状态下连续动态地进行检测，准确反应Ca2+浓度。缺点：需要核磁共振仪，成本较高。04荧光探针法：目前常用的Ca2+荧光探针有Fluo-3、Fluo-4、Fluo-８等。这类探针本身无法进入细胞，但它的亲脂性衍生物却可以透过细胞膜进入细胞。一旦进入细胞，这类亲脂性衍生物的亲脂性封闭基团在细胞非特异性酯酶的作用下被分裂除去，在细胞内便会形成一种带负电荷的荧光染料。与胞内Ca2+结合时，其荧光强度显著增加。优点：指示剂易导入细胞，空间分辨率高，反应速度快，而且可同时检测多重离子。缺点：需要有荧光显微镜或激光共聚焦显微镜，成本较高。05水母发光蛋白检测法:最近十几年来，水母发光蛋白(Aequorin)很受人们的关注。水母发光蛋白由189个氨基酸组成，具有3个Ca2+结合的EFhand结构，所以水母发光蛋白可作为检测Ca2+的新型探针。优点：Ca2+/水母蛋白复合物能检测~0.1μm到＞100μm范围内的钙离子浓度，且复合物不会从细胞内泄露出来，可检测几小时至数十天内Ca2+浓度的变化。比荧光探针法的背景低，样本本身不会发生自荧光。腔肠素的性质腔肠素(Coelenterazine)作为海洋动物体内贮存光能的分子，它广泛存在于海洋生物体内，比如海肾、海蜇、水螅等。腔肠素是天然荧光素中最普遍的，它可作为很多荧光素酶的底物。目前研究得最透彻的以腔肠素为底物的荧光素酶来源于海肾（Renilla），即海肾荧光素酶（Renilla reniformis，简称Rluc）。腔肠素的工作原理腔肠荧光素是一个分子量约400 Da 的疏水基团，它可以自由穿越细胞膜。在一个以荧光素/荧光素酶为基础的系统中，腔肠素作为以水母发光蛋白为代表的海洋发光蛋白的辅助因子，与水母发光蛋白进行稳定的结合，引起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键破裂，腔肠荧光素(Coelenterazine)被氧化脱羧，形成腔肠酰胺（Coelenteramide），释放出CO2，同时发出波长为469nm的蓝色生物荧光，该荧光可用博鹭腾高灵敏度管式/板式发光检测仪进行测定。图1.腔肠素/水母发光蛋白检测Ca2+机制水母发光蛋白一旦和Ca2+反应即丧失发光功能，因此当一部分水母发光蛋白与Ca2+反应时，被消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出Ca2+浓度变化，而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与Ca2+浓度之间存在线形关系。如同萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的活性也不需要翻译后修饰，一旦翻译完成即可行使遗传报告基因的功能。但是与萤火虫荧光素酶又有差异，即腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更利于生物荧光的研究。技术小结由于Ca2+在生命活动的各种生理生化反应、疾病的发生和发展中都扮演着极其重要的角色，而游离的Ca2+浓度变化又与细胞的功能、信号转导乃至细胞的凋亡有密不可分的联系，因此，研究如何检测细胞内游离Ca2+浓度显得尤为重要。Ca2+选择性微电极测定法不需要使用指示剂，但是穿刺过程会损伤细胞，进而引起渗漏。同位素示踪法简单，但是静态效果差，还需要注意同位素效应和放射效应问题。核磁共振法和荧光探针法都需要特定的仪器，成本较高。水母发光蛋白检测法不需要激发光源，因而消除了细胞自发荧光的干扰，背景荧光远低于使用钙离子指示剂的荧光。另外腔肠素具有疏水性，易于通过细胞膜，适于全细胞的研究。 腔肠素/水母发光蛋白的生物荧光反应对Ca2+浓度的变化非常敏感，但是这种发光相对较弱，因此需要使用高灵敏度的发光检测仪进行检测。

9月11日，美国化学会杂志JACS 在线发表了中国科学院生物物理研究所王江云研究组的最新研究成果&mdash &mdash 《基因编码非天然氨基酸作为光致电子转移探针扩展荧光蛋白的传感性质》。该研究利用基因密码子扩展技术，实现了在活细胞中编码一系列卤代酪氨酸(3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2,3,5,6-四氟代酪氨酸(F4Y))，在荧光蛋白中实现了大分子中的光致电子转移现象，基于光致电子转移原理发展了对pH及Mn(III)敏感的荧光传感器。 　　基因编码和荧光蛋白传感器是生物学研究中的重要技术手段。在过去的几十年中，人们已经开发出多种荧光蛋白传感器，用于监测金属离子，pH值，第二信使和翻译后修饰，这对于解析它们在体内信号转导网络中的作用是至关重要的。这些荧光蛋白传感器通常依赖于荧光共振能量转移或者绿色荧光蛋白GFP荧光团酚基的质子化/去质子化来发挥作用。尽管它们现在已被广泛应用，但是在分析物结合前后，这些荧光蛋白传感器的荧光强度变化通常都在两倍以内。相比之下，光致电子转移(photo-induced electron transfer，简称PET)机制开始越来越广泛地被引用到荧光传感器设计中来，最重要的原因在于分析物结合前后，荧光蛋白传感器可以展现出显著的荧光强度变化(通常可以增强10至100倍)。PET同时也是光合作用中的主要反应，PET过程广泛存在于生物系统中，如细胞色素c氧化酶、核苷酸还原酶、DNA光解酶等，其对磁感应等生物过程也具有非常重要的意义。 　　该研究将一系列卤族元素取代的酪氨酸通过基因密码子扩展的手段定点插入到荧光蛋白(iLov2)中，发现在非天然氨基酸与荧光蛋白发光中心FMN之间的发生了快速的光致电子转移，并测量到电子转移发生在0.2 纳秒。通过荧光检测科研人员得到了一系列对pH具有不同响应能力的荧光蛋白突变体，利用该传感器他们检测了细胞质的酸化过程，该传感器将适用于研究活细胞中的pH值变化过程。同时科研人员首次得到了可以基因编码的对Mn(III)敏感的荧光蛋白，这将有利于检测与生物和环境相关的Mn(III)的浓度，为筛选高效的锰过氧化物酶提供了平台，为实现高效的木质素降解及生物质转化提供了研究工具。该研究为蛋白动态构象变化研究提供了新的研究手段，为利用合成生物学手段生产可再生能源提供了新的研究思路，为蛋白设计提供了新的工具。 　　该研究得到科技部国家重点基础研究&ldquo 973&rdquo 计划、国家自然科学基金委员会的资助。 　　 图示：基因编码非天然氨基酸作为光致电子转移探针扩展荧光蛋白的传感性质

近日，北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室教授章晓辉团队、北师大生命科学学院教授王友军团队与中国科学技大学教授唐爱辉团队合作开发构建了一类新型的检测钙信号的荧光蛋白探针NEMO，具有高灵敏度和反应能力，对钙信号的动态分辨范围有了很大提升。荧光探针在分子生物学研究和开发中越来越受到重视。许多科学家正在医学、制药和绿色生物技术等领域都有应用，荧光探针在很多情况下被描述为荧光化学传感器，荧光探针是具有吸收特定波长的光并发射不同波长的光的小分子，通常是更长的波长（称为荧光的过程），用于研究生物样品。 这些分子可以附着在目标分子上，作为荧光显微镜分析的标记，也称为荧光团。细胞中的一些蛋白质或小分子是天然荧光的，这称为内在荧光或自发荧光，比如绿色荧光蛋白 (GFP)。 蛋白质、核酸、脂质或小分子可以用外在荧光团（一种荧光染料）标记，它可以是小分子、蛋白质或量子点。遗传编码钙离子指示剂（genetically encoded calcium indicators，GECIs），是一种新型的钙离子指示剂，它可以实现在体实验中对钙离子的长时程检测和实时动态检测，并且还可以借助细胞器的特异性定位信号表征某些特定的亚细胞结构的钙离子变化情况。目前常用的荧光蛋白指示剂有Cameleons、TN-XXL、GCaMP、Pericams和Camgaroo等。GCaMP系列蛋白（Single-fluorophore）特别是GCaMP6系列蛋白是最主要的钙离子指示剂。与GCaMP6s相比，NEMOs能够检测到体内SBR峰高2倍、中位SBR峰高4倍的神经元的单动作电位，从而优于大多数现有的最先进的GECIs（蛋白探针）。科学家们发现，通过改变CaM、M13与GFP三个元件之间的连接方式FF0C，连接短肽及互作界面中的关键氨基酸等方式，可改善GECIs的表现。合作团队采用了全新策略构建的新型高灵敏钙离子探针。从增强GECI对钙离子浓度变化的的荧光反应大小出发，合作团队采用亮度更高的新型荧光蛋白mNeoGreen（mNG）来替换广泛使用的cpGFP，结合多种设计及优化策略组合，构建了含几十个候选复合分子的GECI库，并通过系统的钙离子成像筛选和体外鉴定后，最终获得到了一组名为NEMO的新型GECI探针。在领域中首次实现GECI探针对细胞内钙信号的反应幅度超过100倍；同时具有更好的抗光淬灭能力与pH稳定性，并能实现对钙离子水平的绝对定量检测。科学家们用与gcamp6兼容的成像装置检查了在电场刺激下离解大鼠神经元中NEMO传感器的反应(Figure 3)。我们观察到，所有NEMO传感器都能够检测到由单个动作电位(AP)引发的Ca2+信号(Figure 3a)，其峰值SBR大约是gcamp6或gcamp6的两倍。NEMOf足以区分频率高达5 Hz的神经元反应(图3b)。总的来说，NEMO传感器可以作为监测哺乳动物细胞、组织或体内以及植物中Ca2+动态的首选工具。

近日，北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室教授章晓辉团队、北师大生命科学学院教授王友军团队与中国科学技大学教授唐爱辉团队合作开发构建了一类新型的检测钙信号的荧光蛋白探针“尼莫”（NEMO），该探针具有更强和更精准的定量测定性能。近日，该成果在线发表于期刊《自然-方法》。生命体的许多活动都离不开钙离子（Ca2+）信号分子。细胞内钙离子浓度时空变化被称之为钙信号，它控制或调节各种细胞生命活动。开发灵敏和精准的钙信号检测探针工具对探究生命活动相关的信号机制和规律至关重要。在相关领域内被广泛应用的钙探针主要包括有机小分子类探针和遗传编码的（荧光）蛋白探针（GECIs）。目前最被广泛应用的单荧光GECI工具为GCaMPs系列，它由钙感知和荧光反应两大模块组装构建而成。其中，钙感知模块包含钙结合蛋白（如钙调蛋白CaM）及其靶肽（如M13/RS20），产生荧光变化的模块为环化重排的绿色荧光蛋白cpGFP。科学家们发现，通过改变CaM、M13与GFP三个元件之间的连接方式，连接短肽及互作界面中的关键氨基酸等方式，可改善GECIs的表现。因此，在2001年最初构建的GCaMP1版本上多次迭代改造后，至2023年最新发展的GCaMP8系列具备了显著改善的灵敏度和反应速度，但它们的反应幅度，即对钙信号大小的分辨率和线性动态范围始终有待提高。对此，合作团队采用了全新策略构建的新型高灵敏钙离子探针。从增强GECI对钙离子浓度变化的的荧光反应大小出发，合作团队采用亮度更高的新型荧光蛋白mNeoGreen（mNG）来替换广泛使用的cpGFP，结合多种设计及优化策略组合，构建了含几十个候选复合分子的GECI库，并通过系统的钙离子成像筛选和体外鉴定后，最终获得到了一组名为NEMO的新型GECI探针。与现有的GCaMP系列探针相比，NEMO探针的灵敏度及钙响应幅度有了显著提升，在领域中首次实现GECI探针对细胞内钙信号的反应幅度超过100倍；同时具有更好的抗光淬灭能力与pH稳定性，并能实现对钙离子水平的绝对定量检测。合作团队进一步在对非兴奋性细胞系、分离培养的大鼠神经元、小鼠脑内神经元在体双光子激光成像和深部脑区光纤记录等测试中发现，相比于最新或最广泛使用的GCaMP8s或GCaMP6s，NEMO系列对胞内钙信号的反应速度相当，但更灵敏并具更高的信噪比，且反应幅度提高达约10倍之多。

1月3日，国际学术期刊PNAS发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌组和复旦大学附属中山医院王立新教授合作的研究成果“Genetic dissection of intercellular interactions in vivo by membrane-permeable protein”。该研究利用表达膜透过性荧光蛋白的遗传工具小鼠，建立了体内邻近细胞标记技术，并利用该技术揭示了肝脏不同区域中内皮细胞的异质性。细胞之间的相互作用对于多细胞生物体生长发育、稳态维持以及损伤修复等过程至关重要，但是监测体内细胞互作的遗传学技术鲜有报道。当前的遗传学手段基本上是针对特定细胞自身进行操作，无法深入研究细胞之间的互作。因此，建立新型邻近细胞标记技术对了解生物体内细胞间互作及其功能具有重要意义。sLP-mCh是脂溶性标签连接mCherry的融合荧光蛋白(Ombrato et al., Nature 2019)。sLP-mCh在供体细胞中表达后，会从供体细胞中释放出去，并进入邻近细胞，将邻近细胞标记为mCherry+。基于sLP-mCh蛋白的特性，为了实现体内邻近细胞标记，研究人员构建了基因敲入小鼠：R26-sLP-mCh-GFP和R26-sLP-mCh。首先以小鼠肝细胞作为供体细胞，表达sLP-mCh和GFP，检测肝细胞周围的其他类型细胞标记情况。研究人员在R26-sLP-mCh-GFP小鼠体内注射特异靶向肝细胞的病毒AAV2/8-TBG-Cre，当病毒进入肝细胞后，Cre重组酶表达并发生Cre-LoxP重组，移除R26-sLP-mCh-GFP位点中间的终止序列，肝细胞启动表达sLP-mCh和GFP荧光蛋白，成为sLP-mCh的供体细胞。研究人员发现肝细胞为GFP+mCherry+，同时也能检测到GFP–mCherry+的非实质细胞，其中肝脏中80%内皮细胞、76%免疫细胞以及54%成纤维细胞被标记。研究人员将这种由Cre诱导的细胞间蛋白标记技术称作CILP。肝脏的基本单位是肝小叶，肝小叶可以分为三个区域(zone)，各区域的肝细胞具有不同特性以及分子标记。一区的肝细胞围绕着肝脏门静脉，高表达钙粘蛋白E（E-Cad）；三区的肝细胞围绕着肝脏中央静脉，高表达谷氨酰氨合成酶（GS）；肝小叶二区位于一区和三区之间，由E-Cad–GS–的肝细胞构成。肝脏中的毛细血管是一类特化的血管网络，称作肝血窦内皮细胞，肝血窦内皮细胞和肝细胞发生着紧密的相互作用，肝脏不同区域的肝细胞可能会受到内皮细胞不同程度的影响。研究人员然后以Mfsd2a+肝细胞为例阐明肝细胞及其邻近内皮细胞之间的互作。当用他莫昔芬诱导双基因型成体小鼠Mfsd2a-CreER R26-sLP-mCh后，Mfsd2a+肝细胞启动sLP-mCh的表达，成为供体细胞。研究人员发现在门静脉周围出现聚集的mCherry信号，且存在mCherry+CDH5+细胞，表明Mfsd2a+肝细胞作为供体细胞表达sLP-mCh后，周围的内皮细胞也被标记为mCherry+。研究人员发现这部分内皮细胞主要分布在门静脉周围，在肝小叶一区中超过90%的内皮细胞为mCherry+，在二区中大约30%的内皮细胞为mCherry+，在三区中几乎检测不到mCherry+的内皮细胞。从以上可知，研究人员通过CILP技术，并结合Mfsd2a-CreER小鼠，实现了肝小叶内皮细胞的区域性标记，高效地标记了肝门静脉周围内皮细胞。为了进一步分析肝脏中不同区域内皮细胞的差异，研究人员利用FACS将mCherry阳性和阴性内皮细胞分选并进行转录组测序。通过主成分分析显示，这两群内皮细胞分别成群，互相具有较大差异。门静脉周内皮细胞的特征基因Dll4、Lama4、Msr1和Ltbp47在mCherry+内皮细胞中显著上调，中央静脉周内皮细胞特征基因Rspo3、Wnt9b、Cdh13和Thbd7在mCherry–内皮细胞中显著上调。对差异基因进行热图分析显示，与血管新生、调节细胞黏附和生长因子应激相关基因的表达在mCherry+内皮细胞中显著上调，而与胞外基质组成、化学趋化和组织形态发生相关基因的表达在mCherry+内皮细胞中显著下调。综上，研究人员开发了一种体内邻近细胞标记新技术CILP。CILP利用了一种细胞膜透过性的荧光蛋白，当这种荧光蛋白在供体细胞中表达后，可以释放到细胞外，并进入邻近细胞，从而实现对邻近细胞的标记。研究人员利用CILP技术成功标记了小鼠肝脏中肝细胞的邻近细胞，并利用Mfsd2a+肝细胞作为供体细胞，标记并分析了肝脏门静脉周内皮细胞的特征。分子细胞卓越中心博士后张少华为该论文的第一作者，分子细胞卓越中心周斌研究员和复旦大学附属中山医院王立新教授为该论文共同通讯作者。该工作得到了香港中文大学吕爱兰教授和西湖大学何灵娟研究员的大力支持。感谢分子细胞卓越中心动物平台和细胞分析技术平台对本研究的大力支持，感谢中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部门的经费支持。图：（A）sLP-mCh荧光蛋白从供体细胞进入受体细胞。（B和C）遗传工具小鼠构建以及实验策略。（D–F）以肝细胞作为供体细胞表达sLP-mCh，肝脏中非实质细胞被标记为mCherry+。（G和H）sLP-mCh被用于在胰腺和心脏中标记邻近细胞。

绿色荧光蛋白极化激元激光原理示意图：将活细胞产生的绿色荧光蛋白填充在微光腔中制成一层薄膜，光和电子能量混合产生准粒子。　　一个由英德科学家组成的研究团队在最近出版的《科学进展》杂志上发表论文称，他们首次将水母体内的荧光蛋白基因插入大肠杆菌基因组，利用转基因大肠杆菌产出了增强型绿色荧光蛋白(eGFP)并用来产生激光。研究人员指出，这一突破代表着极化激元激光领域的重大进步，其效率和光密度都比普通激光高得多，有望为研究量子物理学和光学计算开辟新途径。　　据美国趣味科学网日前报道，传统的极化激元激光器用无机半导体做增益介质，必须致冷到极低温度 而有机发光二极管(OLED)显示器中的有机电子材料能在室温下工作，但需要有皮秒(万亿分之一秒)光脉冲来供能。研究团队开发的新激光器也能在室温下工作，但只需纳秒(10亿分之一秒)脉冲。　　极化激元激光来自一种量子凝聚现象：激光增益介质中的原子或分子反复吸收发出光子，产生一种叫做极化激元的准粒子，在一定条件下变成一种联合量子态，从而发出激光。理论上极化激元激光需要的能量更少。　　研究人员把转基因大肠杆菌产生的eGFP填充在许多光微腔里，作为一种“光泵”，能以纳秒速度发出闪光，使整个系统达到产生激光所需的能量。“光泵”能在达到激发阈值后，给设备注入更多能量以产生传统激光。该激光发明人之一、苏格兰圣安德鲁大学物理与天文学院教授马尔特盖瑟说，皮秒脉冲的能量更合适，但制造起来要比纳秒脉冲难1000倍，他们的做法简化了很多制造工序。　　盖瑟还指出，新方法的一个关键优点是，蛋白质分子的发光部分被一种纳米大小的圆柱形外壳保护着，让它们彼此间不会互相干扰，分子结构很适合在高亮度下工作，更容易发出激光。但目前的激发阈值还太高，今后经过改进，最终可让极化激元激光器的激发阈值比传统激光器低得多，这样效率会更高，发光更致密。

近日，中科院大连化物所蛋白质折叠化学生物学创新特区研究组（02T5组）刘宇研究员团队和生物分子高效分离与表征研究组（1810组）张丽华研究员团队合作，通过发展新型仿生荧光共价键探针和质谱表征方法，发现了蛋白质聚集态界面具有化学反应活性，可用于相变蛋白质的标记与成像。　　蛋白质在人体内的相变过程会诱发多种退行性疾病，例如帕金森症、阿尔兹海默症、渐冻人症和老年性心衰等。针对上述疾病，刘宇团队致力于发展新型化学生物学工具用于观察蛋白质的相变过程和疾病的早期诊断，张丽华团队一直关注胞内相变蛋白质的质谱组学解析。然而，致病蛋白质通常由于发生相变处于无序结构状态，其特异性识别和检测具有挑战性。因此，发展新的化学方法识别和捕捉相变致病蛋白质对疾病的早期诊断和治疗有着重要的意义。　　在前期工作（Anal. Chem.，2021）的基础上，该合作团队保持了红色荧光蛋白骨架分子对相变蛋白质分子的选择性结合能力和荧光激活效应，通过模仿Kaede光转化荧光蛋白的作用机理，逆向设计了具有迈克尔加成反应活性的新型荧光分子探针。该类新型探针可与早期错误折叠的蛋白结合发出红色荧光，在进一步相变聚集过程中发生迈克尔加成反应，荧光信号进而由红光转为绿光。团队通过定点突变技术和高分辨质谱分析，揭示了相变蛋白和探针分子的共价反应机制，蛋白质错误折叠过程中半胱氨酸的微环境变化、蛋白聚集紧实度的不同、探针反应活性强弱等因素均会影响该反应的进程。基于该化学特性，团队拓展了基于孔雀绿的新型荧光变色分子，并论证了该共价键反应的普适性和可调控性。同时，团队使用该探针，展示了细胞内蛋白质组在药物刺激下从早期错误折叠到晚期聚集的相变过程。该工作首次揭示了蛋白质相变界面的化学反应活性，对未来设计质谱探针和药物分子提供了新的策略和思路。　　上述成果于近日发表在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。该工作得到国家自然科学基金、辽宁省兴辽人才计划、大连市科创基金、博士后面上基金、国家重点研发计划等项目的资助。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所马英新课题组在国际学术期刊 Sensors and Actuators B: Chemical 上发表了题为：Construction of ratiometric Si-Mn:ZnSe nanoparticles for the immunoassay of SARS-CoV-2 spike protein 的研究论文。 该研究开发了一种比率型荧光探针（Si-Mn:ZnSe NPs），通过结合酶联免疫反应（ELISA）模型，建立了一种新冠病毒（SARS-CoV-2）刺突蛋白（S蛋白）的免疫荧光检测方法。 以SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒作为实际样本考察该方法的传感性能，结果显示该方法对SARS-CoV-2假病毒响应特异性良好，具有与商品化试剂盒相当的检测灵敏度，为诊断SARS-CoV-2感染提供了一种可靠的潜在思路。 S蛋白是新冠病毒侵染过程中的关键成分，具有识别目标细胞和促进膜融合的作用。因此，快速检测S蛋白对新冠疫情的防控至关重要。 目前，新冠感染早期诊断的主流方法有三种，包括分子检测（检测病毒RNA）、抗体检测（检测IgG和IgM抗体）和抗原检测（检测病毒蛋白）。相比其他两种方法，抗原检测特异性好且反应时间短，在大批量SARS-CoV-2阳性筛查中，已得到广泛应用。当下市场上的抗原自测试剂盒多数依托胶体金免疫测流层析技术，灵敏度低限制了其应用场景。 量子点（QDs）具有吸收光谱宽、斯托克斯位移大、荧光强度高和生物毒性低的优势，是一类理想的荧光探针，在生化分析领域得到广泛应用。据研究，荧光法的灵敏度是比色法的10~100倍，荧光免疫分析有望提升病毒抗原检测的灵敏度。本研究构建的比率荧光法采用Si-Mn:ZnSe NPs双发射探针，相当于在检测系统中添加了一项内标校准，解决了单发射探针强度受环境变化、探针浓度变化和仪器波动的影响较大的局限性，具有灵敏度高、稳定性好的优点。图2：（A）Si-Mn:ZnSe NPs探针构建；（B）比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2 S蛋白原理。通过形成固定化CAT的免疫复合物，可将检测S蛋白含量转化为检测体系内H2O2含量。 根据上述原理图，该团队通过Si dots和Mn:ZnSe QDs的自组装作用制备了Si-Mn:ZnSe NPs探针。首先考察了Si-Mn:ZnSe NPs的荧光强度对H2O2浓度的响应。随着H2O2浓度从0μmol/L增加到50μmol/L, Si-Mn:ZnSe NPs在610nm处的荧光被明显猝灭，而440nm处的荧光没有明显变化。这证明通过比率荧光的方法检测体系中的H2O2浓度是可行的（图3）。过氧化氢酶（CAT）可以催化H2O2分解，因此，CAT介导的ELISA可以用于S蛋白的免疫分析。图3：Si-Mn:ZnSe NPs对H2O2响应的荧光光谱 在最优反应条件下，S蛋白浓度与Si-Mn:ZnSe NPs的荧光强度比呈线性关系。如图4A和4B所示，随着S蛋白浓度从0.05ng/mL增加到300ng/mL, Si-Mn:ZnSe NPs在610nm处的荧光发射强度逐渐增强。如图4C所示，lg（S）与荧光信号比（F610/F440）在0.05~10ng/mL范围内呈良好线性关系（y = 0.2318x + 0.3378, R2 = 0.9904）。图4D显示，S蛋白浓度与荧光信号比（F610/F440）在5~50ng/mL范围内呈良好线性关系（y = 0.0116x + 0.4479, R2 = 0.9987）。本方法对S蛋白检出限为0.032ng/mL。图4：不同浓度SARS-CoV-2 S蛋白存在下Si-Mn:ZnSe NPs的荧光光谱（A）与信号比（B）；SARS-CoV-2 S蛋白浓度与荧光信号比的线性拟合（C-D） 前期工作中，该团队将SARS-CoV-2 S蛋白整合到HIV假病毒合成系统中，构建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒（ACS Appl. Mater. Interfaces, 2021, 13, 21, 24477-24486.）。 本研究以上述SARS-CoV-2 S蛋白假病毒作为实际样本模型考察了本方法的准确性与重现性，并与商品化试剂盒检测结果进行对比（图5）。结果显示，所建比率荧光ELISA法测定的S蛋白浓度与商品化试剂盒相似，表明该方法具有较高准确性。构建VSV-G假病毒作为阴性对照，采用比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒中的S蛋白，结果如图6所示，10组SARS-CoV-2假病毒均有检出，而10组VSV-G假病毒均无检出，表明该方法对SARS-CoV-2 S蛋白检测具有较高的特异性。图5：商品化试剂盒和本方法测定SARS-CoV-2假病毒S蛋白的结果。n.s.表示不显著，*表示p＜0.05。图6：比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒S蛋白的结果 本研究以水热法制备了Si dots，水浴法制备了Mn:ZnSe QDs，通过二者静电相互作用自组装合成具有良好pH稳定性和光稳定性的Si-Mn:ZnSe NPs。H2O2可以特异性猝灭探针位于610nm处的荧光而对440 nm处的荧光无影响。在ELISA体系中，通过固定化CAT免疫复合物巧妙地将检测S蛋白浓度转化为检测体系内H2O2浓度。结果显示，在0.05~10ng/mL和5~50ng/mL浓度范围内，S蛋白浓度与荧光信号比（F610/F440）呈良好线性关系，检出限为0.032ng/mL。构建SARS-CoV-2假病毒作为实际样本模型，所构建方法的检测结果与商品化试剂盒相当。综上，所构建的比率荧光ELISA方法对SARS-CoV-2 S蛋白具有较高准确性和特异性，可作为一种新型诊断方法协助病毒感染筛查。

