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最近网上传有“进入食品安全监测领域的微流控恒温扩增仪”这个仪器是啥?能测定什么项目?
PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性,而且快速、简便、易于自动化,因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究用应用工作。PCR技术很简单,原理也很清楚,因此有条件的单位都能较顺利地上马,但毕竟PCR技术是一种新生事物,受到许多条件因素的影响,所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题,更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展PCR工作,更好地发挥PCR技术的工具作用,我们根据多年来PCR工作总结的经验,对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结,提供给广大科研工作者作为参考,抛砖引玉,不足之处欢迎指正。 一、 假阳性扩增 在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性,而且扩增产物电泳条带亮度均一,这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现,需仔细检查,排除污染源,一般应从以下步骤着手: ⒈ 试剂污染: 厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法,可按试剂盒说明书将试剂分装好,直接置于PCR仪中扩增(不加阴性对照,可加适量蒸馏水),便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。 ⒉ 实验室污染: 这是最常见的污染源,由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上,扩弗产物可能在电泳等过程中污染[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板,一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法:可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然,所用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、吸咀管(离心管)都应彻底更换。解决方法:实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象,而且一旦出现污染,消除污染源又极其困难,往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理,所以应该以预防为主,实验过程中严格遵守实验基本要求,样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开,最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]及扩增后点样用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]应严格地分开,不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。 ⒊ 采样污染: 在实验过程中,有时会出现一批结果阳性率很高,一批结果阳性率又下降很多,如此反复,这种现象大都是由于采样时污染所致,一般来讲正规试剂生产厂家,其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间,特别是批内差异都极小,不致出现如此明显的反复,这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感,而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量DNA,这些痕量DNA便成为PCR模板,出现阳性扩增结果,由于采样试管受污染程度不一,所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。 二、 假阴性扩增: 如果连续几次扩增结果都是阴性,或已知阳性样本出现阴性扩增结果,一般认为这是假阴性,出现这现象有以下几种原因: ⒈ 仪器故障: 出现全阴结果,首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况,是排除假阴性其它原因的基础,仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常,首先要测定加热体的温度是否准确,波动范围是否答合要求,各孔之间差异是否符合要求,PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度,如果误差太大,势必出现假阴性。必须注意的是不能过信名牌,我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。 ⒉ 试剂失效或无效: 了解机器是否正常,便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期,试存放方法是否达到要求,如果试剂盒在有效期内,贮存方法是正确,那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本,或试剂盒提供的阳性对照,严格按说明书操作扩增一次,然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍,作为模板进行第二次扩增,判断结果,如果是阴性说明试剂无效或不合格,如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。
1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法,1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文,Mullis当时服务于Perkin Elmer(PE)公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.(ABI)公司收购、分拆、再转卖,而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今,PCR方法愈发趋向自动化,并从中衍生出更多的新技术方法,可以说,PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场,多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR的专利目前依然掌握在ABI和Roche(罗氏)两大公司手中,去年业界颇为引人瞩目ABI诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶的作用下,以单链为模版,根据碱基互补配对原则复制成新的单链,与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制,多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出,PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进,今天的PCR已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要,各厂家的PCR仪型号不同,着力宣传的技术指标和参数也不尽统一,编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标,希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。PCR仪介绍及其选购 PCR仪的种类总体来说可以分为两大类:PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪,普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪,此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪。