宿主细胞蛋白质分析

2020年初，一场突如其来的疫情打乱了大家的生活节奏。面对来势汹涌的疫情，全国上下正在积聚力量，全力战胜新型高致病性冠状病毒（2019-nCoV）。医护人员、解放军战士、志愿者们纷纷奔赴武汉，与疫魔竞速，守卫着国民的生命安全，致敬最美逆行者！同时疫情研究者一样没有停下自己的脚步，特别是在分子水平，我们调研了基于Orbitrap超高分辨的蛋白质组学和结构组学技术在病毒学研究中的应用，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。Orbitrap技术促进病毒机理研究病毒与宿主共同进化，获得捕获和操纵宿主细胞过程进行复制的机制传播。同样，宿主细胞会通过部署防御机制或通过适应感染环境。在整个感染过程中，细胞严重依赖于时空调控的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用的形成。 蛋白质组学方法与病毒学的结合促进了对病毒复制、抗病毒宿主反应和病毒对宿主防御的颠覆机制的深入研究。而Orbitrap技术依靠其高灵敏度、高精度，高通量等特性在该方面表现出色。案例一：Orbitrap技术深度挖掘病毒-宿主蛋白质相互作用2019年Viruses杂志上发表了基于组学技术研究宿主变化的综述，质谱技术中基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行MS分析（AP-MS）的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒-宿主多蛋白复合物，可识别间接和直接的蛋白质相互作用，提供相互作用事件的瞬时信息，或跟踪单个病毒基因产物的过表达，以深入了解单个蛋白质的功能；表达蛋白质组学技术（定量蛋白质组学和翻译后修饰组学）可以研究病毒蛋白的组成，宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化。（Viruses 2019, 11, 878 doi:10.3390/v11090878）迄今为止，基于蛋白质组学方法的进展已经为识别数量惊人的病毒-宿主蛋白关联铺平了道路，科学家基于这些数据构建了包含了5000多种病毒成分和宿主细胞之间的非冗余蛋白相互作用数据库。这些有价值的信息库包括相互作用蛋白数据库、VirHostNet(http://virhostnet.prabi.fr/)、VirusMentha(Nucleic Acids Res. 2015 43(D1):D588–D592)、IntAct-MINT(Nucleic Acids Res. 2015 43(D1):D583–D587)和Uniprot。 案例二：Orbitrap技术揭示新型塞卡病毒宿主因子Pietro,Scaturro, Alexey, et al. Nature, 2018 寨卡病毒(ZIKV)最近成为全球健康问题，由于它的广泛传播和与严重的联系新生儿神经症状和小头症。然而,与致病性相关的分子机制关于ZIKV的大部分仍然未知。 技术路线：利用赛默飞 LTQ-Orbitrap和Orbitrap Q Exactive HF质谱进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学（实验路线见下图a），研究对象为神经细胞系SK-N-BE2和NPC细胞，表征细胞对病毒的反应，在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化，利用亲和蛋白组学方法鉴定ZIKV蛋白的细胞靶点。使用这种方法，找到了386个与zikv相互作用的蛋白质，导致宿主在神经发育受损，视网膜缺陷和不孕。此外，确定了寨卡病毒感染后1216个磷酸化位点存在上调或下调，来自AKT, MAPK-ERK和ATM-ATR信号通路中，为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。在功能上，系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动，并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证（下图热图），补充这一空白。技术路线图案例三：Orbitrap技术深入探寻寨卡病毒病毒与宿主的相互作用Etienne Coyaud, et al. Molecular & Cellular Proteomics，2018,技术路线技术路线：本文利用生物素识别以及IPMS亲和纯化结合MS 方法，研究寨卡病毒侵染后病毒与宿主细胞蛋白质的相互作用（技术路线见上图），实验结果揭示了1224个蛋白3033多肽形成的相互作用网络（见下图a）。相互作用包括多肽加工和质量控制、囊泡方面的作用运输，RNA处理和脂质代谢。40%的 作用都是以新报道的相互作用。通过数据挖掘分析，揭示过氧化物酶体在ZIKV感染中的关键作用。病毒宿主蛋白相互作用网络图 温馨提示：积极防护 保护自己 戴口罩 勤洗手

以流感为代表的由RNA病毒引发的疾病严重威胁人类健康，甚至影响社会经济发展。RNA作为RNA病毒的遗传物质，在致病过程中发挥着关键作用，但很少有研究报道病毒RNA与宿主蛋白间的相互作用。近期，我国科学家首次解析了多种病毒RNA与宿主蛋白质互作的关系网络，研究成果发表在《Cell Research》，标题为“Comparison of viral RNA–host protein interactomes across pathogenic RNA viruses informs rapid antiviral drug discovery for SARS-CoV-2”。　　研究人员采用RNA结合蛋白综合鉴定（Comprehensive identification of RNA-binding proteins by mass spectrometry）技术，全面解析了新冠病毒（SARS-CoV-2）、寨卡病毒（ZIKV）和埃博拉病毒（EBOV）这3种RNA病毒在侵染状态下病毒基因组RNA与宿主蛋白的互作网络。基于病毒基因组RNA-宿主蛋白互作网络，研究人员鉴定出一系列参与不同病毒感染的宿主蛋白质复合物，并深入解析多种宿主因子在病毒感染过程中的功能。在此基础上，研究人员建立了靶向宿主蛋白质的抗病毒药物筛选方法，并筛选出多个具有广谱抗病毒活性的药物。　　该研究不仅绘制了不同病毒RNA-宿主蛋白质的互作网络，为病毒学和抗病毒研究提供了重要的研究资源，还为抗病毒药物的研发提供了新的视角。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41422-021-00581-y　　注：此研究成果摘自《Cell Research》期刊原文章，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。

SARS-CoV-2的奥密克戎变异株最早报道于2021年11月，目前已成为世界范围内的主要感染株。奥密克戎在S蛋白的30多个突变导致其致病性和复制能力的下降，而传播力却明显增强。目前，宿主对奥密克戎的反应尚不明确。近期，西湖大学生命科学学院郭天南团队、浙江大学医学院附属杭州市西溪医院黄劲松团队协同国家传染病医学中心、上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室、复旦大学附属华山医院感染科张文宏团队共同合作评估了奥密克戎变异株感染、SARS-CoV-2非奥密克戎株感染，非SARS-CoV-2呼吸道病毒（流感病毒及腺病毒）感染患者的血液蛋白质组学特征，并和健康受试者接种全程2针新冠疫苗前后的蛋白质组学特征进行了同步比较，相关成果于5月18日发表于Cell Discovery杂志。研究分析表明，在血液蛋白质组学的角度，接种疫苗后的奥密克戎株与非奥密克戎株宿主反应类似；同一般流感相比，具有显著的差异特征。在非重症肺炎患者中，接种疫苗后感染奥密克戎诱导的免疫反应与非奥密克戎株感染相似，炎症反应远超过健康对照病例，但没有流感和流感样病人严重。这可能是由于新冠疫苗为大部分患者提供了潜在的保护作用。但需要注意的是，本研究并没有分析重症肺炎患者，因此，奥密克戎株或流感病毒等在重症患者中引起的宿主炎症反应我们无法通过本研究评估。研究结果提示，奥密克戎株与流感的宿主免疫反应存在显著差异，接种疫苗可能是非重症奥密克戎株患者宿主炎症反应降低的原因之一。参考文献[1] BAO JF, SUN R, Ai JW, 等. Proteomic characterization of Omicron SARS-CoV-2 host response [J]. Cell Discovery. 2022[2] SHEN B, YI X, SUN Y, 等. Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera[J]. Cell, 2020, 182(1): 59-72.e15.

据发表在最新一期《自然化学》杂志上的论文，德国达姆施塔特工业大学和瑞士弗里堡大学领导的国际研究团队在使用合成材料合成人造细胞方面实现突破。这些细胞通过一种被称为生物催化聚合诱导自组装（BioPISA）的过程制造，代表了合成生物学领域的重大进步。论文插图图片来源：《自然化学》（2023）人造细胞是模仿活细胞特性的微观结构。它们是促进化学反应和分子系统工程的重要微反应器，是合成生物学途径的宿主，也是研究生命起源的重要工具。该团队开发了一种酶促合成的聚合物微胶囊，并使用它们来包裹细菌细胞的可溶性内容物（即胞质溶胶），从而创造出能够在内部产生一系列蛋白质的人造细胞，包括荧光蛋白、制造细胞骨架样结构的肌动蛋白，以及人类骨骼中发现的生物矿化过程的碱性磷酸酶。蛋白质的表达不仅模仿了活细胞的基本特性，而且展示了这些人造细胞在从药物输送到组织工程等多种应用中的潜力。新研究弥补了合成生物学中的一个重要空白，即能够将合成材料与酶过程结合起来，创造出复杂的人造细胞，就像真正的细胞一样，这为创造结构和功能上与生物细胞相似的模拟物开辟了新途径。研究人员指出，酶促自由基聚合是制造这些人造细胞的关键。酶会将聚合过程中自组装的聚合物合成纳米和微米尺寸的聚合物胶囊。这是一种非常简单但有效的人造细胞制备方法。在未来的工作中，研究团队的目标是利用人造细胞中表达的蛋白质来催化进一步的聚合，从而模仿自然细胞的生长和复制。