日本研究人员最近人工合成一种可发出荧光的蛋白质，能够用来快速检测地下水等水源中是否含有砷、镉和铅等有害金属。这种检测技术成本低，操作简便，研究人员希望一两年内将其实用化。 　　日本宇都宫大学副教授前田勇宇在国际学术刊物《生物传感器与生物电子学》网络版上发表论文说，他将容易与有害金属结合的“反式作用因子”与绿色荧光蛋白融合，制造出可发出荧光的人工合成蛋白质“GFP-反式作用因子”。 　　检测时，让这种人工合成蛋白质与地下水等样品混合，然后使其通过特制的多孔平板进行过滤。约15分钟后，用重蒸馏水清除出平板上与有害金属结合的人工合成蛋白质。样品中的有害金属越多，被清除出的人工合成蛋白质也越多，附着在平板上的荧光的程度也越低，反之则越高。具体荧光数值可使用仪器读取，从而检测出样品中有害金属含量。 　　这种人工合成蛋白质呈粉末状，容易保存，检测装置可随身携带。前田勇宇说：“利用这种检测技术目前只能检测出砷、镉和铅三种金属。希望今后能够进一步检测出其他有害金属，并把检测时间缩短到5分钟左右。”

老年神经退行性疾病，如阿尔茨海默症(AD)、肌萎缩性侧索硬化症、Ⅱ型糖尿病等，目前困扰着全大约5亿人，且这个数字仍在不断迅速增长。尤其是阿尔兹海默症（占70%以上），目前仍未有行之有效的诊断方法，因此无法得到有效的治疗或预防。尽管当代病理学研究已经证实这种病理变化与具有神经毒性的β淀粉样蛋白质的聚集有关，但其在神经元或脑组织中的聚集机制目前尚不清楚。现有的方法, 如电子显微镜、免疫电子显微镜、共聚焦荧光显微镜、超分辨显微镜，通常都需要对样品进行化学加工（标记染色等）,可能会对淀粉样蛋白结构本身造成影响。而非标记方法，如表面增强拉曼光谱（SERS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）, 前者受限于亚细胞水平上的低信噪比、自发荧光及不可逆的光损伤，后者其空间分辨率受限于红外光波长（?5–10 μm），且光谱可解译性和准确性受到弹性细胞光散射所产生的米氏散射效应(Mie scattering effects)的严重影响，使得直接在亚微米尺度上研究淀粉样蛋白质在神经元内的聚集行为十分困难。美国Photothermal Spectroscopy（PSC）公司开发的全新非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage， 是基于的光学光热诱导共振（O-PTIR）技术，它克服了传统FTIR技术的衍射限和米氏散射效应，红外光谱空间分辨率高达500 nm，且无需对样品进行标记, 不再需要衰减全反射（ATR）技术进行厚样品测试，且能够无接触和无损探测样品，全程对样品无污染，可以帮助科研人员更全面地了解亚微米尺度下样品表面微小区域的化学信息，使得在亚细胞水平揭示生物分子结构成为了可能。美国Photothermal Spectroscopy（PSC）公司开发的全新非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage（如图1A所示），使用可见探测束（532 nm）来测量样品在脉冲红外光束照射下的红外光热响应，具体体现为样品反射率的变化，由于使用了可见光作为检测光，使得其空间分辨率不再依赖于入射红外光的波长，且单一特定探测光束的使用还可以消除米氏散射效应。 图1. (A) 美国PSC公司非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage实物图；（B）亚微米红外成像示意图：神经元树突的AFM形貌图,其中神经元直接在CaF2基底下生长。mIRage采用两束共线性光束: 532 nm可见(绿色)提取光束和脉冲红外(红色)探测光束，样品的光热响应被检测为样品由于对脉冲红外光束的吸收而引发的绿色光部分强度的损失，使红外检测的空间分辨率提高到?500 nm. (C) 小鼠大脑皮层初神经元, 在CamKII促进下表达为tdTomato荧光蛋白，使得神经元结构填满红色，图片标尺为20 μm。(D) 图C区域放大图片，箭头指示树突上的神经元刺。因为上述的巨大技术优势和突破，非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage在生物学领域技术有广泛的应用前景和潜力，可应用于诸如细胞学研究（蛋白质、磷脂结构分析，红细胞、巨噬细胞成像等），临床致病菌/病原微生物鉴定，癌症诊断（细胞/组织），牙科/骨病变/眼科检测，生物大分子损伤，生物组织识别，以及生物药物检测，法医学等。近日，瑞典隆德大学的Klementieva教授团队与美国PSC公司的Mustafa Kansiz博士合作，使用全新非接触式亚微米分辨红外测量系统在亚微米尺度上研究了淀粉样蛋白沿着神经突直到树突棘的聚集行为（图1B和C），这是以往的实验技术手段所不可能实现的。在该研究中，他们使用了大脑皮层初神经元，这是因为它们易发生AD病变，且具有特的结构。初神经元的这种形态特征使得可以在单个神经元层面上来测试全新非接触式亚微米分辨红外测量系统的分辨率和准确性。先，他们在反射模式下获得了高质量的红外光谱，且不受米氏散射或基线失真等人为因素的干扰(图2A,B)。值得注意的是，全新非接触式亚微米分辨红外测量系统其约为400 nm的横向分辨率，使得他们能够通过比较1740 cm-1处的峰强度来检测脂质含量的差异，以及通过对比酰胺II (1540 cm?1)与酰胺I特征峰强度(1654 cm?1)的比值来比较氨基酸(蛋白质)的种类和数量上的差异(图2C,D)。这是科学家们次获取单个树突棘的高分辨率的化学图像和红外光谱，以往其它测试方法是无法做到的。图2. 使用非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage观察初神经元结构。 (A) 在1650 cm-1处获得的神经元的红外图像，显示了蛋白质的分布 (B)中对应原始红外光谱的位置用数字和圆点表示，图片标尺为20 μm；（C）在1650 cm-1处获得的树突的红外图像，数字表示D图中获得光谱的位置，图片中标尺为20 μm；（D）在C图中两点处取的归一化红外光谱,体现了该方法的亚微米空间分辨率。红色箭头表示蛋白质结构的化学变化。为了在亚细胞层面上定位神经元中β片层结构，作者对APP-KO神经元进行了为时半小时的合成Aβ(1-42)处理（2×10?6 M），并使用非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage进行了化学结构的成像分析（图3A）。对Aβ处理后的APP-KO神经元的红外光谱进行分析证实，β片层结构可以在亚细胞水平上进行分辨。有趣的是,纯Aβ(1-42)纤维在1625 cm-1位置处有特征的红外峰，当加入到神经元结构中后，β片层结构的特征峰移动到1630 cm-1处，表明淀粉样原纤维结构发生了变化，可能是由于其与细胞蛋白和/或细胞膜发生相互作用导致的（图3B, C）。基于该发现，我们可以得出，在神经元中的淀粉样蛋白的构型变化可能会引发阿尔茨海默症进程中的不同机制。为进一步了解其形成机制，更多的方法学研究变得更加必要，如将非接触式亚微米分辨红外与免疫荧光显微镜结合起来，这种多模态成像模式可以在不同的细胞层面上更详细分析特征蛋白的结构变化，如前突触或后突触，囊泡(溶酶体或内溶酶体)或其他细胞器。图3. 使用非接触式亚微米分辨红外测量系统Mirage观察β片结构在处理后的初神经元中的聚集行为。（A，B）APP-KO初神经元在1650和1630 cm-1处的明场和光热红外成像，彩色标度表示光热振幅的强度，从小值(蓝色)到大值(红色)，阈值为50%(以0为中心)，插图为放大或叠加后的红外成像图，图片标尺为20 μm；（C）神经元中淀粉样蛋白结构在2×10?6 M Aβ(1-42) (红色)处理或不处理(绿色)后分别对应的红外光谱。β片结构对应的特征红外峰用红色箭头表示，光谱数据点间距为2 cm?1，数据进行50次均一化处理。综上所述，借助全新非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage，科学家成功次揭示了初神经元的分子结构，无需标记，且因为该技术是在非接触模式下工作，不会对神经元造成损伤，这在研究脆弱或粘性的物质时显得尤为重要。另外，该技术还能获得亚微米尺度的红外光谱，且不含由于背景失真或米氏散射造成的散射伪影。新的技术进步表明，全新的非接触式亚微米分辨红外测量系统mIRage现在可以用来做活细胞成像,并保持相同的亚微米空间分辨率。在这种情况下，全新的非接触式亚微米分辨红外测量系统有望在β片层结构在活神经元的突触附近的化学成像中发挥关键作用，并提供一个新的机会来研究神经毒性淀粉样蛋白如何从一个患病的神经元传播到一个健康的神经元，揭示阿尔茨海默症的形成和发展机制。该工作发表在2020年的Advanced Sciences上（DOI: 10.1002/advs.201903004）。