p 　　早前，美国ProteinSimple公司推出全球第一款可以对循环肿瘤细胞、外泌体等微量样本进行蛋白质表达水平定量检测的Milo系统。一经推出，此产品立即获得《The Scientist》杂志年度创新产品第一名、生物通2016年度生命科学十大创新产品奖、中国仪器协会年度创新新产品奖等。它的发明人之一Kelly Gardner博士也获得MIT Technology Review 35岁以下创新人才奖。 /p p style=" text-align: center " img width=" 400" height=" 284" title=" 1.jpg" style=" width: 400px height: 284px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b89d84ca-1b3f-49c0-b5b1-82a689442e01.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　通过检测血液中的循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤DNA发展起来的液体活检，对于肿瘤病人无痛诊断及靶向治疗有非常重要的意义。各国科学家在CTC富集、DNA测序和DNA分析方面做了很多的工作，但是CTC蛋白质研究一直因为检测灵敏度问题停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中发挥更重要的作用。 /p p 　　美国ProteinSimple Milo系统的推出解决了这一问题。最近，加州大学伯克利分校和斯坦福大学医学院的研究人员利用Milo系统在《Nature Communications》上发表文章，证实在一次普通的抽血后(2-4 ml血液)，可对血样中罕见的CTC进行蛋白质表达水平分析，以检测其中一组与癌症相关的蛋白质。 /p p 　　实验方案如下：科学家们从乳腺癌患者的血液中分离出循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞接种到Milo芯片western blot细胞捕获孔中。微流体设备裂解细胞，让其内容物流出，之后进行电泳将蛋白质根据分子量大小进行分离。然后在凝胶中原位捕获蛋白，再进行抗体孵育杂交，最后通过荧光信号值进行定量，检测了癌症蛋白标志物的含量。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/1045381e-1f3a-40c1-a07f-82df916660d6.jpg" / /p p style=" text-align: center " (图片来自Nature Communications) /p p 　　这项研究检测的蛋白靶标有12个，包括已被用于癌症分型(如ER、HER2、EGFR)、循环肿瘤细胞鉴定(如EpCAM、panCK、CK8)、白细胞标记(如CD45)的蛋白和普遍表达于哺乳动物细胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。研究者计划将这一名单继续扩大，以便最终能够更精确地对癌细胞进行分类，选择针对的靶向治疗药物。 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/60121d8a-3a5f-4b8b-9f0f-453af71e6bed.jpg" / /p p style=" text-align: center " (图片来自Nature Communications) /p p 　　这篇文章的通讯作者、加州大学伯克利分校的Amy Herr表示：“微流体设计是本研究的关键。我们能够将每个阶段所需的功能整合在一起。这样，我们才能很快、很快地开展每一步。如果慢一点，细胞中的蛋白质将弥散，变得无法检测。” /p

细胞异质性作为细胞系统中一种普遍存在的现象，受到生物研究领域的日益关注。在传统的群体分析中，单个细胞的独特差异往往被整体的平均值所掩盖，而这些被忽略的细节恰恰构成了细胞分化过程中的关键线索。随着微阵列芯片、核酸测序、质谱等技术的进步，对单一细胞进行基因组、转录组、代谢组和蛋白组分析已不再遥不可及。特别是核酸扩增技术的进步极大地推动了基因组、转录组在单细胞层面的测序技术的应用。尽管取得了这些进步，但在单细胞层面对蛋白质和代谢物的分析仍然面临重大挑战，这主要是由于它们的量有限且缺少有效的扩增手段。本文提出了一种新的策略，通过一次性单细胞蛋白质组和代谢组分析（scPMA），可以在单次LC-MS/MS分析中同时获取单个细胞的蛋白质和代谢物信息。通过这种策略，研究人员能够整合单个细胞的多组学数据，以深入理解细胞内部相互作用的网络和调控细胞状态的复杂机制。scPMA策略共包括以下三个部分（图1）：单细胞捕获及分离、纳升级样品预处理、一次性LC注入和质谱检测。前两个环节都是基于课题组前期自制的机械装置操作完成的，最后一部分才是scPMA策略的亮点。在常规分析流程中，由于蛋白质组和代谢组在物理化学特性上的根本差异，它们通常需要匹配不同的质谱检测技术。因此，在传统的样本预处理阶段，蛋白质和代谢物会被分离，随后各自经历特定的处理流程，并最终分别进行LC-MS/MS检测。然而，这些额外的分离和处理步骤不仅增加了分析的复杂性，而且往往不可避免地会导致样本的损失，特别是在处理单细胞水平的微量样本时，这种损失尤为显著，可能对研究结果的准确性和可靠性造成影响。基于此，作者希望能够开发一种易于使用的方法来实现同一单细胞个体的蛋白质组和代谢组同步分析。图1 一次性单细胞蛋白质组和代谢组同步分析示意图实际上，代谢物和蛋白酶切后的肽段在C18反相色谱柱上的保留时间是存在差异的。如图2所示，在作者设置的45 min梯度下，大部分A549细胞酶切的肽段在9至17 min的范围内就已流出（图2a），而此时流动相中乙腈的最高含量仅为40%。而A549细胞产生的代谢物则主要分布在17 min之后，只有极少部分是在17 min以前流出（＜10）（图2b）。导致这些现象的根本原因是肽段与代谢物之间疏水性的差异，因此，该策略更适合蛋白组与有一定疏水性的代谢物分析。得益于C18的有效分离，可以在色谱梯度的不同时间段针对不同的样本成分（肽段/代谢物）设置不同的质谱检测参数（图2c）。有效的色谱分离加与之匹配的双区域质谱检测便可实现一次性单细胞蛋白质组和代谢组双重分析。与之前的单组学的结果相比，scPMA策略在定量深度上并无明显差异（图2d-f）。图2 单蛋白质组和代谢组分析与scPMA的性能比较 通过scPMA策略，研究者们能够对单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）进行双重组学分析，平均定量了816、578和293个蛋白质以及72、91和148个代谢物。并利用UMAP聚类和随机森林机器学习模型，基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息，实现了对细胞类型的初步分类（图3、4）。根据结果可得知，细胞在代谢组中的异质性要大于蛋白组。图3 scPMA策略分析单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）图4 基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息对细胞进行分类随后，作者还利用scPMA方法在单细胞水平上研究了多柔比星对肿瘤细胞的诱导作用（图5）。对比药物处理组的各个单细胞样本发现给药后不同的单细胞在蛋白质表达上存在着异质性，这也是在群体分析中无法观察到的现象。与未给药的细胞相比，给药组共鉴定出255个差异蛋白(图5b、c)，一些肺癌细胞中过表达的蛋白显著降低。大部分的差异蛋白涉及的通路与DNA、染色质、核小体的合成有关（图5g）。同样，给药组和未给药组中鉴定出的代谢物也被用于UMAP聚类(图5d)和差异分析。差异分析结果(图5e、f)显示，93种代谢物有差异表达。其中，多柔比星仅在给药组检测到。值得注意的是，在给药组的各个细胞中，多柔比星丰度有明显的离散分布，甚至有10倍的丰度差异。这一结果表明不同的细胞个体具有不同的药物吸收水平，从而表现出明显的细胞异质性，这可能为进一步深入探索提供启发。基于差异蛋白质组和代谢组信息，利用MetaboAnalyst 5.0进行联合通路分析，分别富集出62条和234条相关通路。其中有37条显著相关的通路涉及的差异蛋白和代谢物与核糖体、DNA复制等药物作用机制有关（图5i）。图7.氘代差异分析流程示意图这些结果展示了scPMA策略在单细胞分析中的潜力，尤其是在药物干预研究中的应用前景。同时，这项工作也证明了一次性获取单细胞蛋白质组和代谢组信息的可行性，为未来在细胞分化、衰老和肿瘤免疫等领域的研究提供了新的工具。本文2024年发表在Analytical Chemistry上，One-Shot Single-Cell Proteome and Metabolome Analysis Strategy for the Same Single Cell。该文章的通讯作者是来自浙江大学化学系微分析系统研究所的方群教授。

p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 近日，浙江大学方群团队联合北京大学黄超兰团队在单细胞蛋白质组学分析研究领域取得了突破性进展。 /span 此项成果近日以全文形式在线发表于美国化学会的Analytical Chemistry杂志上(影响因子 6.32)，论文题目为“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/0d88aade-7372-4d68-b5da-4d57efa64b73.jpg" title=" 001.jpg" width=" 650" height=" 478" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 650px height: 478px " / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 图：纳升级油-气-液滴(OAD)芯片和自动定位(SAM)装置的结构示意图(a)和用于单细胞蛋白质组分析的样品前处理和上样的全流程图(b)。 /strong /span /p p 　　蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。 /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 单细胞内蛋白质含量极少，就典型体细胞而言仅为0.1- 0.2 ng，远远小于常规蛋白质组学样品前处理所需要的微克级蛋白量。 /span 并且细胞内的蛋白质通常需要在离心管内完成复杂多步的前处理操作，包括细胞裂解和蛋白质释放、蛋白质沉淀纯化、蛋白质还原和烷基化、酶切等，一个全细胞裂解蛋白质组的最后反应体积均是几十甚至过百微升，在这个蛋白质组学常规前处理的过程中，由于样品与离心管的接触、多步的样品转移和不完全上样等原因，在进入质谱之前不可避免地带来了蛋白质的损失。用此流程来处理单细胞，即使之后结合液相色谱仪器的自动进样阀可以以小于十微升的体积完成上样也无济于事，因为尚未等到分离蛋白质样品就有可能已经损失大半了。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/ce546442-97dc-4a87-a243-558d62afe43e.jpg" title=" 003.png" / /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 如果说单细胞蛋白质组学是在米粒上雕刻，那么两个团队就是造出了适合在米粒上雕刻的工具刀。 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 该项研究起自2014年，两个团队的研究人员协同合作将微流控液滴技术与蛋白质组分析技术相结合，发展了一种微型化的油-气-液“三明治”芯片及相应的纳升级液体操控和进样方法，能够在原位静态的纳升级液滴中完成少量细胞蛋白质组学分析所必需的多步样品前处理操作，并且实现了将液滴样品直接高效地注入到色谱分析柱内完成后续的液相色谱分离与质谱检测。 /span 通过采用优化后的芯片材料、裂解试剂、酶切比例和色谱质谱参数等实验条件，该芯片系统可以分别成功地从100、50、10和1个HeLa细胞内鉴定到1360、612、192和51个蛋白质。更重要的是，研究人员首次实现了以单个鼠卵母细胞为初始样本的蛋白质组学分析，一共鉴定到355种蛋白质，其中存在一系列与生殖发育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相关(AnxA6，Kpna2，Cct6a和Pcbp2)的基因。在该工作中，还采用两种常规的基于离心管的前处理方法进行了对照实验，实验结果明确证实了微流控液滴体系具有更低的样品吸附损失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白质鉴定能力等明显优势，更适用于微量蛋白质样品的蛋白质组学分析。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 此项研究带来三个突破 /span ：首先是成功发展了适合进行单细胞及类似微量样品的蛋白质组学分析样品前处理芯片和方法。芯片内550 纳升的液滴与芯片的接触面积仅为常规离心管模式下的十五分之一，显著减少了样品与反应器接触所带来的损失；二是发展了一种实现纳升级液滴的直接进样方法，利用3D打印加工的自动定位装置和高压气泵高效地(& gt 99%)将液滴样品注入到分析色谱柱内，完全避免了样品转移和经过液相仪器内复杂管路带来的损失；第三是为避免在常规微流控液滴系统中由于油相直接接触液滴而造成的缺陷，提出了一种采用气相来间隔液滴相和油相的新型液滴芯片结构，在成功防止液滴明显蒸发的同时，还避免了油相和液滴相直接接触带来的脂溶性样品的损失，也使系统能更方便地进行后续的分离柱进样、色谱分离和质谱检测。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 该项研究在基于质谱的单细胞及微量样品的蛋白质组学分析方面开启了全新的技术，其所具有的系统结构简单、容易搭建、操作方便、可靠性高等特点，使其有望被广泛应用到细胞间异质性的研究以及与临床相关的研究，包括稀有的循环肿瘤细胞分析、生殖细胞相关研究和疾病诊疗等方面，因此在未来具有巨大的持续开发和应用转化前景。 /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/91e71d83-0fde-4b69-8b5f-10de6af33876.jpg" title=" 未命名_meitu_0.jpg" width=" 400" height=" 400" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 400px height: 400px " / /span /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " （左上：浙江大学 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 教授 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 方群、 /span /strong strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 右上： /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 北京大学 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 教授 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 黄超兰、 /span /strong strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 左下： /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 浙江大学博士生李紫艺、 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 右下：前国家蛋白质科学中心· 上海高级工程师 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 黄敏 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " ） /span /strong /p p 　　该论文的第一作者为浙江大学博士生李紫艺，通讯作者为浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授和北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授。工作得到了国家自然科学基金和中国科学院杰出技术人才项目的支持。黄超兰教授的部分工作在前单位中科院国家蛋白质科学中心· 上海完成，特此鸣谢! /p p style=" line-height: 16px " img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/b0d2802c-066e-4fdf-86c9-b683f1c317de.pdf" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis.pdf /span /a /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 文章链接： /span a href=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" _src=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661 /span /a /p

2014年5月15日，上海——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）近日发布了《蛋白质药物液质分析》应用文集。此文集介绍了蛋白质药物，特别是单抗药物的质谱分析方法。文集汇集了Thermo Fisher大分子质谱应用团队精心编写的八篇综述。所涉及的应用主要包括：完整蛋白质分析、ADC分析、肽图分析、修饰分析、突变监测、二硫键的确定与错配的发现、糖基化分析、残留宿主细胞蛋白分析、蛋白质药物代谢分析等。 文集针对相关分析项目，均描述了完整的分析流程(样品处理——液质分析——数据分析)和以Orbitrap为基础的，液质联用技术(LCMS)相关的整体分析方案及应用实例。 图1. 《蛋白质药物液质分析》 图2. Q Exactive Orbitrap LC/MS 系统 此文集作为国内第一本专注于高分辨质谱在蛋白质药物分析领域的综述文集，特别适合于质谱使用经验较少的分析人员。通过阅读这些精致的综述，分析人员可快速地了解各种LCMS技术及相应的分析项目。对于有丰富的蛋白质液质分析经验的人员来说，同样可以通过文中大量精确专业的引用文献了解最新的应用实例、分析软件与质谱发展趋势。 文集亦可同时作为Thermo Fisher即将开展的“生物制药液质分析技术培训班”的先导读物供广大分析人员参考。 获取《蛋白质药物液质分析》应用文集请联系：Jerry.jia@thermofisher.com欲了解相关产品请点击：http://www.thermo.com.cn/Category409.html 关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有员工约50,000人。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于Thermo Scientific、Life Technologies、Fisher Scientific和Unity? Lab Services四个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过3800名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站www.thermofisher.cn

1. “真”单细胞蛋白质组学引领者2019年8月12日，Nature Methods编辑Vivien Marx在Nature Methods上在线发表了题为“A dream of single-cell proteomics”的文章，蛋白质组学领域的领军人物之一苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold教授在文章中评论到“It’s early days, but it’s not a distant dream to be able to tally the proteins in single cells” 。巧合的是，2019年也是基于timsTOF Pro的4D-蛋白质组学技术开始腾飞的一年。 2020年12月蛋白质组学领域两大领军科学家Matthias Mann团队（Max Planck Institute of Biochemistry)和Ruedi Aebersold团队（ETH Zurich）在Nature Methods发表题为“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition”的文章，其共同开发的基于4D平台的DIA技术——diaPASEF，能够全面提升蛋白质鉴定覆盖率、重现性和定量准确性。因此，4D-DIA技术大幅提升的可靠性，之前不太被大家认可的DIA（数据非依赖性采集）技术真正开始大步向前，也是从此刻开始，4D-蛋白质组学技术的发展一发不可收拾。2021年11月2日，在第69届ASMS会议上，布鲁克公司发布第一代单细胞蛋白质组学质谱timsTOF SCP，“真”单细胞蛋白质组学方案横空出世，全球首台商品化timsTOF SCP落户于广州，表明在单细胞蛋白质组学领域中国研究者的前瞻性。在timsTOF SCP发布的第一年，单个HeLa细胞蛋白质鉴定已经接近2500种，即使在现在，这个单细胞鉴定深度也是其它质谱仪所不能企及的。这也让蛋白质组学领域领军科学家之一Matthias Mann教授发出了"I always said that single cell proteomics would not happen in my lifetime, but I'm happy to have been proven wrong。" 这样的感叹。2. “真”单细胞蛋白质组学质谱进化到第二代，可以上车了 2023年6月5日，在第71届ASMS会议上，布鲁克公司继续在“真”单细胞蛋白质组学上发力，重磅发布了timsTOF Ultra，“真”单细胞蛋白质组学质谱发展到第二代。timsTOF Ultra配备新型Captive Stray（CSI）Ultra离子源，第四代TIMS（捕集离子淌度）XR离子淌度和14位数模转换器，MSMS扫描速度提升到300Hz，继续占据MSMS扫描速度的头把交椅。 以HeLa细胞为例，人们一般认为单个细胞的蛋白质含量为200-250pg，于是有人将250 pg的进样量的蛋白鉴定数目等价于单细胞蛋白质组鉴定数目，但实际上系列稀释样本可以用来部分表现仪器灵敏度，无法代表真正单个细胞蛋白鉴定水平，“真”单细胞蛋白质组学的数据才是检验质谱灵敏度的唯一标准。布鲁克公司在第一代“真”单细胞蛋白质组学质谱timsTOF SCP上积累的宝贵经验和技术，在第二代timsTOF Ultra上完全得到了释放，通过CellenOne对HeLa细胞分选，获取1个、5个和10个细胞，采用dia-PASEF方法进行数据采集，Spectronaut 18数据分析，单个细胞22min可以鉴定超过3700种蛋白质（每个样本3针重复），1个HeLa细胞两次重复所鉴定的蛋白质强度相关系数0.95，显示出低至1个细胞的进样量也能得到高重复性。 德国柏林马克斯德 尔布吕克分子医学中心空间蛋白质组学研究小组负责人Fabian Coscia博士采用第一代“真”单细胞蛋白质组学质谱timsTOF SCP进行FFPE组织的单细胞分析，单个肝细胞当量的组织可以定量1500-2000种蛋白质。timsTOF Ultra灵敏度的提升，必将在FFPE组织的单细胞分析中发挥更强大的威力。3. “真”单细胞蛋白质组学主打“成熟可复制”单细胞蛋白质组学研究是一项复杂而前沿的科研领域，涉及许多挑战和门槛，比如用什么技术进行单个细胞的分选、分选后对单个细胞操作时怎么尽可能将低样本损失、质谱的灵敏度能否达到单细胞蛋白质组学所需灵敏度，这些挑战和门槛让很多研究者对单细胞蛋白质组学望而却步。布鲁克推出的一套完整的“真”单细胞蛋白质组学方案，把单细胞蛋白质组学研究的这些挑战和门槛全部打破，主打一个“成熟可复制”，甚至没有蛋白质组学经验的人也可以快速上手，短时间内就可产生高质量单细胞蛋白质组学数据。小结得益于质谱技术的进步，单细胞蛋白质组学领域将很快迎来爆发，布鲁克timsTOF Ultra的发布，必将成为单细胞蛋白质组学领域爆发的强劲动力。timsTOF Ultra超越了传统的限制，为新的科学可能性打开了大门。无论是单细胞蛋白质组学、免疫肽组学或者血浆蛋白质组学，timsTOF Ultra提供了无与伦比的扫描速度和灵敏度，帮助研究人员打破工作的界限并取得突破性成果。参考文献1. Marx, V. A dream of single-cell proteomics. Nat Methods 16, 809–812 (2019). 2. Meier, F., Brunner, AD., Frank, M. et al. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods 17, 1229–1236 (2020). 3. Brunner, AD., Thielert, M., Vasilopoulou C. et al. Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation. Molecular Systems Biology (2022)18:e107984. Makhmut, A., Qin, D., Fritzsche, S., et al. A framework for ultra-low input spatial tissue proteomics. bioRxiv 2023.05.13.540426