近日，中科院大连化学物理研究所生物技术研究部分子探针与荧光成像研究组(1818组)徐兆超研究员团队和新加坡科技设计大学刘晓刚教授团队合作，发展了一种全分子多因素调控荧光团TICT的方法，设计出具有宽动态响应范围和梯度敏感性的荧光传感器阵列，应用于Aβ蛋白聚集动力学的监测。该方法基于荧光分子的发光构效关系，通过实验和理论相结合的方式，深入理解分子发光机理，为工程化创制高性能的荧光分子提供了新思路和新方法。 　　通过抑制荧光分子受光激发后的扭转分子内电荷转移(Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT)，可以开发出高亮度、高稳定性的荧光团。调控荧光团TICT性能可以设计具有不同敏感性的荧光探针以满足探测生理环境多样性的需求。分子工程方法依靠单个影响因素来调控TICT，如电子供体的供电子能力或共轭体系大小等，一直以来缺乏从分子结构整体来系统发现和考量多种影响因素。 　　针对这一问题，本工作中合作团队通过理论计算和实验验证，首先发现多个结构因素对荧光团TICT态存在影响，包括发色团共轭链长度、分子是否带电、供体模块的供电性以及供体和发色团之间的几何结构的预扭转等。 　　进一步，研究团队以广泛应用于蛋白质检测、粘度或pH指示剂的半花菁类荧光团为研究骨架，将多重影响因素系统考量指导分子结构改造，设计合成了15种半花菁衍生物荧光阵列，发光颜色涵盖整个可见光区(444至735nm)，并具有梯度灵敏度和不同动态响应范围(粘度响应系数从0.46到0.97)。这种阵列的宽动态响应范围和梯度敏感性得益于荧光分子结构的多样性，最终实现了对Aβ蛋白聚集不同阶段动力学的监测以及对形成的Aβ纤维的荧光成像。徐兆超团队在理解和调控TICT这一淬灭荧光的光物理过程中做了系统性工作：通过结构改造，抑制了TICT并创制了多种高亮度的荧光染料(J. Am. Chem. Soc.，2016)；发现了一种新型的光诱导分子内电荷转移机制(Angew. Chem. Int. Ed.，2019)；实现了准确预测不同类型荧光染料TICT态的方法(Angew. Chem. Int. Ed. ，2020)；近期也对该领域的进展做了系统性的综述(Chem. Soc. Rev.，2021)。 　　相关研究成果以“Monitoring Amyloid Aggregation via Twisted Intramolecular Charge Transfer (TICT)-Based Fluorescent Sensor Array”为题，于近日发表在《化学科学》(Chemical Science)上。该工作的第一作者是1818组博士后王超和博士研究生江文钞。上述工作得到国家自然科学基金、我所创新基金等项目的资助。

Gasdermin蛋白是人类细胞中在细胞膜上打孔，释放免疫因子并诱导细胞死亡的关键因子。Gasdermin打孔的机制是由caspase介导的，在炎性小体信号传导过程中触发，对防御病原体和癌症至关重要【1】。人类中Gasdermins家族由六个成员组成，GSDMA–GSDME以及pejvakin。但是各种各样的Gasdermin蛋白在进化上的起源以及生物学作用仍然不甚清楚。为此，美国哈佛大学医学院Philip J. Kranzusch研究组与以色列魏茨曼研究所Rotem Sorek研究组合作在Science发文题为Bacterial gasdermins reveal an ancient mechanism of cell death，揭开了细胞焦亡作为细菌以及动物中共有的一种古老的、调节细胞程序性死亡的方式。通过序列分析，作者们发现与哺乳动物Gasdermin蛋白相似不同50个细菌来源的蛋白，其中作者们测定了来自慢生根瘤菌嗜热菌（Bradyrhizobium tropiciagri）和Vitiosangium sp的bGSDMs的晶体结构，结果显示bGSDMs的总体结构都是共享的，与哺乳动物Gasdermin N末端结构具有显著的同源性（图1）。晶体结构分析同时也显示在哺乳动物Gasdermin蛋白中C末端结构，会维持该蛋白处于一种自我抑制的状态；虽然bGSDMs中没有与哺乳动物中Gasdermin蛋白C末端结构相似结构，但是仍然具有自我抑制结构特征（图1）。图1 对细菌来源的Gasdermin蛋白进化保守型以及结构分析随后，作者们想知道bGSDMs在细菌系统中是否有抗噬菌体的功能，作者们发现bGSDMs对大肠杆菌噬菌体具有显著的抵抗性。因此，bGSDMs是细菌“防御工事”中的关键组分。另外，作者们发现bGSDM的激活会诱导细菌细胞膜的破坏，而且在其激活过程中需要蛋白酶的参与，因为引入蛋白酶靶向位点的突变会废除bGSDM的细胞毒性（图2）。图2 蛋白酶参与bGSDM的激活进一步的，作者们对bGSDM的切割过程进行探究。作者们发现bGSDM的切割需要蛋白酶的催化，但是并不需要棕榈酰化修饰。另外，通过质谱分析作者们鉴定到了古字状菌属的Runella中bGSDM的具体切割位点以及处于自我抑制状态的结构生物学基础。通过构建绿色荧光蛋白的融合蛋白，作者们对bGSDM激活的动态过程进行的监测。作者们发现在激活过程中会由弥散分布的形式变成与膜结构存在联系的点状结构，通过透射电镜的检测可以观测到bGSDM切割后会导致细胞膜完整性的破坏，并导致细胞内容物的快速释放。图3 工作模型总的来说，该工作的建立了细菌与哺乳动物中Gasdermin蛋白打孔从而导致的细胞程序性死亡的具体模型（图3），证明了细菌中bGSDM系统可以发挥防御作用，并且该作用依赖于蛋白酶的参与，该工作将有助于深入了解细胞焦亡的具体作用机制以及在进化上的起源。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj8432

三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、腺苷（Adenosine，Ado）等嘌呤类分子细胞内外广泛存在。胞内的嘌呤类分子主要负责调控细胞能量代谢等过程；而胞外的嘌呤类分子则作为信号分子（被称为“嘌呤类递质”），通过作用在其相应受体调节呼吸调控、味觉感受、睡眠等生理活动；嘌呤类递质及其受体还参与调节癫痫、疼痛、炎症反应、脑外伤和缺血等病理状态。此外，嘌呤能信号失调还与抑郁、精神分裂症等精神类疾病密切相关。迄今，解密嘌呤能信号传递功能的一大技术瓶颈是缺乏灵敏、特异且非侵入性的工具，以高时空分辨率地报告嘌呤类递质的动态变化。 2021年12月22日，北京大学李毓龙实验室在Neuron杂志在线发表了题为A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo的研究论文，报道了新型基因编码的ATP探针GRABATP1.0的开发和在体外及活体动物的应用。李毓龙实验室自2018年以来，先后开发了针对乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、腺苷、五羟色胺、内源大麻素等神经递质或调质的荧光探针，此次发表的GRABATP1.0是其又一力作，进一步扩展了GRAB系列荧光探针家族。 在这一工作中，李毓龙实验室运用其先前设计的GRAB探针策略（GPCR Activation-Based sensor)，基于人源ATP受体P2Y1和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了ATP探针GRABATP1.0（简称为ATP1.0）。在体外培养的HEK293T细胞、原代神经元及星形胶质细胞中，ATP1.0探针均表现出优异的细胞膜定位。神经元表达的ATP1.0对外源加入的ATP及ADP有~780%的信号响应、~80 nM的亲和力（EC50），及高度的分子特异性。此外，ATP1.0能够在亚秒级别响应胞外ATP浓度的变化。ATP1.0探针能否用来检测内源释放的ATP呢？作者从原代培养的海马细胞入手，发现ATP1.0能够检测到机械刺激及低渗透压刺激引发的ATP释放，药理学实验及突变型探针实验进一步验证了ATP1.0检测信号的特异性。有意思的是，在不给予额外刺激时，ATP1.0也能灵敏地记录到直径约为30微米的自发性ATP释放事件，表明ATP的释放具有化学分子特异和空间特异性。 ATP1.0探针能否在活体动物加以运用呢？过去的研究发现，当细胞受到损伤时，胞内毫摩尔级别的ATP被释放胞外，作为“危险信号”被周围的胶质细胞感受，从而激活小胶质细胞释放趋化因子等，产生免疫反应。胶质细胞上表达的嘌呤类受体在小胶质细胞激活、迁移及分泌信号因子过程中发挥重要作用。那么，在这一过程中，信号分子ATP的传播和小胶质细胞的迁移是如何动态并变化的？作者将ATP1.0探针表达在斑马鱼中，通过激光照射引发局部损伤时发现ATP的释放呈现“波状”传播；通过将绿色ATP1.0探针表达在红色荧光蛋白标记小胶质细胞的转基因斑马鱼中，能够直观地检测到随着ATP信号的传播小胶质细胞的迁移过程（图1上）。 图1：ATP1.0报告斑马鱼受到局部损伤时及小鼠发生免疫反应时大脑中的胞外ATP信号当大脑处于疾病状态时，ATP的释放又会呈现什么样的变化？如上所述，嘌呤能信号在免疫中扮演着重要角色。为了检测免疫反应过程中大脑中ATP信号的变化，作者通过腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的方式引发小鼠的系统性免疫反应，同时通过AAV病毒介导的方法将ATP1.0表达在小鼠的大脑皮层，并借助双光子成像记录ATP的信号。有意思的是，LPS注射后，小鼠大脑皮层呈现出强烈、但空间特异的ATP信号上升现象。除了开发高灵敏的ATP1.0探针外，作者还开发了反应动力学更快及亲和力更低的ATP探针ATP1.0-L。在神经元中表达的ATP1.0-L对胞外的ATP的亲和力（EC50）约为32 μM。当在原代培养的海马细胞及活体的斑马鱼中表达，ATP1.0-L均能检测到更加局部的ATP信号。 综上所述，在这项工作中作者开发了新型遗传编码的ATP荧光探针，实现了对胞外ATP的高时空分辨率的记录。在此之前，李毓龙课题组在2020年还开发了另外一种嘌呤类递质腺苷的GRAB荧光探针，并助力中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心徐敏团队在睡眠调控中的研究。相信一系列新型成像工具的开发，将助力科学家更加深入地研究嘌呤能信号传递在生理和病理条件下的功能和调控机理。

尽管针对病毒感染的高度敏感诊断测试取得了很大进展，但其仍需要复杂的技术来准备样本或解释结果，这使得它们在医疗资源稀缺地区的推广变得不切实际。发表在15日《ACS中心科学》杂志上的一种灵敏的方法，可在短短20分钟内分析病毒核酸，且可使用“夜光”蛋白质一步完成。萤火虫的闪光，琵琶鱼发光的“诱饵”，浮游植物覆盖的海滩出现幽灵般的蓝色，都是由同一种被称为生物发光的科学现象驱动的。涉及萤光素酶蛋白的化学反应会产生发光的效果。这种萤光素酶蛋白已被整合到传感器中，当它们找到目标时，这些传感器会发出易于观察的光。这种简便操作性使这些类型的传感器成为现场即时诊断测试的理想选择，但到目前为止，它们还缺乏高灵敏度，而CRISPR基因编辑技术需要许多步骤和额外的专门设备来检测复杂、噪音样本中的低信号。荷兰埃因霍温理工大学研究小组使用CRISPR系统相关的蛋白质，将它们与一种生物发光技术结合起来，这种技术的信号只需一台数码相机就能检测到。为了确保有足够的RNA或DNA样本进行分析，研究人员进行了重组酶聚合酶扩增（RPA)，这是一种在大约38℃的恒温下工作的简单方法。使用发光核酸传感器（LUNAS）的新技术，两个CRISPR/Cas9 蛋白对病毒基因组的不同相邻部分具有特异性，每个蛋白都有一个独特的萤光素酶片段附着在它们上面。如果研究人员正在测试的特定病毒基因组，这两个CRISPR/Cas9蛋白将与目标核酸序列结合并相互靠近，从而使完整的萤光素酶蛋白在化学底物存在的情况下形成并发出蓝光。当对从鼻拭子收集的临床样本进行测试时，RPA-LUNAS在20分钟内成功检测到新冠病毒RNA，即使在每微升200份拷贝的浓度下也是如此。