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong span style=" text-indent: 2em " 仪器信息网讯 /span /strong span style=" text-indent: 2em " 蛋白质组学是生命科学领域中的一门新兴学科，可以高通量的分析正常及病理条件下机体、组织、细胞或亚细胞成分中全部蛋白质，对不同空间、不同时间上动态变化的蛋白质组的整体进行比较，分析不同蛋白质组之间在表达数量、表达水平和修饰状态下的差异。蛋白质组学可以发现与疾病相关的特异性蛋白质，对病变相关蛋白的研究可以为探索病毒本身及其感染机制提供信息，且这些蛋白还可能作为疾病诊断潜在的生物标志和治疗的药物靶点。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 蛋白质组概念的提出及常用技术 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 蛋白质组（proteome）这一概念由Wilkins和Williams等在1994年首次提出，以它作为研究对象的蛋白质组学是后基因组时代产生和发展的一门新兴学科，其从整体上分析组织，细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与翻译后修饰，探索蛋白质的功能及蛋白质之间相互作用与联系。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 蛋白质组学中对蛋白表达分析方面的研究应用较多的技术有双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）、基于2-DE将其重复性和精确性加以改进的双向差异凝胶电泳（two-dimensional difference electrophoresis,2D-DIGE），以及对筛选到的差异表达蛋白进行快速精确鉴定的串联质谱技术（mass spectrometry,MS），其中质谱技术是蛋白质组学研究中的核心技术。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 在质谱技术中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOFMS）是分析多肽和蛋白质混合物的主要方法，此外，使用标记的氨基酸在细胞中进行稳定同位素标记（stable-isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）& nbsp 是一种鉴定和定量病毒感染后细胞蛋白中表达差异的有效方法。蛋白质组学技术在病毒学中的应用有助于病毒感染及病毒宿主间的相互作用机制研究。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 蛋白组学技术在及其感染机制研究中的应用案例 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 病毒寄生于宿主细胞中，需要不断地适应和改变宿主的环境。他们能够编码多种多功能蛋白质，这些蛋白能与宿主蛋白发生一系列的相互作用以完成病毒的各种功能。目前，许多病毒的基因组已完成测序，但由于受到病毒影响而发生相应改变的宿主蛋白组、宿主蛋白翻译后修饰等还未被完成阐明。近年来，高通量技术的兴起，如基于质谱技术的定量或半定量蛋白组方法，已被广泛应用于病毒宿主相互作用的研究中。依托质谱技术的蛋白质组学飞速发展，不仅促进了病毒蛋白质组学研究的不断进步，同时也加快了对于病毒相关的宿主蛋白鉴定。今后相关研究数据仍会急速增加，这需要更加先进的生物信息学技术对数据进行处理，更全面地了解病毒感染过程。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 案例1: SARS（severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus,SARS-CoV）冠状病毒研究中的蛋白组学技术 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " SARS基因组的基因产物包括20多种蛋白质，据报道，有研究学者首次应用DIGE技术分析了SARS-CoV感染的Vero E6细胞，鉴定出355个在SARS-CoV感染后表达发生变化的蛋白，其中186个显著差异表达蛋白，为理解SARS-CoV的感染和致病机制提供了线索。对感染SARS-CoV的BHK21细胞进行SILAC定量分析及进一步功能分析表明，BAG3可以抑制SARS-CoV的复制。对感染病人的血清蛋白质组分析，有助于返现可用于病毒感染的诊断、预后及治疗的生物标记。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 案例2: 禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）研究中的蛋白质组学技术 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 据报道，研究学者利用2-DE技术筛选H9N2感染人源细胞系后不同时间点的差异表达蛋白，运用质谱技术鉴定到22种蛋白，主要包括细胞骨架蛋白、RNA加工途径相关蛋白和代谢相关蛋白等，其中表达差异显著的蛋白主要参与细胞骨架网络的构成。这些蛋白的鉴定有助于理解禽流感病毒在哺乳动物中的复制及其宿主之间的相互作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 案例3: 揭示新型寨卡病毒宿主因子的蛋白质组学技术 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 寨卡病毒(ZIKV)是一种与登革热病毒，西尼罗河病毒和丙型肝炎病毒（HCV）有关的黄病毒，具有单链RNA基因组，编码多蛋白，共翻译和翻译后加工成三个结构蛋白，前体膜和包膜以及七种非结构蛋白。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 据报道，有研究学者使用人类神经前体细胞和神经细胞 SK-N-BE2 进行整合蛋白质组学方法，以表征细胞在病毒侵染后的蛋白质组和磷酸化蛋白质组变化，并使用亲和蛋白质组学来鉴定ZIKV蛋白的细胞靶标。通过亲和纯化结合液相色谱和串联质谱技术（AP-LC-MS / MS）鉴定与人SK-N-BE2神经母细胞瘤细胞中表达的10种ZIKV蛋白中的每一种相互作用的细胞蛋白和相关复合物，研究鉴定到了386种 ZIKV 相互作用蛋白、ZIKV 特异性和泛黄病毒活性相关的宿主因子，这些宿主因子已知与神经元发育、视网膜缺陷和不育相关。由此，相关论文作者绘制了神经元细胞中的ZIKV蛋白-宿主蛋白相互作用网络。此外，研究还分析确定了在 ZIKV 感染后特异性上调或下调的1,216个磷酸化位点，表明病毒感染引起基本信号传导通路为 ZIKV 感染引起的增殖停滞提供了新的见解。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 当前， span style=" text-indent: 2em " 通过比较蛋白质组学对病毒感染前后的蛋白表达图谱进行鉴定，进一步对病毒感染引起的差异表达蛋白进行功能分析和验证，探索其在病毒感染中的潜在作用机制、寻找病毒的作用靶标，为病毒的预防诊治提供理论依据和解决途径。& nbsp /span 因此，在继病毒感染细胞的差异蛋白质组分析后，为更能反映真实的变化规律，更到位的解释病毒感染和致病机制，进行病毒感染宿主机体的差异及功能蛋白质组分析将是研究发展的趋势。 /p p br/ /p p br/ /p p br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 参考文献： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 董 书 伟 ，荔 霞 ，刘 永 明 ，等 .蛋 白 质 组 学 研 究 进 展 及 其 在 中 兽 医 学 中 的 应 用 探 讨 [J ] . 中 国 畜 牧 兽 医 ， 2 0 1 2 ， 3 9 (1 ) : 4 5 ~ 4 9 . /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Liu H.Advances of SARS-Cov genome[J].Journal of Chinese General Practice，2003，2(11):1~4. /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Liu N，Song W，Wang P，et al.Proteomics analysis of diferen- tial expresion of celular proteins in response to avian H9N2vi- rus infection in human cels[J].Proteomics，2008，8(9):1851~ 1858. /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Pietro S ,Alexey S , Haas D A , et al. An orthogonal proteomic survey uncovers novel Zikavirus host factors[J]. Nature, 2018. /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " & nbsp /p p br/ /p

近日，华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋、朱麟勇、陈显军团队在活细胞蛋白质标记与成像研究中取得重要进展，相关研究在《细胞发现》发表。 人造荧光蛋白及荧光探针。华东理工供图生物过程可视化一直吸引着科学家的好奇心。不同类型的荧光成像工具可以帮助科学家观察生命体中多种生物事件的发生过程，其中最著名的是荧光蛋白标记技术。荧光蛋白及其衍生技术经历了近30年的飞速发展，为生物学各个领域的研究作出了极大贡献，但伴随着显微镜技术的飞速发展，现有荧光蛋白的性质已经难以适应新型仪器的成像要求。相比之下，基于蛋白质标签和激活型荧光团的荧光标记工具凭借其理化性质成为新的研究热点。该团队针对自催化蛋白质标签SNAP-tag，设计开发了高信噪比的青色人造荧光蛋白SmFP485。SmFP485的荧光产生十分迅速，避免了荧光蛋白生色团成熟导致的延迟，因此可以用于实时监测蛋白质的合成过程。研究团队随后对SmFP485的结构进行了解析，探究了人造荧光蛋白的荧光激活原理。在此基础上，研究团队通过化学进化方法设计出一系列光谱覆盖绿色到近红外波段的人造荧光蛋白，它们均具有高亮度和高信噪比特点，特别是其在近红外波段的亮度已远超现有成像工具，能够对活细胞以及活体动物中的蛋白质表达、蛋白质降解、蛋白质组装、蛋白质相互作用以及蛋白质运输进行原位实时标记与成像。最后，研究团队在多色人造荧光蛋白的基础上，采用蛋白质与荧光团共进化的方法设计开发出一系列光谱涵盖青色到近红外波段的钙离子遗传编码荧光探针，实现了对哺乳动物细胞中钙离子震荡的实时监测，为荧光探针的构建提供了新的荧光载体。综上，研究团队开发了一系列高性能人造荧光蛋白，它们具有荧光产生迅速、亮度高、信噪比高、光谱范围广等优点，为活细胞以及活体动物中蛋白质的可视化提供了有力工具，同时也为荧光探针的构建提供了新的思路和策略。