&ldquo 三聚氰胺&rdquo 尚未淡出人们的记忆，另y起乳制品中非蛋白胺物质残留事件又成为人们近日热议的话题。非蛋白胺物质是对尿素、缩二脲、双氰胺等含氮量高且性质稳定的物质的总称。基于目前g家标准规定的蛋白质含量测定方法&mdash 凯氏定氮法，食品中如残留此类物质，均会被折算成蛋白质含量。如果此类物质的检测不能得到足够的重视，会危及相关行业的发展，并成为危害人体健康的隐患。 百灵威集成全球资源，提供全套分析检测方案，特别适合乳制品、豆浆和鸡蛋等高蛋白含量食品中此类物质的检测。 分析方法 1、样品前处理 称取试样0.5-1.0 g与10 mL具塞离心管中，加入3.0 mL温水c声，再加入7.0 mL乙腈涡旋，以 6000r/min转速于-10℃冷冻离心20 min，吸取清液5.0 mL，氮气吹干，用1.0 mL 70%乙腈溶液复溶，过0.45 &mu m有机相滤膜。 2、色谱分析条件 色谱柱：C18液相柱（250 mm × 4.6 mm, 5 &mu m） 进样量：10 &mu L 流速：1.0 mL/min 检测波长：203 nm 流动相：A为0.2 mmol/L乙酸铵（pH 4.0）；B为乙腈 梯度洗脱程序： 时间 A组分含量 B组分含量 0-3.5 min 70% 30% 3.5-4.0 min 70%-10% 30%-90% 4.0-8.0 min 10% 90%8.0-10 min 10%-0% 90%-100% 3、 质谱条件 电喷雾电离ESI正离子模式，电喷雾电压：4000 V，鞘气压力：30 psi，辅助气压力：5 psi，扫描模式MRM 分析对照品 产品编号 中文名称 CAS 包装 452731 尿素 57-13-6 100 g 571211 缩二脲 108-19-0 5 g 129306 双氰胺 461-58-55 g 耗材与试剂 产品编号 产品名称 包装 531036 乙酸, 99.8% 1 L 944664 乙酸铵, 98% 100 g 932537 乙腈 [LC-MS] 4 L 965057 水 [LC-MS] 4 L S02302 C18液相柱（250 mm× 4.6 mm, 5 &mu m） 2013年5月1日前购买可参与买y送y活动 1 支ZTLMGL-4.1 针筒式滤膜过滤器 Ф13 0.2 &mu m（有机） 100 片/包 WKLM-3 微孔滤膜 Ф50 0.45 &mu m（水相） 100 片/包 901275 瓶口分配器（5.0-50.0 mL） 1 支 958945 单道手动可调移液器（100-1000 &mu L） 1 支 928429 磁力搅拌器（数显、加热、不锈钢） 1 台 5182-0553 螺纹透明样品瓶（蓝色螺纹盖，PTFE红色硅橡隔垫） 100 个/包 5182-0728 聚丙烯螺纹瓶盖（无隔垫） 100 个/包 5183-4759 高j绿色隔垫（带预穿孔） 50 个/包 CER-001-1 1.5 mL标准毛细储存瓶 1 个

2020年7月29日，四川大学生物治疗国家重点实验室作为第一作者单位和通讯作者单位，在Nature 在线发表题为“A vaccine targeting the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 induces protective immunity”的研究论文，这也是Nature杂志发表的首篇新冠疫苗研究论文。研发团队的研究目标是开发出一款通过重组蛋白候选新冠疫苗。在该研究中通过非人灵长类等动物模型的实验表明，这款疫苗能诱发强烈的针对新冠病毒SARS-CoV-2所产生的保护性免疫应答以及产生能够病毒中和抗体。S蛋白是存在于冠状病毒的一类很大的突刺糖蛋白，本研究中，科学家们使用S蛋白的多个不同部分制作了多款候选疫苗，经过测试和比较，他们最终确认，相比S蛋白的细胞外结构域蛋白（ECD）、S1亚基和S2亚基，RBD作为免疫原有最大的病毒中和活性。研究小组最终使用了RBD中编号为319-545的一段氨基酸序列，通过重组蛋白的方式制备新冠疫苗的抗原。研究人员利用了昆虫细胞和杆状病毒表达系统，从细胞培养液中分离提纯了该蛋白，并利用上海勤翔Clinx ChemiScope化学发光成像系统进行了鉴定。（通过Superdex 200凝胶分离柱上重组RBD蛋白的代表性洗脱色谱图。 插图显示洗脱的RBD样品的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析）（小鼠或兔子血清对SARS-CoV-2假病毒感染的中和作用） A图： 将含有SARS-CoV-2假病毒的上清液与来自小鼠的血清预热，将其血清稀释2倍。 在37°C下温育1小时后，将混合物添加到ACE2转染的293T（293T / ACE2）细胞中以检测病毒的感染性。通过荧光显微镜和流式细胞仪确定感染细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达的数量。 三组图片分别是Sera/ RBD组（首次疫苗接种后第14天，用RBD疫苗免疫的5只小鼠的血清）和Sera / PBS组（用PBS作为对照的小鼠的血清），未治疗（感染SARS-CoV-2伪病毒而没有血清）。 B图：在首次免疫后14天，使用与A相同的方法，从兔子的血清中和SARS-CoV-2假病毒的感染。（诱导抗SARS-COV-2中和抗体在转基因hACE2小鼠和野生型小鼠中的活性）与单独用PBS组处理相比，在存在氢氧化铝的情况下，每只小鼠在50μl中用10μg重组RBD蛋白接种免疫转基因hACE2小鼠和野生型小鼠。第二次接种为14天后，从小鼠收集血清。为了评估SARS-COV-2感染的中和作用，将Vero E6细胞（5×10 4）预加载至96孔板中并生长过夜。将100 TCID50（50％组织培养感染剂量）的SARS-CoV-2与等体积的稀释血清预孵育，然后添加到细胞中。在37°C下温育1小时后，将混合物添加到Vero E6细胞中。在显微镜下记录细胞病变效应（CPE），并计算导致完全抑制的血清稀释液的中和滴度。该研究发现由S-RBD结构域319-545氨基酸残基构成的重组疫苗，可在接受单剂接种7或14天之后的小鼠、兔和非人灵长类动物（猕猴）中诱导有效的功能抗体应答。免疫动物的血清在体外阻断了RBD结合域与细胞表面ACE2受体的结合，并中和了SARS-CoV-2假病毒和SARS-CoV-2活病毒的感染。重要的是该疫苗还为受SARS-CoV-2病毒感染的非人类灵长类动物提供了保护，在受到SARS-CoV-2病毒感染的病人体内检测到特异性结合RBD的抗体含量的升高。 几种免疫途径和CD4tT淋巴细胞参与了疫苗抗体反应的诱导。在接种了疫苗的小鼠和猴子没有观察到抗体依赖性肺炎增强或加速出现肺炎的不良反应，因此重组RBD蛋白疫苗是重要的新冠疫苗选择之一。 参考资料：[1] Jingyun Yang et al., (2020) A vaccine targeting the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 induces protective immunity. Nature. 背景：新冠肺炎疫情全球蔓延，对人类健康和社会秩序带来巨大挑战。截至目前（8月4日），据约翰霍普金斯大学发布的实时统计数据，全球累计新冠肺炎确诊病例超过1800万例，死亡人数达69万。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，迫切需要有效的预防这种病毒的疫苗，通过对人群预防接种获得对新冠病毒的免疫力。虽然目前尚未有新冠疫苗正式上市，但在全球抗疫的大背景下，各国都在努力让疫情能够尽快过去。据世界卫生组织7月20日更新的数据显示，目前全球至少有24种新冠病毒疫苗已进入临床研究阶段，另有142种候选疫苗处于临床前研究阶段，为对抗新冠肺炎所作出积极贡献。

聚焦蛋白质互作研究进展与实验方法研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式，是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些？这些检测方法各有什么优缺点?总结如下。1. 生化方法●共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析(需要补充)●蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。GST pull down技术：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。Epitope-tag技术：表位附加标记技术 就是将附加的抗原 融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。 缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用 蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的 有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。 缺点是转膜前需要将蛋白复性。2. 等离子表面共振技术(Surface plasmon resonance)该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3. 遗传学方法使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。●基因外抑制子。基因外抑制子是通过一个基因的突变 来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。 缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。●合成致死筛选 指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。4. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外还有交联技术(cross-linKing)，蛋白质探针技术，噬菌体展示技术(Phage display)以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。

当CRISPR 遇见Namocell---微管蛋白聚合抑制剂与癌症研究最新进展微管蛋白是一种在维持细胞结构和促进细胞分裂中起着关键作用的蛋白质。抑制微管蛋白聚合已被证明是抑制癌细胞增殖的有效策略。在以往的研究中，识别能够抑制微管蛋白聚合的化合物需要利用纯化的微管蛋白或固定细胞的免疫荧光分析进行体外实验。2023年1月29日，美国Harutyun Khachatryan研究团队在Biomolecules杂志发表了文章Identifification of Inhibitors of Tubulin Polymerization Using a CRISPR-Edited Cell Line with Endogenous Fluorescent Tagging of β-Tubulin and Histone H1，提出了一种新的方法来识别微管蛋白聚合抑制剂，利用内源性荧光标记β-微管蛋白和组蛋白H1的CRISPR - Hela细胞系来鉴定微管蛋白聚合抑制剂。该方法有助于研究活细胞内源性蛋白，而不使用细胞固定、免疫染色或重组蛋白过表达。本研究使用β-微管蛋白（mCTover3）、组蛋白H1（mTagBFP2）和p62-SQSTM1（mRuby3）荧光蛋白， 用CRISPR和FAST-HDR载体系统开发HeLa细胞，采用Hana单细胞分离仪（Namocell）进行单细胞分选，使用绿色荧光通道，并分选到96孔板中进行单细胞克隆培养，然后选择一个具有均匀明亮β-微管蛋白荧光的细胞克隆大量扩增得到实验细胞。后续实验通过高内涵成像分析来动态观察微管蛋白聚合情况。用已知的微管蛋白聚合抑制剂、秋水仙碱和长春新碱处理此细胞，并证实了由此产生的微管蛋白聚合抑制的表型变化。此外，作者筛选了429个激酶抑制剂文库，鉴定出三种抑制微管蛋白聚合的化合物（ON-01910、HMN-214和KX2-391）。值得注意的是，研究中采用Namocell 单细胞分离仪帮助作者快速、轻柔、高效地获得活性高的CRISPR - Hela单细胞，利于单克隆培养及扩增，为后续更多实验提供足够的细胞工具。Namocell单细胞分离仪 l 轻 柔 - 压力小于2psi，保护细胞活性l 快 速 - 分选快（1min），初始化快（2min），样本切换快（1min）l 精 准 - 配备2-11色荧光通道，精准捕获目的细胞l 无 菌 - 一次性无菌芯片，隔绝样本污染l 轻 松 - 无需调校，开机即用l 轻 巧 - 体积小巧，方便搬动Namocell 是一家成立于美国硅谷的专注于世界领先的单细胞分选技术的生物仪器公司，2022年7月加入Bio-Techne。公司自主研发的微流控单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床上的应用。我们的单细胞分选仪已在细胞株的构建，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，基因及细胞治疗，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组学等多方面得到广泛的应用。目前Namocell微流控单细胞分选仪已经被世界各大顶尖研究机构及生物制药公司广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如美国国立卫生研究院(NIH)，美国食品药品监督管理局 (FDA)，美国疾病控制与预防中心(CDC)，哈佛大学，斯坦福大学，麻省理工大学，Genentech，Merck，Biogen，BMS，Janssen，Boehringer-Ingelheim等。

脑科学是生命科学领域最尖 端、最前沿的 “终 极疆域”，也是人类最难攻克的“科学堡垒”之一。神经网络是大脑生理活动的结构基础，认识并识别神经元之间的连接方式是当前神经科学研究持续的命题。实时监测神经元的活动、胞外神经递质以及胞内信号分子的动态变化能够帮助我们更好地研究大脑的功能，并助益神经类疾病的治 疗。8月3日，最 新一期「“沃”在前沿」生命科学专家论坛即将开播！本期论坛将聚焦“基因编码荧光探针的开发与在大脑中的应用”，特邀来自北京大学生命科学学院的李毓龙教授担任论坛主席，并邀请到中科院深圳先进技术研究院储军研究员、北京大学化学与分子工程学院邹鹏研究员、北京大学生命科学学院万金霞博士进行学术分享，四位老师将同“屏”共振，与大家分享前沿新知，碰撞未来趋势，助力科研人员开阔视野，拓宽思路。此外，论坛特设“专家互动，在线答疑”环节，四位老师将在线为大家解答科研上的疑问。论坛主题聚焦基因编码荧光探针的开发与在大脑中的应用直播时间8月3日（周三）19：00报名方式识别上方二维码，立即免费报名分享嘉宾李毓龙（论坛主席）北京大学 教授嘉宾简介李毓龙教授，于2000年本科毕业于北京大学生命科学学院，于2006年获得美国杜克大学神经生物学博士学位，之后在斯坦福大学进行博士后工作，现为北京大学生命科学学院教授，北大-清华生命科学联合中心、北京大学-IDG/麦戈文脑科学研究所教授，博士生导师。李毓龙教授为2019年国家杰出青年基金及科学探索奖获得者，还曾获绿叶生物医药杰出青年学者奖、第二十届吴阶平-保罗杨森医学药学奖（吴杨奖）、北京大学-勃林格殷格翰研究员奖等。李毓龙课题组依托北大-清华生命科学联合中心、北京大学麦戈文脑科学研究所，聚焦神经元通讯的基本结构--突触，从两个层面上开展研究工作：一是开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助此类工具探究突触传递的调节机制，特别是生理及病理条件下对神经递质释放的调控。课题组近期工作发表在Cell、Nature Neuroscience、Nature Biotechnology、Neuron、eLife等高水平期刊。储军中科院深圳先进技术研究院研究员分享主题：基因编码的光学探针在神经科学中的应用红色荧光蛋白标记神经元和蛋白FRET探针在活体小鼠中的应用CP探针活体动物内的应用和药物开发嘉宾简介储军研究员，博士生导师，广东省生物医学光学影像技术重 点实验室副主任。2009 年获华中科技大学生物医学工程博士，于2009～2015年在美国麻省大学阿莫思特分校和斯坦福大学进行了博士后研究。研究方向聚焦于新型光学和光声分子探针的开发、分子信号通路的光学成像和光遗传学、分子诊断和药物筛选等研究。主要研究成果包括：1）发展了新型的可用于蛋白相互作用监测的远红色荧光互补系统；2）发展了能够用于高灵敏监测细胞凋亡过程中 caspase-3活性的新探针；3）发展了目前最亮的可用于在体荧光成像的远红色荧光蛋白；4）发展了能够和GFP联合可用于双光子双色成像的大 stokes位移的橙色蛋白；5）发展了具有高动态范围的FRET荧光蛋白对。目前已主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划等科研项目多项，在Nature Biotechnology和Nature Methods等国际知名杂志发表论文30余篇，申请美国专 利2项，发表国际著作章节两篇。现为美国生物物理和蛋白协会会员。邹鹏北京大学 研究员分享主题：膜电位荧光探针的构建及在神经科学中的应用复合型膜电位荧光探针的构建神经动作电位的成像观测基于全光学手段的电生理记录嘉宾简介邹鹏研究员，博士生导师，2007年本科毕业于北京大学化学与分子工程学院，获化学学士和物理学学士双学位。2012年获美国麻省理工学院化学博士学位。2013年至2015年在哈佛大学化学与化学生物学系进行博士后工作。2015年5月起任北京大学化学与分子工程学院特聘研究员，兼任北大-清华生命科学联合中心和IDG/麦戈文脑科学研究所研究员。2019年获美国化学会旗下《化学与工程新闻》杂志 Talented 12 奖励，并担任《大学化学》副主编。2020年度 获得OKeanos-CAPA青年学者奖，北京大学教学优秀奖。2020年入选北京脑中心“北脑青年学者”。邹鹏博士致力于发展新型化学探针技术，实现对神经细胞高时空分辨的定量观测。课题组综合运用蛋白质工程、分子生物学和有机合成等手段创造新的功能分子，包括各类荧光探针、具有特殊活性的酶等；同时结合光学、质谱学等仪器技术，利用这些工具观测神经系统的结构与功能，并通过数学建模对数据进行定量分析。并率先提出“复合型膜电位探针”的概念，利用化学手段将荧光染料与视紫红质蛋白相偶联，利用后者的电致变色效应实现膜电位成像。相关研究成果发表在《自然-化学生物学》、《细胞-化学生物学》《德国应用化学》，PNAS等学术期刊。万金霞北京大学 博士分享主题：点亮大脑：可遗传编码神经递质荧光探针的开发及应用可遗传编码五羟色胺荧光探针的开发和刻画五羟色胺探针在活体小鼠中的应用其它可遗传编码的神经递质/调质探针嘉宾简介万金霞，北京大学生命科学学院2015级生理学专业博士生，导师为李毓龙教授。研究方向为通过开发新型的成像探针，在时间和空间尺度上帮助解析神经系统的复杂功能。博士期间主要致力于新型可遗传编码的五羟色胺探针的开发与应用，主要研究成果以独立第 一作者身份发表于Nature Neuroscience。以共同作者的身份发表论文共5篇，曾获得北京大学优秀毕业生、北京大学优秀博士学位论文、北京大学“三好学生”、北京大学优秀科研奖、北京大学专项奖学金等荣誉与奖励。论坛日程8月3日(周三）19:00精彩不容错过↑码上相约，本场直播全程免费↑▼分享下图到朋友圈，叫上师兄师弟师姐师妹一同get基因编码荧光探针的前沿研究，助力大家开阔视野、拓宽思路~

Flag标签蛋白检测抗体　　远慕生物提供可用于WB，IF，IP应用的Flag抗体，特异性检测Flag标签融合蛋白，Flag标签抗体可识别在细胞内表达的Flag标记重组蛋白，包括Flag位于氨基末端、中段以及羧基末端的重组蛋白。　　Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（ DYKDDDDK）融合到目标蛋白。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于细菌、酵母和哺乳动物细胞等多种细胞类型，相应的Flag标签抗体也被广泛应用。由于Flag标签系统的纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。Flag标签可以通过加入肠激酶处理去除，肠激酶专一识别该肽序列C末端的5个氨基酸残基。Flag抗体可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。　　由于Flag标签蛋白检测抗体亲水特性，Flag标签往往位于融合蛋白的表面上，因此比较容易被抗体接近并识别。不同的Flag标签抗体与Flag标签 有不同的识别和结合特性。　　Fig. 1. Flag标签蛋白IP实验，IP (1:200) - WB (1:5,000)：未转染的293细胞裂解液(lane A), 转染了Flag标签蛋白的293细胞转染裂解液 (lane B), 使用小鼠IgG作为阴性对照免疫沉淀293细胞裂解液(lane C),使用Flag单克隆抗体（1B10）IP转染后的293细胞裂解液(lane D), 293细胞裂解液 中仅加入Protein G Beads (lane E).　　Fig. 2. 使用Flag标签单克 隆抗体，通过免疫荧光实验（1:2000），分析转染的Flag 重组蛋白在293细胞中的定 位，二抗为IFKine? Red 驴抗 小鼠，蓝色为DAPI染色的细 胞核。

Part 1研究背景在生物化学中，蛋白质二聚体是由两个蛋白质单体或单个蛋白质形成的大分子复合物，它们通常是非共价结合的。蛋白质二聚体是一种蛋白质四级结构。有些蛋白需形成同源或者异源二聚体才能发挥其特定的功能，且不同聚集体的亚型与不同靶蛋白特异性结合，如14-3-3蛋白。对聚集体的状态维持和解离研究能更加清楚的了解生物学过程，并且开发特异性的靶标药物，用于疾病的治疗。由于聚集体是蛋白的四级结构组成部分，因此，一般来检测聚集体的亲和力需要先形成蛋白单体，也就是极低的蛋白浓度，对于很多互作方法来说无法实现检测。下方这篇Cell文献介绍了MST成功检测蛋白的二聚体亲和力以及小分子对聚集过程的影响。Part 2研究内容美国斯坦福大学Paul A. Khavari小组使用葡萄糖解聚DDX21二聚体来调节mRNA剪接和组织分化。2023年1月出版的《Cell》杂志发表了这项成果。https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.004IF: 64.5 Q1葡萄糖是一种普遍的生物能量来源，此外，研究发现，葡萄糖可能重塑分化所需蛋白质的功能，使分化过程得以实现。DDX21是一种DEAD-box RNA解旋酶，为同源二聚体状态，DDX21调节黑素细胞干细胞的分化。然而，DDX21在表皮分化中的功能尚未不清晰。在该研究中，作者发现，葡萄糖结合DDX21的ATP结合域，改变其构象，进而造成DDX21解离。在分化过程中，DDX21以葡萄糖依赖的方式定位于mRNA内含子中特定的模体，并促进关键的促分化基因的剪接。为了更清楚地了解葡萄糖对DDX21二聚化的影响，作者需检测（不）结合葡萄糖时DDX21二聚体亲和力。MST技术上机检测的浓度可以低至pM-nM，保证DDX21为单体状态，进而获得准确的二聚体亲和力结果。此外，MST对缓冲成分没有要求，并且是检测达到平衡状态时的亲和力。因此，可以将葡萄糖作为缓冲成分加入到体系中，并且使葡萄糖和DDX21达到平衡后再进行检测。MST亲和力结果表明，葡萄糖显著抑制DDX21二聚化（降低了近7倍）。图1：微量热泳动（MST）检测DDX21的二聚化（黑色）以及存在350uM葡萄糖（红色）或者半乳糖（蓝色）时亲和力。Part 3技术优势在这篇工作中，通过MST技术确定了DDX21形成二聚体的亲和力，以及葡萄糖与DDX21的作用。对于分子互作亲和力的检测，MST上机浓度极低，保证蛋白的单一状态，同时节省样本。当检测多个分子互作时，可以孵育达到平衡，获得准确的多元的亲和力。

新品一：3D空间组，真正3D成像的原位空间组，告别2D时代！新品二：30个免疫蛋白检测panel--通过蛋白核酸偶联技术实现多个免疫蛋白的共检！新品三：FFPE样本的超高分辨率空间组学检测，让久远临床宝藏样本重见天日、回顾性队列分析如虎添翼！ 鲲羽生物立足基因原位测序（in situ sequencing）和原位杂交(in situ hybridization)技术的研发和应用。核心成员从事相关研究20年，拥有本细分领域国际一流的核心技术和知识产权。作为少数从事基因原位检测的研发型公司，鲲羽生物以解码生命空间奥秘、革新临床精准诊断为目标，结合基础科研和临床发展实际需要，重视研发不断拓新，在前期快速DNA FISH试剂盒/RNA FISH试剂盒/原位空间测序技术服务及自动化杂交、成像仪器的基础上，隆重推出新品三连发！20233D空间组重磅来袭2022年，空间组学技术被国际顶级学术期刊《Nature》评为年度七大颠覆性技术；2023年，世界经济论坛发布《2023年十大新兴技术报告》，空间组学与柔性电池、人工智能辅助医疗、可持续航空燃料等创新技术被评为最有潜力、对世界产生积极影响的十大技术。然而目前市场上的空间组学仅是基于一张切片来检测的2D空间组。鲲羽生物推出两种3D空间组：一种通过连续或半连续切片做2D检测后，将多张切片成像数据对准后实现厚组织的检测；第二种是对厚组织直接透明检测成像，在获取X轴和Y轴信息基础上，同步获得Z轴信息，实现真正三维空间组的检测！小脑三维空间图谱构筑斑马鱼端脑三维空间图谱构筑202330个免疫蛋白检测panel--蛋白基因偶联检测重磅来袭蛋白是生命活动功能的主要执行者，过去的研究通过绘制转录表达谱来推测单细胞中相关的蛋白丰度，但大量数据显示这两者的相关性较差。传统的免疫荧光检测通量受限于二抗属源或染料数目，然而仅凭少数蛋白难以对细胞身份及功能进行注释。目前大尺寸的研究单细胞及空间分辨率的蛋白图谱依旧具有挑战性。鲲羽生物历经多年专研打磨，突破分辨率、灵敏性、特异性、大视野等限制，推出单细胞分辨率高灵敏高保真大视野的寡核苷酸抗体多重免疫组合空间蛋白组学。其主要原理是将特定抗体和特定核酸序列进行偶联，将蛋白信息转化为核酸序列信息，通过检测抗体偶联上的核酸序列从而获得蛋白的原位表达图谱。目前已实现在一张切片上检测30个免疫蛋白和多个RNA分子的同时检测，深度解析免疫微环境，助力免疫方向的临床诊断和科学研究！2023FFPE样本的超高分辨率空间组学检测重磅来袭FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）样本是指福尔马林固定后经石蜡包埋的组织样本。过去几十年中，按照此方法保存了大量的生物样本。FFPE样本承载着众多疾病信息，是当之无愧的病理“瑰宝”。但是FFPE样本取材不严格，存放时间长，存放条件不稳定等因素，增加了RNA检测的困难，大大制约了珍贵样本的信息挖掘。鲲羽生物自主研发的原位检测技术对存放一年以上的FFPE样本仍有极佳的检出效果。 目前鲲羽生物已助力客户在Cell、Nat Commun、Dev Cell、Nat Plants等知名学术期刊上发表文章。鲲羽生物目前已拥有多种DNA、RNA、蛋白原位检测产品以及高通量自动化FISH操作与成像平台、原位测序仪器等，拥有完全自主的基因原位检测相关技术核心知识产权多项，打破了国外在新一代单细胞组学技术的垄断，推动民族生物原始创新技术走向世界、服务全球。鲲羽已助力客户在 Cell、Nat Plants、Dev Cell、Nat Commun、SciAdv、Elife 等国际顶流期刊发表多篇文章。