导论近期，来自法兰克福大学医学病毒学研究所和歌德大学医学院团队利用一种新颖的蛋白质组学方法对新冠病毒进行研究，加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标，提出新冠治疗新疗法。治疗选择细胞层面理解从2019年底由SARS-CoV-2（2型严重急性呼吸综合征冠状病毒）引起的新型冠状病毒疾病（COVID-19）具有高传染性，该病已发展至全球大流行。全球迫切需要开发抑制病毒感染或复制的疗法。SARS-CoV-2与其他冠状病毒有相似之处，所以目前主要通过对已用于其他适应症的药物库进行高通量筛选，鉴定出许多临床上认可的药物，但却缺乏对SARS-CoV-2感染的治疗选择和细胞层面理解。法兰克福大学医学病毒学研究所的Jindrich Cinatl教授和歌德大学医学院的Christian Münch教授团队发表最新研究中，建立感染SARS-CoV-2的Caco-212细胞模型，运用一种新颖的多重增强蛋白质动力学(multiplexed enhanced protein dynamicsme, mePROD)方法进行蛋白质组学分析，能够在高时间分辨率下确定转录组和蛋白质组的变化，加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标。一、构建细胞感染模型想要开展该研究的重点取决于两点01是否有合适的允许病毒感染的细胞培养模型；02对蛋白质进行时间感染特征分析的敏感蛋白质组学方法。 该研究建立针对SARS-CoV-2高度兼容的细胞模型，在病毒感染24小时后就能迅速见到细胞致病作用 (图1A)。在病毒感染细胞后的2h、6h、10h和24h，分别用定量PCR技术测量上清液中的病毒RNA拷贝数，发现感染后SARS-CoV-2 RNA数量不断增加（图1B）。这表明模型可以用于研究细胞中SARS-CoV-2。图1. SARS-CoV-2 在细胞内快速复制模型。A, 病毒感染24小时后的细胞形态变化 B, 细胞上清液中病毒RNA拷贝数的增加。二、翻译抑制剂防止SARS-CoV-2病毒复制建立好模型，研究人员需要利用一种高效的方法确定SARS-CoV-2感染的时间分布，这时候mePROD蛋白质组学方法应运而生，即基于Orbitrap高分辨质谱仪联用新蛋白代谢标记（SILAC）和串联质量标签（TMT）两种标记方法，进行蛋白差异分析。图2. mePROD蛋白质组学实验流程抑制宿主翻译先前已被用作治疗MERS-CoV等多种冠状病毒感染性疾病。与其他病毒抑制宿主蛋白的合成从而增加病毒蛋白的合成不同，该方法挖掘数据表明SARS-CoV–2仅引起宿主翻译能力的微小变化，作者推测SARS-CoV-2复制可能对翻译抑制更为敏感。通过测试了两种翻译抑制剂，即环己酰亚胺（cycloheximide, 翻译延伸抑制剂）和曲美汀（emetine, 抑制40S核糖体蛋白S14）。在无毒浓度下，两个化合物均对SARS-CoV-2复制产生了显着抑制作用从而发现翻译抑制剂是细胞中SARS-CoV-2复制的有效抑制剂。图3. 环己酰亚胺和曲美汀对病毒复制的抑制作用三、发现潜在的抗病毒靶标重点来了，通过前期蛋白质组学大数据挖掘，目前一张蓝图已展现在眼前，下一步的重中之重就是探究与病毒蛋白共同增加的宿主蛋白，从而寻求潜在的SARS-CoV-2复制抑制剂。作者分析了与病毒蛋白变化趋势相似的蛋白，在数据中富集的代谢途径主要由不同的核酸代谢子途径组成。基于此，研究者测试核苷酸合成抑制剂对细胞中SARS-CoV-2复制的影响，高达10 μM的布雷奎纳（brequinar，抑制双氢乳清酸脱氢酶并不具有抗病毒的作用。相比之下，低浓度下的利巴韦林（ribavirine，抑制肌苷一磷酸脱氢酶）即可抑制SARS-CoV-2复制（图4C），这表明利巴韦林是可以进行进一步检测的候选药物。此外，与蛋白质折叠相关的蛋白变化与病毒蛋白质较为一致，p97是AAA家族的六聚体ATPase酶，也是真核生物最丰富的蛋白之一，通过调节蛋白的稳定性来执行一系列生物学功能，参与膜融合、蛋白降解等过程。测试p97的小分子抑制剂NMS–873对SARS-CoV-2复制的影响。研究表明，NMS–873在低纳摩尔浓度下即可完全抑制SARS-CoV–2（图4D）。图4. 核酸代谢相关的蛋白水平与病毒基因表达相关。A, 病毒蛋白随感染时间的变化；B, 宿主蛋白与病毒蛋白关联的GO分析；C, D, Ribavirin和NMS–873的抗病毒实验。（点击查看大图） 结论全球对于病毒高效治疗方案的需求非常紧迫，深入了解病毒机理及致病性相关的生物途径变得非常关键。定量蛋白质组学是病毒机理研究的主要手段之一，文中提及的mePROD蛋白质组学研究方案均基于Orbitrap组学金标准技术，能够提供超高分辨率和灵敏度，可为病毒蛋白质组学研究者所面临的挑战“样本基质复杂、蛋白质鉴定数量不足、假阴性/假阳性结果”提供强大的技术保障。

2023年3月29日，张锋教授及其团队在 Natrue 期刊发表了题为：Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system 的研究论文。通过AlphaFold辅助蛋白质设计开发了一种蛋白质递送系统——改造、利用独特的细菌“注射器”将蛋白质注射到人类细胞中。这一系统为将各种蛋白质（包括用于基因编辑的蛋白质）递送到不同类型的细胞提供了一种安全有效的方式，有望改变基因治疗、癌症治疗等前沿疗法格局。内共生细菌是一类特殊的细菌，它们可以寄生在宿主细胞的内部，并已然进化出复杂的传递系统使其分泌调节宿主细胞的生物因子。例如，细胞外可收缩注射系统（eCIS），正是这样一种类似于“注射器”的大分子复合物。eCIS通过驱动一个“针头”结构穿透细胞膜，然后将携带的蛋白质有效载荷注入到真核细胞中。在这项最新研究中，张锋团队首先选定了eCIS的一个亚型——Photorhabdus virulence cassette（PVC）。PVC由一个约20kb的操纵子组成，包含16个核心基因（pvc1-16），以及下游的有效载荷Pdp1和Pnf。研究团队发现，PVC有效载荷蛋白的N端高度无序区域是其“包装结构域”，只要将其与想要递送的蛋白（例如GFP）融合，就能将其加载到PVC复合体中。PVC系统可以被重新编程以在真核细胞中定制蛋白递送于是，研究团队使用人工智能蛋白设计平台AlphaFold，通过氨基酸序列预测蛋白质结构，重新设计了发光杆菌的注射器，使之从靶向结合昆虫细胞改为靶向结合人类细胞。类似的，这套系统也可以学会靶向小鼠细胞。细胞实验的结果显示，经过改造，“注射器”识别人类细胞和小鼠细胞的效果接近100%。同时，研究人员通过重新设计发光杆菌eCIS的另一部分，还能根据需要让它们装载不同的蛋白质，包括基因编辑系统的核酸酶Cas9、碱基编辑器、可以杀死癌细胞的毒素等。重新设计细菌的胞外可收缩注射系统，将其改造为专门靶向特定人类细胞递送所需蛋白质的装置结果表明，PVC系统经过改造后可以在细胞和体内靶向递送蛋白质，并在基因编辑、癌症治疗和临床靶向递送等领域展现出广阔的应用前景，未来可能成为许多生物疗法的关键递送工具。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7

近日，科创中心生物与分子智造研究院分子智造研究所所长方群教授团队再出新成果！团队开发了“点取式”单细胞蛋白质组分析（PiSPA）工作流程和基于纳升级微流控液滴操控机器人，实现了单细胞的精准捕获、前处理以及自动进样，并首次在单个哺乳动物细胞中实现了高达3000种蛋白质的超高定量深度。目前，相关研究成果以“ Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell ”为题在国际权威期刊《自然通讯》上发表。这项成果也再次向我们证明了单细胞蛋白质组学在诊疗和预防、药物开发、癌症基因组学等精准医学研究中的应用潜力。团队自研的探针式微流控液滴操纵机器人系统更强大的单细胞蛋白质组分析工具：PiSPA工作流程单细胞蛋白质组学技术是近年来生命科学领域研究的热点。因单个细胞中的蛋白质含量极微（仅约0.2 ng）且无法扩增，单细胞蛋白质组分析极具挑战性。目前传统蛋白质组分析技术仅能在每个细胞中鉴定1000种左右的蛋白质，而这在单细胞分析领域显得有些“力不从心”。此外，传统的样本前处理操作大多在微升级反应器中进行，在样品处理和转移的过程中会出现明显的样品损失，这会限制单细胞蛋白质组学的鉴定深度，难以满足生命科学研究的迫切需求。“想要突破单细胞蛋白质组学鉴定深度的障碍，有两种策略。一是在足够小的微反应器中进行样品前处理，利用微尺度效应提高反应效率；二是将所有操作整合在一起，降低样品损失，但这两种策略对技术与设备的要求都很高”，本项成果第一完成人王宇博士解释道，“我们利用微流控技术将商品化的内插管改造为阵列化的纳升级微反应器，解决了纳升级样品反应与自动进样的问题。PiSPA平台可自动完成细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测、数据处理等操作，进一步降低了样品损失。”“点取式”单细胞蛋白质组分析流程示意图PiSPA工作流程使得高精度的液体操控、单细胞的精确处理以及先进的LC-TIMS-QTOF MS技术融为一体，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。“在研究中，我们将该平台应用于三种哺乳动物细胞（HeLa、A549和U2OS细胞）的单细胞蛋白质组分析，以及HeLa细胞迁移过程中的细胞异质性研究中，均实现了超高深度定量分析”，王宇博士说。同时，迁移细胞的单细胞蛋白质组分析也证实了PiSPA平台具有识别细胞迁移关键分子以及有价值靶点的应用潜力。哺乳动物细胞的单细胞蛋白质组分析结果单细胞的定量深度：从3000+走向全蛋白质组测序PiSPA平台集成了基于序控液滴（SODA）技术的自动化液滴操纵机器人，能够在“点取式”操作模式下实现纳升级的细胞分选、多步样品前处理和自动进样操作。相比于其他单细胞分析方法，PiSPA平台的优势主要体现在与成像技术结合，能够灵活地选择任意单个细胞进行分析，目标细胞的捕获指向性强，具有很高的捕获准确性和成功率，并可保留目标细胞的表观和空间信息，显著增加了单细胞分析的信息维度。其次，PiSPA平台采用针对单细胞样品的“定制化”分析条件，实现了蛋白质鉴定深度的大幅提升，能够为生物医学研究提供更多有效的基础数据。这些优势对推动单细胞蛋白质组分析的实际推广应用具有重要意义。“目前的单细胞定量深度只是一个起点”，方群教授分享道，在该项研究中，可从单个哺乳动物细胞中可定量多达3000种蛋白质，约占人类基因编码蛋白质总数（约20,000种）的15%，其鉴定深度已经达到10年前单细胞转录组测序技术的相近水平。类比单细胞转录组测序技术的发展历史，可以预见当前已处于单细胞蛋白质组分析技术的爆发阶段，随着技术的快速革新，单细胞的定量鉴定深度还将得到史无前例的提升。“这意味着单细胞蛋白质组学技术已进入在广泛的生物医学研究领域中实际应用的阶段。”团队表示，未来，他们将进一步提高单细胞蛋白质组分析的鉴定深度和通量，以持续推进该技术实用化和应用拓展的水平。此外，在上述成果基础上，目前团队还在利用iChemFoundry平台的自动化机器人技术和机器视觉技术构建能够完成单细胞蛋白质组分析全部流程操作自动化的分析平台，很快会有新的成果发布，这些都将为人们了解生命活动中细胞异质性的变化带来更有力工具。

iPSC简介2006年Takahashi和Yamanaka突破性发现使终末分化、谱系受限的成体细胞：如皮肤活检来源的成纤维细胞、外周血来源的T淋巴细胞、毛囊细胞等，通过转录因子OCT4、SOX2、KLF、c-MYC、NANOG和LIN28的强制异位表达直接将其重编程为多能状态的细胞，这些细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。iPSC与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESC)有相似的基因表达、表观遗传谱和分化潜能，可产生任何类型的体细胞。并且避免了ESC基于使用胚胎来源细胞和可能导致异常发育的体外受精胚胎的伦理问题，因此iPSC在医疗领域里具有更好的应用和产业化发展前景。iPSC应用和挑战描述任何人类疾病和药物发现的病因学和病理生理学的主要关键组成部分是需要一个生理相关的疾病实验模型，无论是体外还是体内或两者，需要忠实地概括各自的病理生理学和临床表现。因此基于人类iPSC的疾病模型可以无限供应临床相关的表型细胞、以及它们具有的衍生潜力，可以加速阐明生物医学研究中疾病的病因机制，应用于新药发现、药物效价测试、预测药物安全性药理学/毒理学研究，以及基于iPSC的再生细胞疗法，有望治疗心脏病、帕金森、视网膜和角膜疾病、肝脏衰竭、糖尿病、脊髓损伤等疾病。然而将iPSC治疗方法真正有效转化为临床环境，保证患者安全，还需解决：临床级iPSC的衍生和通用细胞系的生物库建立；需要定义iPSC及其差异化治疗细胞产品可接受质量属性；致瘤性问题；免疫排斥反应；选择同种异体或自体 iPSC 以获得更有效的细胞治疗的难题；iPSC 谱系表型细胞和细胞系变异的异质性；基于iPSC的多基因、散发性和迟发性疾病的患病模型的挑战；需要大量的患者iPSC以实现更有效的病因学和临床转化；iPSC衍生的表型细胞缺乏成熟度；遗传的不稳定性等挑战。iPSC-CM研究和面临的问题心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)作为全球主要的死因之一，每年会导致约1790万人死亡，所以迫切需要可以延缓疾病进展并且可以改善心脏功能和预防衰竭的治疗方法。而目前的药物、介入或手术方法可能会改善临床结果，但由于无法促进心脏组织修复和再生，因此使这种治疗方法的成功率得不到提升。人类诱导多能干细胞(hiPSC)技术的出现以及随后在培养物中分化和建立心肌细胞（cardiomyocytes，CMs)的能力，为实现人类心脏再生疗法创造了可能性。作为分化CMs的连续和生物学相关来源，hiPSC-CM是心血管研究界的宝贵工具，不仅可用于治疗CVD，还可用于模拟人类心脏发育和疾病、研究潜在机制以及筛选具有疗效和心脏毒性的新药。由于hiPSC-CM由不同的细胞亚群组成，这些细胞亚群是异质的、未成熟的、表达胎儿基因表达谱，并且与成人心肌细胞相比收缩力减少，因此hiPSC-CM疾病模型的准确性和实用性仍然有限。此外，随着hiPSC-CMs的成熟和蛋白质表达动态的波动，大量样品分析的分辨率变得不足。由于其异质性导致心室样、心房样和节点样亚群，需要严格表征hiPSC-CM，并应对其成熟度、身份和功能进行筛选。为此，需要进行单细胞分析模式以了解这种异质性。细胞异质性研究方法虽然单细胞测序技术在分析单细胞转录组学和基因组信息的通量和规模方面取得了进步，但由于任何一个细胞中存在的蛋白质含量非常低，因此难以满足对定量、单细胞蛋白质组学技术的需求。此外，蛋白质组的复杂性和广泛的浓度范围（fM到高nM）带来了额外的挑战。为了在单细胞水平上进行生化蛋白质表征分析，高灵敏度工具是必不可少的。来自ProteinSimple的单细胞蛋白质分子技术：Milo是一种基于微流体的芯片电泳技术。可以克服单细胞蛋白质组学方法面临的障碍。Milo操作流程将细胞悬浮液加载到Milo芯片上，这样单个细胞就可以安放在芯片上的各个微孔中。然后Milo裂解细胞，产生单细胞裂解物，通过分子量电泳分离每个单细胞裂解物中的蛋白质，然后使用紫外线在Milo芯片中捕获蛋白质。然后，对目标蛋白进行一级抗体和荧光二级抗体进行免疫荧光捕获。通过使用开放格式的微阵列扫描仪对芯片进行成像，并使用Scout™ 软件对图像进行分析，以进行定量的自动数据分析。Milo追踪定量不同iPSC-CM亚型与免疫荧光和流式细胞术等其他单细胞分析系统不同，单细胞Western Blot技术Milo可以提供分子量大小信息，以及在单细胞水平测量蛋白质表达时的免疫结合信息，赋予额外的特异性。这种分子量分级步骤可以分辨不同物种的不同蛋白质亚型或区分脱靶抗体结合。为了表征CMs亚型标志物，通过Milo检测了肌球蛋白调节轻链2心房亚型（MLC2A或MYL7）及其心室亚型（MLC2V或MYL2）的蛋白质表达。可以观察到Milo鉴定了三个亚群，这些亚群由MLC2A或MLC2V的单一表达或共表达组成。Milo检测到hiPSC-CM亚型特异性心室和心房标记物MLC2V和MLC2A，在45秒的电泳运行时间内，迁移到总泳道长度的60%（图A）。使用Milo-Scout™ 软件通过找到典型峰形与源自原始荧光图像的一维强度图的卷积的局部最大值来识别峰中心。检测到的MLC2A、MLC2V和GAPDH峰的峰中心位置也由泳道指数显示（图B），显示出单个Milo芯片上所有孔的峰迁移的均匀性。为了评估芯片位置（图C）是否影响峰面积量化，比较了空间不同块之间计算的峰面积方差：每个块区域之间的差异小于2.5%（图D）。应用优化的Milo的检测方法研究hiPSC-CM随时间的异质性，观察整个分化时间线中蛋白质表达的变化。在第17、23和30天从培养物中提取hiPSC-CM细胞，检测MLC2A和MLC2V蛋白质表达。结果显示，共表达MLC2A和MLC2V阳性细胞的比例在整个分化过程中增加，而仅表达MLC2A(MYL7+)的细胞比例随时间减少。且三个亚群中每个亚群中的细胞百分比在所有芯片中一致重现。为了了解在整个分化过程中每个标记物的表达水平在hiPSC-CM亚群中的变化，在hiPSC-CM分化的第17、23和30天对MLC2V和MLC2A的表达进行了量化。随着分化的进行，MLC2A的总水平略有增加。然而，MLC2V表达在第23天和第30天之间增加了近三倍（图C）。为了了解驱动MLC2V表达增加的细胞亚群，三个亚群（MLC2A+、MLC2V+和共表达MLC2A+和MLC2V+）被进一步分层（图D）。MLC2V的水平在共表达MLC2A+和MLC2V+亚群中显着增加，以及在单独的MLC2V+亚群中增加。为了进一步了解导致hiPSC-CM分化过程中MLC2V表达显着增加的机制，对先前从三个iPSC系产生的hiPSC-CM进行了Milo分析，其中转录因子NR2F2 (NR2F2GE)、TBX5 (TBX5GE) 的外显子)和HEY2 (HEY2GE) 被CRISPR/Cas9编辑删除。利用这些品系来验证NR2F2、HEY2或TBX5缺陷在单细胞蛋白质水平上对MLC2V表达的影响。结果显示，TBX5GE和HEY2GE hiPSC-CM中MLC2V的单细胞表达显着降低（图E）。此外，MLC2V表达的显着下降归因于共表达MLC2A和MLC2V亚群（图F）。鉴于共表达MLC2A和MLC2V的亚群增加了MLC2V的表达，推测单独表达MLC2A的未成熟hiPSC-CM会随着时间的推移共同表达MLC2V，从而变得更像心室。同时使用预测调节MLC2V（HEY2或TBX5）的转录因子缺陷的两种细胞系时，我们仅观察到MLC2V在共表达MLC2A和MLC2V亚群中表达降低。这可能表明单独表达的MLC2V群体代表了一个独特的细胞亚群，并且该亚群中MLC2V的表达受替代转录因子的调节。结论：随着在基础和转化心脏研究中的应用，hiPSC-CM正被用于心血管疾病和心脏发育研究。然而，由于hiPSC-CM由不同的细胞亚群组成，并且hiPSC-CM蛋白表达动力学随着成熟而波动，一些蛋白分析方法可能因为分辨率不足而无法检测单细胞蛋白异质性，因此hiPSC-CM的单细胞蛋白质组学可能受到依赖抗体结合检测而无法评估脱靶结合技术的限制。单细胞蛋白质分析技术Milo，通过靶点分子量差异和抗体识别特异性蛋白标记物，避免了抗体脱靶结合的现象，同时能够跟踪单细胞亚群蛋白表达随时间的变化，从而能够识别并量化hiPSC-CM中不同的异质性亚群，应用于疾病建模和再生医学治疗研究。参考文献：1 Current Challenges of iPSC-Based Disease Modeling and Therapeutic Implications.2 Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes.3 Single-cell protein expression of hiPSC-derived cardiomyocytes using Single-Cell Westerns.