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 基因编辑的“子弹”如果没有命中目标，就会产生脱靶效应，可能会导致诸如癌症等不良的基因变异。这种风险让人们对这种新的技术手段望而却步。近日，中国科学院神经科学研究所与国内外研究机构的研究者们合作开发了一种被命名为GOTI的技术，能够准确、灵敏地检测到基因编辑方法是否会产生脱靶效应，使基因编辑技术向安全地带迈进了一步。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 此前，人们推出过多种检测脱靶的方案。但小鼠或者人类个体间基因存在很大差异，基因编辑所产生的脱靶效应会被淹没在这些差异之中。以往的检测方法很难从这些差异中分辨出哪些是基因编辑所造成的脱靶，哪些是个体本身的差异，因此无法有效判别基因编辑工具的安全性。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " GOTI颠覆了原有的脱靶检测手段。实验的精妙之处是利用小鼠胚胎做实验。在受精卵分裂成两个时，基因编辑其中的一个，并用红色荧光蛋白进行标记。编辑之后，让两个细胞继续分裂，等小鼠胚胎发育到14.5天时，基于红色荧光蛋白筛选出基因编辑细胞和没有基因编辑的对照细胞。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 由于这两组细胞基因背景完全一致，且无需基因组体外扩增，避免了遗传背景的干扰，同时还可以清楚地展现单个碱基的突变，GOTI因此展现出强大的灵敏性，对数量极少的基因编辑脱靶也可感知。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 此外，研究人员使用GOTI技术发现BE3单碱基编辑会产生大量脱靶突变。这一发现使人们重新审视原本认为“特别安全、几乎不会有脱靶”的单碱基突变技术，并为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新技术，有望成为新的行业检测标准。相关研究结果于3月1日发表在《科学》上。 /p p br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p

近日，华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋、朱麟勇、陈显军团队在活细胞蛋白质标记与成像研究中取得重要进展，相关研究在《细胞发现》发表。 人造荧光蛋白及荧光探针。华东理工供图生物过程可视化一直吸引着科学家的好奇心。不同类型的荧光成像工具可以帮助科学家观察生命体中多种生物事件的发生过程，其中最著名的是荧光蛋白标记技术。荧光蛋白及其衍生技术经历了近30年的飞速发展，为生物学各个领域的研究作出了极大贡献，但伴随着显微镜技术的飞速发展，现有荧光蛋白的性质已经难以适应新型仪器的成像要求。相比之下，基于蛋白质标签和激活型荧光团的荧光标记工具凭借其理化性质成为新的研究热点。该团队针对自催化蛋白质标签SNAP-tag，设计开发了高信噪比的青色人造荧光蛋白SmFP485。SmFP485的荧光产生十分迅速，避免了荧光蛋白生色团成熟导致的延迟，因此可以用于实时监测蛋白质的合成过程。研究团队随后对SmFP485的结构进行了解析，探究了人造荧光蛋白的荧光激活原理。在此基础上，研究团队通过化学进化方法设计出一系列光谱覆盖绿色到近红外波段的人造荧光蛋白，它们均具有高亮度和高信噪比特点，特别是其在近红外波段的亮度已远超现有成像工具，能够对活细胞以及活体动物中的蛋白质表达、蛋白质降解、蛋白质组装、蛋白质相互作用以及蛋白质运输进行原位实时标记与成像。最后，研究团队在多色人造荧光蛋白的基础上，采用蛋白质与荧光团共进化的方法设计开发出一系列光谱涵盖青色到近红外波段的钙离子遗传编码荧光探针，实现了对哺乳动物细胞中钙离子震荡的实时监测，为荧光探针的构建提供了新的荧光载体。综上，研究团队开发了一系列高性能人造荧光蛋白，它们具有荧光产生迅速、亮度高、信噪比高、光谱范围广等优点，为活细胞以及活体动物中蛋白质的可视化提供了有力工具，同时也为荧光探针的构建提供了新的思路和策略。

为了更好地帮助仪器用户通过此次财政贴息贷款选购适合的仪器设备，仪器信息网联合多家优质仪器厂商上线了专门的仪器展示专题，提升用户选购仪器的效率；同时面向广大仪器厂商进行征稿活动，仪器厂商可围绕“2000亿贴息贷款政策下，如何助力快速选型采购”这一主题进行原创稿件创作（字数不少于1500字），稿件一经采用将发布在仪器信息网上并收录到相关专题中。专题链接：https://www.instrument.com.cn/topic/txdk2022.html近日卫健委发布《国家卫健委开展财政贴息贷款更新改造医疗设备的通知》，对医疗机构设备购置和更新改造新增贷款实施阶段性鼓励政策，中央财政贴息2.5个百分点，期限2年，申请贴息截止到2022年12月31日，合计涉及1.7万亿贷款总额。涉及的关键领域包括高校、职业院校、医院、中小微企业等九大领域的设备购置和更新改造均在计划中，整体工作将在今年年底前结束。喜迎国家利好政策，为了更便于科研单位进行设备申报，NanoTemper将于11月推出线上专题直播，更直观高效的助力用户快速完成选型采购。NanoTemper是一家专注于蛋白分析仪器开发的德国企业，总部位于德国慕尼黑市。我们为客户提供从蛋白表达筛选，蛋白质控，体系优化到互作分析的完整解决方案。对于蛋白研究，正确折叠，稳定性好的蛋白是实验成功的前提，而快速获取高质量的蛋白并不是一件易事，尤其是结构生物学以及药物发现研究的热点膜蛋白，更容易遇到表达水平低，收率低，活性易降低的问题。而最常用的SDS-PAGE， 可以评估总蛋白的表达水平，但无法鉴定蛋白稳定性。另一种常用方法是荧光检测分子筛（Fluorescence-detection Size-Exclusion Chromatography）FSEC技术，通过融合表达GFP绿色荧光蛋白，借助分子筛和荧光检测技术来评估蛋白的表达水平和多分散性，但单独使用时无法评估蛋白的热稳定性。虽然可以搭建自动化的检测方案，但其检测速度较慢，因此通量依然较低。针对该问题，我们公司推出了Andromeda蛋白表达筛选系统，可以实现蛋白纯化前的表达水平与稳定性的检测，以优化表达条件，帮助研究人员在更早期阶段直接通过裂解液精准筛选高表达及高稳定的蛋白表达体系，减少后期工作量，提高蛋白生产效率。Andromeda蛋白表达筛选系统在成功纯化好蛋白后，我们更需要多维度分析其理化性质，确保蛋白质量符合我们接下来的检测需求。Prometheus Panta多参数蛋白稳定性分析仪配备了微量差示扫描荧光技术（nanoDSF），背反射技术（Backreflection），动态光散射技术（DLS）和静态光散射技术（SLS）四种检测模块，是市面上唯一可以同时开启四种检测模块的仪器，可帮助研究人员全面评估蛋白质量，优化蛋白存储及实验缓冲体系，并可完成无标记Thermal shift assay进行结合配体的初筛（差示扫描荧光法表征蛋白配体互作，不加染料的那种_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)）。此外，仪器还可用于抗体可发性评估以及制剂筛选。Prometheus Panta多参数蛋白稳定性分析仪在使用Andromeda和Promethues得到高质量的蛋白后，您接下来的研究工作可能会涉及基于靶点的高通量筛选。Dianthus是首个使用光谱位移技术(Spectral Shift)的亲和力筛选平台，仅需1分钟即可精确计算样品间的kd值。使用Dianthus进行结合配体筛选有以下优势：33分钟完成384孔板检测可控平衡状态的溶液中检测，避免固定对样品的影响。在表征三元复合物时，二元复合物处于稳定状态，非常适用于PROTAC项目检测不依赖于分子量，无需担心分子量过低而漏掉有价值的hits样品均在溶液中独立检测，筛选共价结合配体时无需昂贵的耗材和繁琐的操作基于微孔板检测，无微流控系统，无需清洗维护点击了解Dianthus STING抑制剂片段筛选实例Dianthus亲和力筛选平台如果您对于分子间相互作用分析并没有太高的通量需求，不妨了解下Monolith X。Monolith X分子互作仪同样搭载了全新的光谱位移技术(Spectral Shift)，使用毛细管上样，单次运行可检测2个kd。因其无需进行样品固定，检测速度快，操作简单等特点备受全球研究人员的青睐，广泛应用于疾病机理研究，药物研发，结构生物学，植物科学等领域，帮助研究人员解决了诸多分子间相互作用分析难题，发表的文献超过5000篇。Monolith X分子互作仪关于NanoTemperNanoTemper始创于2008年，全球领先的科学仪器制造商，总部位于德国慕尼黑，全球设立13个分支机构。NanoTemper的愿景是致力于创造一个任何疾病都可以被治愈的世界。因此我们的使命是尽快研发出更有助于科研人员解决表征难题的生物物理工具。NanoTemper使用开创性的专利技术，推出了MO系列分子互作检测仪、PR系列蛋白稳定性分析仪、DI系列高通量Hits筛选系统等，从根本上大大缩短蛋白表征的时间和样品消耗。卓越的产品和优质的服务使NanoTemper成为全球成千上万的制药企业、学术研究机构及科技公司的首选合作伙伴。