《自然》选出将在未来一年对科学产生巨大影响的工具和技术。从蛋白质测序到电子显微镜，从考古学到天文学，本文将讲述七项有可能会在未来一年震动科学界的技术。　　单分子蛋白质测序　　蛋白质组体现了细胞或生物体制造的一整套蛋白质，可以提供关于健康和疾病的深入信息，但对蛋白质组的表征仍然是一项挑战性的工作。　　相对于核酸来说，蛋白质是由更多的分子砌块(building blocks)组成的，约有20种天然存在的氨基酸(相比之下，组成DNA和信使RNA等分子的只有4种核苷酸) 因此，蛋白质具有更大的化学多样性。有些蛋白质在细胞中的含量较少 并且与核酸不同，蛋白质不能被扩增 ——这意味着蛋白质分析方法必须使用任何能用的材料。　　大多数蛋白质组学分析使用质谱法，这是一种根据蛋白质的质量和电荷来分析蛋白质混合物的技术。这些谱图可以同时量化数千种蛋白质，但检测到的分子并不总能明确识别，并且混合物中的低丰度蛋白质常常被忽视。现在，能对样本中的许多(甚至全部)蛋白质进行测序的单分子技术可能即将问世，其中许多技术类似于用于DNA的技术。　　德克萨斯大学奥斯汀分校的生物化学家Edward Marcotte正在研究一种这样的技术，称为荧光测序(fluorosequencing)[1]。Marcotte的技术报道于2018年，该技术基于一种逐步的化学过程，在此过程中，单个氨基酸被荧光标记，然后从表面偶联蛋白的末端逐个被剪切下来，此时摄像机会捕捉到所产生的荧光信号。Marcotte解释道：“我们可以用不同的荧光染料标记蛋白质，然后在切割时逐个分子地观察。”去年，位于康涅狄格州的生物技术公司Quantum Si的研究人员描述了一种荧光测序的替代方法，该方法使用荧光标记的“粘合剂”蛋白来识别蛋白质末端的特定氨基酸(或多肽)序列[2]。　　其他研究人员正在开发模仿基于纳米孔的DNA测序技术，根据多肽通过微小通道时引起的电流变化来分析多肽。荷兰代尔夫特理工大学的生物物理学家Cees Dekker及其同事于2021年展示了这样一种方法，他们利用蛋白质制成纳米孔，并能够区分通过纳米孔的多肽中的单个氨基酸[3]。在以色列理工学院，生物医学工程师Amit Meller的团队正在研究由硅基材料制成的固态纳米孔器件，该器件可以同时对许多不同的蛋白质分子进行高通量分析。他说：“你可能可以同时观察数万甚至数百万个纳米孔。”　　尽管目前单分子蛋白质测序只是概念上的验证，但其商业化正在迅速推进。例如，Quantum Si公司已宣布计划今年推出第一代仪器，并且Meller指出，2022年11月在代尔夫特举行的蛋白质测序会议上有一个专门针对该领域初创企业的讨论组。他说：“这让我想起了第二代DNA测序技术面世前的那些日子。”　　Marcotte是德克萨斯州奥斯汀市蛋白质测序公司Erisyon的联合创始人，他对此持乐观态度。他说：“这已经不是个行不行的问题，而是这项技术几时能送到人们手上。”　　詹姆斯韦勃太空望远镜　　天文学家们从去年开始就翘首以盼，兴奋不已。经过20多年的精心设计和建造，美国国家航空航天局(NASA)与欧洲航天局和加拿大航天局合作，于2021年12月25日成功将詹姆斯韦布太空望远镜(James Webb Space Telescope，缩写JWST)送入轨道。因为仪器设备需要展开并确定第一轮观测的位置，全世界不得不等待了近七个月，JWST才开始正常工作。　　等待是值得的。马里兰州巴尔的摩市太空望远镜科学研究所天文学家、JWST的望远镜科学家Matt Mountain表示，最初传来的图像超出了他的最高预期。“实际上天空并不空旷——到处都是星系，”他说，“理论上我们知道这一点，但真正看到这一景象带来了别样的情感冲击。”　　詹姆斯韦布太空望远镜(James Webb Space Telescope)的6.5米主镜片(图中展示了18片镜片中的6片)可以探测数十亿光年外的物体。资料来源：NASA/MSFC/David Higginbotham　　JWST的设计是为了接替哈勃太空望远镜的工作。哈勃望远镜可以看到令人惊叹的宇宙景象，但也有盲点：它基本上无法看见在红外范围内具有光信号的古老恒星和星系。要弥补这一点，需要一台高灵敏度的仪器，其灵敏度要能够探测到数十亿光年外发出的极为微弱的红外信号。　　JWST的最终设计包括18个完全光滑的铍质镜片阵列，当其完全展开时，直径为6.5米。Mountain说，这些反射镜的设计非常精密，“要是把一块镜面等比放大到美国那么大，上面的隆起也不超过几英寸(高)。”这些反射镜配有最先进的近红外和中红外探测器。　　这一设计使JWST能够填补哈勃望远镜的空白，包括捕获来自一个有135亿年历史的星系发出的信号，该星系产生了宇宙中最早的一些氧和氖原子。JWST也带来了一些惊喜，例如，它能够测量某些类型的系外行星的大气组成。　　世界各地的研究人员都在排队等待观察时间。英国卡迪夫大学的天体物理学家Mikako Matsuura正在用JWST进行两项研究，调查宇宙尘埃的产生和破坏，这些尘埃可能会导致恒星和行星的形成。Matsuura说，与她所在小组过去使用的望远镜相比，“JWST拥有完全不同的灵敏度和清晰度等级”。她说：“我们看到了这些天体内部正在发生的完全不同的现象——这真令人叹为观止。”　　体积电子显微镜　　电子显微镜(Electron microscopy，EM)以其卓越的分辨率而闻名，但观察的主要是样本的表面。深入研究样本的内部需要将样本切成非常薄的切片，这对于生物学家来说往往不够。伦敦弗朗西斯克里克研究所(Francis Crick Institute)的电子显微镜学家Lucy Collinson解释说，仅覆盖单个细胞的体积就需要200个切片。她说：“如果你只有一个[切片]，你就是在玩统计把戏。”　　现在，研究人员正在将EM的分辨率应用于包含多个立方毫米体积的3D组织样本上。　　此前，从2D的EM图像重建这样体积的样本(例如，绘制大脑的神经连接图)需要经历艰苦的样本准备、成像和计算过程，才能将这些图像转换为多图像堆叠。现在，最新的“体积电子显微镜”技术大大简化了这一过程。　　这些技术有各种优点和局限性。连续切面成像(Serial block-face imaging)是一种相对快速的方法，它使用金刚石刀片在树脂包埋样品上切下一系列薄片，并进行成像，可以处理约1立方毫米大小的样品。然而，它的深度分辨率较差，这意味着生成的体积重建将相对模糊。聚焦离子束扫描电子显微镜(Focused ion beam scanning electron microscopy，FIB-SEM)能制备更薄的薄片样品，因此深度分辨率更高，但更适用于体积较小的样品。　　Collinson将体积电子显微镜的兴起描述为一场“安静的革命”，因为研究人员专注于用这种方法得到的结果，而不是生成这些结果的技术。但这正在改变。例如，2021年，弗吉尼亚州珍利亚研究园区(Janelia Research Campus)从事电子显微镜中细胞器分割(Cell Organelle Segmentation in Electron Microscopy，COSEM)计划的研究人员在《自然》上发表了两篇论文，聚焦了在绘制细胞内部结构方面取得的重大进展[4,5]。“这是一个绝佳的原理论证。”Collinson说。　　COSEM研究计划使用精密的定制FIB-SEM显微镜，在保持良好空间分辨率的同时，可将单个实验中可成像的体积增加约200倍。将这些仪器与深度学习算法结合使用，该团队能够在各种细胞类型的完整3D体积中定义各种细胞器和其他亚细胞结构。　　这种样品制备方法费力且难以掌握，并且由此产生的数据集非常庞大。但这一努力是值得的：Collinson已经看到了该技术在传染病研究和癌症生物学方面产生的见解。她现在正在与同事们合作，探索以高分辨率重建整个小鼠大脑的可行性。她预计这项工作将需要十多年的时间，花费数十亿美元，并产生5亿GB左右的数据。她说：“这可能与绘制第一个人类基因组工作的数据量在一个数量级。”　　CRISPR无限可能　　基因组编辑工具CRISPR–Cas9作为在整个基因组的目标位点引入特定变化的首选方法，在基因治疗、疾病建模和其他研究领域取得了突破，无可非议地享有盛誉。但它的用途多受限制。现在，研究人员正在寻找规避这些限制的方法。　　CRISPR编辑由短链向导RNA(short guide RNA，sgRNA)协调，sgRNA将相关的Cas核酸酶导向其目标基因组序列。但这种酶发挥作用还需要在靶点附近有一种叫做原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)的序列 如果没有PAM，基因编辑很可能会失败。　　在波士顿的马萨诸塞州总医院，基因组工程师Benjamin Kleinstover利用蛋白质工程技术，从化脓性链球菌中制造出常用Cas9酶的“近乎不受PAM序列限制的(near-PAMless)”Cas变体。一个Cas变体需要由三个连续核苷酸碱基组成的PAM，其中腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)核苷酸位于中间位置[6]。“这些酶现在几乎可以读取整个基因组，而传统的CRISPR酶只读取1%到10%的基因组。”Kleinstover说。　　这种对PAM序列不太严格的要求，增加了编辑“脱靶”的机会，但进一步的蛋白质工程设计可以提高其特异性。作为一种替代方法，Kleinstiver的团队正在设计和测试大量Cas9变体，每个变体对不同的PAM序列表现出高度的特异性。　　还有许多天然存在的Cas变体有待发现。自然条件下，CRISPR–Cas9系统是一种针对病毒感染的细菌防御机制，不同的微生物进化出了具有不同PAM序列偏好的各种酶。意大利特伦托大学的病毒学家Anna Cereseto和微生物组研究人员Nicola Segata梳理了100多万个微生物基因组，鉴定和表征了一组多样的Cas9变体，他们估计这些变体可能总共可以针对98%以上的已知人类致病突变[7]。　　然而，其中只有少数能在哺乳动物细胞中发挥作用。Cereseto说：“我们的想法是测试许多种酶，看看是什么决定因素使这些酶正常工作。”从这些天然酶库和高通量蛋白质工程工作中获得的见解来看，Kleinstiver说，“我认为我们最终会有一个相当完整的编辑工具箱，能让我们编辑任何我们想要的碱基。”　　高精度放射性碳测年　　去年，考古学家利用放射性碳测年技术的进步，对维京探险家首次抵达美洲的确切年份——甚至是季节——进行了研究。