内源性大麻素（eCB）是由神经元合成和释放的一类脂类神经调质分子，可参与大脑多个脑区的突触可塑性调节，对情绪、睡眠、食欲等神经活动过程具有调控功能。内源大麻素系统的调控异常与神经退行性疾病、癫痫、成瘾、抑郁症和精神分裂症等诸多神经疾病和精神类疾病密切相关。然而，目前缺乏高灵敏度、高时空分辨率的实验手段直接检测在体eCB的动态变化。　　近日，发表在《Nature Biotechnology》上的一项题为“A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo”的研究中，来自北京大学的研究团队基于人源大麻素受体CB1和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了eCB探针eCB2.0，用于检测eCB的时空动态变化。　　研究人员利用人源性大麻素受体CB1作为探针的骨架，并把对结构变化敏感的绿色荧光蛋白cpEGFP嵌入受体，改造后的CB1与eCB结合会引发构象变化，而构象变化则会被转换为荧光信号，因此可通过检测荧光亮度变化来反映eCB水平的变化。研究团队在体外培养的细胞、脑片和活体小鼠上均能检测到稳定的eCB信号，该探针被证实具有亲和力强、灵敏度高、分子特异性、相应速度快等优点。　　该项工作首次实现了对eCB的高时空间分辨率记录，为科学界深入研究eCB在生理和病理条件下的重要功能和调控机理提供了有力的新工具。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41587-021-01074-4　　注：此研究成果摘自《Nature Biotechnology》，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与健康工程研究所生物医学光学与分子影像研究中心研究员储军课题组在《自然-通讯》（Nature Communications）上，发表了题为A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging的研究论文，报道了高性能基因编码的环磷酸腺苷（cAMP）荧光探针及其应用。　　cAMP是细胞内关键第二信使，可整合来自多种G蛋白偶联受体（GPCR）的信号，在学习与记忆、药物成瘾、运动控制、免疫、肿瘤、代谢等过程中发挥重要作用。活细胞和活体水平的cAMP分子浓度变化的高时空分辨率荧光成像是解析cAMP信号通路及其生物学功能的重要基础。因此，开发高灵敏的cAMP荧光探针成为研究复杂生物过程的关键。与非基因编码探针（染料和材料类）相比，基因编码探针具有低毒性、低背景、可遗传、可定位特定细胞亚结构或特定细胞等优点，在生命科学基础研究中具有优势。然而，现有的50多个基因编码的cAMP荧光探针或灵敏度低（荧光变化最大只有1.5倍），或荧光亮度较暗，较难监测活体中微弱的内源性cAMP变化，限制了生理和病理状态下cAMP分子调控机理和功能的研究。　　为了开发适用于活体检测的高灵敏度探针，研究人员将环化重排绿色荧光蛋白（cpGFP）插入细菌MlotiK1通道的cAMP结合结构域（mlCNBD）中。经过插入位点筛选、连接肽优化、荧光蛋白及感应模块优化，研究得到了具有高亮度、高灵敏度、合适亲和力和快响应速度等特征的高性能基因编码cAMP绿色荧光探针（G-Flamp1）。晶体结构显示G-Flamp1探针的连接肽具有独一无二的结构：其中一个连接肽是一个非常刚性的 β-strand 结构，这在其他晶体结构已知的环化重排荧光蛋白探针中是不存在的，为开发其他高性能探针提供了新思路和新方法。　　在体外实验中，结合/未结合cAMP的G-Flamp1有不同发色团环境。G-Flamp1在450 nm（单光子）或者900-920 nm（双光子）激发下，动态范围达最大，即ΔF/F0约为13。G-Flamp1与cAMP亲和力适中，其解离常数Kd值为2.17 μM。G-Flamp1可在亚秒时间分辨率上检测cAMP动态变化。在培养细胞中，该探针均匀分布在细胞质和细胞核中，本底荧光亮度介于同类探针cAMPr和Flamindo2之间。G-Flamp1探针在活细胞中的动态范围达到了12倍，是目前少数几个动态范围在10倍以上的荧光蛋白探针之一。同时，该探针具有良好的特异性和可逆性（图1）。　　研究人员将G-Flamp1探针应用在果蝇这一模式生物中。果蝇脑部蘑菇体（mushroom body）的Kenyon细胞中cAMP信号通路在气味相关的记忆中发挥关键作用。研究首先获取了Kenyon细胞中表达G-Flamp1探针的转基因果蝇，而后利用双光子成像发现，果蝇受到气味或电击刺激时，蘑菇体不同子区域呈现不一样的cAMP信号时空变化（图2），暗示不同子区域可能在联想性学习中起着相对独立的作用。　　为验证G-Flamp1探针在活体动物中检测cAMP 动态变化的实用性，研究人员利用腺相关病毒在小鼠运动皮层中共表达绿色G-Flamp1探针和红色jRGECO1a钙探针。活体双光子成像揭示了跑步运动中细胞特异性的cAMP信号，并与钙信号无明显相关性（图3)。这反映了小鼠运动时大脑皮层M1神经元反应的异质性。　　研究人员在小鼠大脑深部的伏隔核（NAc）脑区中表达G-Flamp1探针，并利用光纤记录听觉巴甫洛夫条件反射任务中该脑区cAMP信号的变化。结果表明随着训练的熟练，小鼠得到奖赏时cAMP信号幅度在降低，而听到相应声频信号时cAMP信号幅度在升高（图4）；该特性与多巴胺信号类似，暗示多巴胺释放引起了cAMP信号。综上，G-Flamp1探针的高信噪比和高时间分辨率能够高灵敏检测到活体小鼠中内源性cAMP信号的动态变化。　　该研究开发了一种适用于活体检测的cAMP荧光探针，并初步揭示了果蝇和小鼠等模式生物在特定行为过程中特定神经元的cAMP信号变化的规律，为进一步阐释cAMP信号的调控和功能奠定了基础。结合高内涵药物筛选平台，该探针将尝试应用于针对GPCR受体的药物筛选，以期发现更多的具有临床价值的GPCR药物。　　研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的资助，并获得北京大学、中科院神经科学研究所、中山大学附属第五医院、美国堪萨斯州立大学、华中科技大学等的支持。

阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一种严重的神经退行性疾病，其起病隐匿，病程长，病因复杂，严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来巨大的经济负担。AD的主要病理特征之一表现为患者脑部出现β-淀粉样蛋白（β-Amyloid proteins，Aβ蛋白）的沉积。开发能特异性靶向Aβ蛋白，特别是AD早期的Aβ蛋白单体和寡聚体的分子影像探针，对于AD的早发现和早治疗，以及抗AD药物治疗效果的早期评估都具有重要意义。　　近日，中国科学院上海药物研究所研究员柳红课题组与南京大学化学化工学院教授叶德举课题组合作构建了靶向Aβ蛋白的近红外荧光小分子探针，并应用于转基因AD模型小鼠脑部Aβ蛋白的实时荧光成像与可视化。该成果以Engineering of donor-acceptor-donor curcumin analogues as near-infrared fluorescent probes for in vivo imaging of amyloid-β species为题发表在Theranostics上。　　近红外荧光成像由于具有灵敏度高、成像快捷、操作简便等优点，已被广泛应用于疾病标志物的检测中。近年来，研究人员也相继开发了Aβ蛋白响应的荧光探针用于Aβ蛋白的检测。但是，目前报道的荧光探针大多还存在荧光发射波长较短，与Aβ蛋白的结合动力学过程较慢、亲和力较低，以及仅能检测AD病程较晚期的Aβ蛋白斑块等不足。因此，发展具有近红外荧光发射波长，对Aβ蛋白单体、寡聚体和聚集体具有快速响应和高亲和力的近红外荧光探针用于活体内Aβ蛋白的高灵敏度和高特异性检测，对AD的早期诊断和疗效监测具有重要意义。　　该工作基于Aβ单体、寡聚体和聚集体的蛋白结构与结合模式，通过理性设计和官能团替换，设计并合成得到9个具有Donor-Acceptor-Donor（D-A-D）结构的近红外荧光探针（1-9），可以与Aβ蛋白单体、寡聚体和聚集体高特异性结合并产生显著增强的近红外荧光信号。　　该研究中发现的探针9具有较红的近红外荧光发射波长，较高的荧光量子产率，一方面可提高光对颅骨和头皮的穿透深度，从而提高探针活体上检测Aβ蛋白的灵敏度；另一方面可降低探针在活体应用时的给药剂量，从而减少了高剂量探针对神经系统的潜在毒性。此外，探针9因引入具有一定亲水性能的羟乙基官能团，改善了探针的理化性质，提高了探针的进脑量。同时，探针9表现出快速的结合动力学过程（　　论文链接探针与Aβ蛋白响应机理示意图

近日，中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与健康工程研究所生物医学光学与分子影像研究中心研究员储军课题组在《自然-通讯》（Nature Communications）上，发表了题为A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging的研究论文，报道了高性能基因编码的环磷酸腺苷（cAMP）荧光探针及其应用。cAMP是细胞内关键第二信使，可整合来自多种G蛋白偶联受体（GPCR）的信号，在学习与记忆、药物成瘾、运动控制、免疫、肿瘤、代谢等过程中发挥重要作用。活细胞和活体水平的cAMP分子浓度变化的高时空分辨率荧光成像是解析cAMP信号通路及其生物学功能的重要基础。因此，开发高灵敏的cAMP荧光探针成为研究复杂生物过程的关键。与非基因编码探针（染料和材料类）相比，基因编码探针具有低毒性、低背景、可遗传、可定位特定细胞亚结构或特定细胞等优点，在生命科学基础研究中具有优势。然而，现有的50多个基因编码的cAMP荧光探针或灵敏度低（荧光变化最大只有1.5倍），或荧光亮度较暗，较难监测活体中微弱的内源性cAMP变化，限制了生理和病理状态下cAMP分子调控机理和功能的研究。为了开发适用于活体检测的高灵敏度探针，研究人员将环化重排绿色荧光蛋白（cpGFP）插入细菌MlotiK1通道的cAMP结合结构域（mlCNBD）中。经过插入位点筛选、连接肽优化、荧光蛋白及感应模块优化，研究得到了具有高亮度、高灵敏度、合适亲和力和快响应速度等特征的高性能基因编码cAMP绿色荧光探针（G-Flamp1）。晶体结构显示G-Flamp1探针的连接肽具有独一无二的结构：其中一个连接肽是一个非常刚性的 β-strand 结构，这在其他晶体结构已知的环化重排荧光蛋白探针中是不存在的，为开发其他高性能探针提供了新思路和新方法。在体外实验中，结合/未结合cAMP的G-Flamp1有不同发色团环境。G-Flamp1在450 nm（单光子）或者900-920 nm（双光子）激发下，动态范围达最大，即ΔF/F0约为13。G-Flamp1与cAMP亲和力适中，其解离常数Kd值为2.17 μM。G-Flamp1可在亚秒时间分辨率上检测cAMP动态变化。在培养细胞中，该探针均匀分布在细胞质和细胞核中，本底荧光亮度介于同类探针cAMPr和Flamindo2之间。G-Flamp1探针在活细胞中的动态范围达到了12倍，是目前少数几个动态范围在10倍以上的荧光蛋白探针之一。同时，该探针具有良好的特异性和可逆性（图1）。研究人员将G-Flamp1探针应用在果蝇这一模式生物中。果蝇脑部蘑菇体（mushroom body）的Kenyon细胞中cAMP信号通路在气味相关的记忆中发挥关键作用。研究首先获取了Kenyon细胞中表达G-Flamp1探针的转基因果蝇，而后利用双光子成像发现，果蝇受到气味或电击刺激时，蘑菇体不同子区域呈现不一样的cAMP信号时空变化（图2），暗示不同子区域可能在联想性学习中起着相对独立的作用。为验证G-Flamp1探针在活体动物中检测cAMP 动态变化的实用性，研究人员利用腺相关病毒在小鼠运动皮层中共表达绿色G-Flamp1探针和红色jRGECO1a钙探针。活体双光子成像揭示了跑步运动中细胞特异性的cAMP信号，并与钙信号无明显相关性（图3)。这反映了小鼠运动时大脑皮层M1神经元反应的异质性。研究人员在小鼠大脑深部的伏隔核（NAc）脑区中表达G-Flamp1探针，并利用光纤记录听觉巴甫洛夫条件反射任务中该脑区cAMP信号的变化。结果表明随着训练的熟练，小鼠得到奖赏时cAMP信号幅度在降低，而听到相应声频信号时cAMP信号幅度在升高（图4）；该特性与多巴胺信号类似，暗示多巴胺释放引起了cAMP信号。综上，G-Flamp1探针的高信噪比和高时间分辨率能够高灵敏检测到活体小鼠中内源性cAMP信号的动态变化。图1.G-Flamp1探针在体外和培养细胞内的表征图2.不同刺激下果蝇Kenyon细胞中cAMP信号的变化图3.运动过程中小鼠皮质神经元内cAMP信号的变化图4.巴甫洛夫条件反射任务中小鼠NAc脑区cAMP信号的变化该研究开发了一种适用于活体检测的cAMP荧光探针，并初步揭示了果蝇和小鼠等模式生物在特定行为过程中特定神经元的cAMP信号变化的规律，为进一步阐释cAMP信号的调控和功能奠定了基础。结合高内涵药物筛选平台，该探针将尝试应用于针对GPCR受体的药物筛选，以期发现更多的具有临床价值的GPCR药物。 研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的资助，并获得北京大学、中科院神经科学研究所、中山大学附属第五医院、美国堪萨斯州立大学、华中科技大学等的支持。