荷兰格罗宁根大学的同位素分析专家Michael Dee和他的博士后Margot Kuitems带领的一个团队在加拿大纽芬兰岛北岸的一个聚落中发现了一些被砍伐的木材，通过对这些木材的研究，确定这棵树很可能在1021年被砍伐，而且可能是在春天[8]。　　自20世纪40年代以来，科学家一直在利用有机人工制品的放射性碳测年法来缩小历史事件发生的时间范围。他们通过测量同位素碳-14的痕迹来做到这一点，碳-14是宇宙射线与地球大气相互作用的结果，在数千年中缓慢衰变。但这种技术的精确度通常仅为几十年左右。　　加拿大纽芬兰省兰塞奥兹牧草地(L'Anse aux Meadows)木材的精确放射性碳年代测定显示，维京人于1021年在此地砍倒了一棵树。图片来源：All Canada Photos/Alamy　　2012年，情况发生了变化，日本名古屋大学物理学家三宅芙沙(Fusa Miyake)领导的研究小组发现[9]，公元774到775年之间，日本雪松年轮中碳-14含量显著升高。随后的研究[10]不仅证实了这一时期世界各地的木材样本中都存在这种碳-14含量的显著升高，而且还发现历史上存在至少五次这样的碳-14含量上升，最早的一次可以追溯到公元前7176年。有研究人员将这些碳-14峰值与太阳风暴活动联系起来，但这一假设仍在探索中。　　无论其原因是什么，这些“三宅事件”的存在，能让研究人员通过检测一个特定的三宅事件，然后对此后形成的年轮进行计数，从而准确地确定木制文物的制造年份。Kuitems说，研究人员甚至可以根据最外圈年轮的厚度来确定树木被砍伐的季节。　　考古学家现在正在将这种方法应用于新石器时代聚落和火山爆发遗址的研究，Dee希望用它来研究中美洲的玛雅帝国。在接下来的十年左右，Dee乐观地认为，“我们将对这些古老文明中的许多历史事件有真正精确到年代的完全记录，我们将能够以相当精细的时间尺度谈论这些历史发展。”　　至于三宅，则还在继续寻找历史中的时间标尺。她说：“我们现在正在寻找过去一万年中与公元774到775年的事件相当的其他碳-14升高。”　　单细胞代谢组学　　代谢组学是研究驱动细胞的脂质、碳水化合物和其他小分子的科学，它最初是一套表征细胞或组织中代谢产物的方法，但现在正在转向单细胞水平。科学家们可以利用这些细胞水平的数据，理清大量看似相同的细胞的功能复杂性。但这一转变带来了艰巨的挑战。　　代谢组包含大量具有不同化学性质的分子。欧洲分子生物学实验室的代谢组学研究人员Theodore Alexandrov说，其中一些分子存在的时间非常短暂，代谢周转率为亚秒级别。它们可能很难检测：尽管单细胞RNA测序可以捕获细胞或生物体中产生的近一半的RNA分子(转录组)，但大多数代谢分析仅涵盖细胞代谢产物的一小部分。这些缺失的信息里可能包含了重要的生物学奥秘。　　“代谢组实际上是细胞的活性部分。”伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的分析化学家Jonathan Sweedler说，“在疾病状态下，如果你想知道细胞状态，你真的要研究代谢产物。”　　许多代谢组学实验室使用分离的细胞，这些细胞被捕获在毛细管中，使用质谱法单独分析。相比之下，“成像质谱”方法获取了样本中不同位置的细胞代谢产物发生变化的空间信息。例如，研究人员可以使用一种称为基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的技术，其中激光束扫过经特殊处理的组织切片，释放出代谢产物，用于随后的质谱分析。这种方法也能捕获样本中代谢物来源的空间坐标。　　Sweedler说，理论上，这两种方法都可以量化数千个细胞中的数百种化合物，但要实现这一目标通常需要顶级的定制硬件设备，成本在百万美元左右。　　现在，研究人员正在普及这项技术。2021年，Alexandrov团队报道了SpaceM，这是一种开源软件工具，它能用光学显微镜成像数据，使用标准商用质谱仪对培养的细胞进行空间代谢组学分析[11]。他说：“我们算是做了数据分析部分的体力活。”　　Alexandrov的团队使用SpaceM对数以万计人和小鼠细胞中的数百种代谢产物进行了分析，并转向标准的单细胞转录组学方法将这些细胞分类。Alexandrov表示，他尤为热情的是后一项工作，以及构建“代谢组学图谱”的想法——类似于为转录组学开发的图谱，以加速该领域的进展。他说：“这绝对是一个前沿领域，并将对科学起到巨大的推动作用。”　　体外胚胎模型　　研究人员现在可以在实验室中制造出人工合成胚胎(下图)，它与8天大的自然胚胎(上图)类似。来源：Magdalena Zernicka Goetz实验室　　科学家们已经在小鼠和人类的细胞水平上详细描绘了从受精卵到完全形成的胚胎这一过程。但驱动这一过程早期阶段的分子机制仍不清楚。现在，“胚状体”模型的一系列活动有助于填补这些知识空白，让研究人员更清楚地了解可以决定胎儿发育成败的重要早期事件。　　该领域一些最精细的模型，来自加州理工学院和英国剑桥大学的发育生物学家Magdalena Zernicka Goetz的实验室。2022年，她和她的团队证明，他们可以完全从胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)中产生植入期的小鼠胚胎[12,13]。　　与所有多能干细胞一样，ES细胞可以形成任何细胞或组织类型，但它们需要与两种类型的胚外细胞密切相互作用才能完成正常的胚胎发育。Zernicka-Goetz团队研究出了诱导ES细胞形成这些胚外细胞的方法，并表明这些细胞可以与ES细胞共培养，以产生胚胎模型，该模型的成熟度是以前的体外实验无法达到的。“它就如你能想象的胚胎模型那样。”Zernicka Goetz说，“我们的胚胎模型发育出一个头部和心脏——而且还在跳动。”她的团队能够利用这个模型来揭示个别基因的改变如何破坏正常的胚胎发育。　　经过工程设计用于模拟胚胎8细胞期的细胞构成的胚状体。来源：M.A Mazid et al./Nature　　在中国科学院广州生物医药与健康研究院，干细胞生物学家Miguel Esteban和同事们正在采取一种不同的策略：重新编程人类干细胞，以模拟最早的发育阶段。　　Esteban说：“我们最初的想法是，实际上甚至制造合子也是可能的。”该团队没能完全实现这一点，但他们的确发现了一种培养策略，能使这些干细胞回到类似于8细胞期人类胚胎的状态[14]。这是一个至关重要的发育期里程碑，与基因表达的巨大变化相关，最终产生不同的胚胎细胞和胚外细胞谱系。　　尽管还不完美，但Esteban的模型展示了自然状态下8细胞期胚胎中细胞的关键特征，并凸显了人类和小鼠胚胎如何启动向8细胞期阶段转变之间的重要差异。Esteban说：“我们发现，一种甚至在小鼠体内都没有表达的转录因子，调节着整个转化过程。”　　结合起来，这些模型可以帮助研究人员描绘出仅仅几个细胞是如何发育为高度复杂的脊椎动物躯体的。　　在许多国家，对人类胚胎的研究只能在发育14天以内进行，但在这些限制条件下，研究人员仍有许多工作可做。Esteban说，非人类灵长类动物模型提供了一种可能的替代方案，而Zernicka-Goetz说，她的小鼠胚胎策略也可以产生发育到第12天的人类胚胎。她说：“在这个我们能研究的胚胎阶段，仍有很多问题有待提出。”　　参考文献：　　1. Swaminathan, J. et al. Nature Biotechnol.36, 1076–1082 (2018).　　2. Reed, B. D. et al. Science 378, 186–192 (2022).　　3. Brinkerhoff, H., Kang, A. S. W., Liu, J., Aksimentiev, A. & Dekker, C. Science 374, 1509–1513 (2021).　　4. Heinrich, L. et al. Nature 599, 141–146 (2021).　　5. Xu, C. S. et al. Nature 599, 147–151 (2021).　　6. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N. & Kleinstiver, B. P. etal. Science 368, 290–296 (2020).　　7. Ciciani, M. et al. Nature Commun. 13, 6474 (2022).　　8. Kuitems, M. et al. Nature 601, 388–391 (2022).　　9. Miyake, F., Nagaya, K., Masuda, K. & Nakamura, T. Nature 486, 240–242 (2012).　　10. Brehm, N. et al. Nature Commun. 13, 1196 (2022).　　11. Rappez, L. et al. Nature Methods 18, 799–805 (2021).　　12. Amadei, G. et al. Nature 610, 143–153 (2022).　　13. Lau, K. Y. C. et al. Cell Stem Cell 29, 1445–1458 (2022).　　14. Mazid, M. A. et al. Nature 605, 315–324 (2022).　　原文以Seven technologies to watch in 2023为标题发表在2023年1月23日《自然》的技术特写版块上

蛋白质是细胞功能的执行者，是一切生命的物质基础。然而人们对蛋白质和蛋白质组的了解还远远不够，蛋白质分析被认为是一项复杂而艰巨的任务。2015年是蛋白质领域的关键一年，有可能决定着蛋白质分析的未来走向。 　　1.人类蛋白互作图谱取得更大的成果。最近Cell杂志上发表了一项大规模的蛋白质研究，科学家们鉴定了一万四千个蛋白相互作用，获得了迄今为止最大规模的人类蛋白互作图谱。他们计划将在未来六年中逐步完成人类基因组的全部互作图谱。这种图谱可以帮助人们更全面的了解人类互作组，进一步理解疾病的发生和发展。对新发现的蛋白互作进行研究，能够揭示基因型和表型之间的真实关系。我们期待在2015年看到这类研究结出更多硕果。 　　2.人造环境为蛋白质分析提供便利。今年八月Roy Bar-Ziv及其同事在Science杂志上发表文章，展示了以微流体DNA隔室为基础的人造细胞。这些二维的人造细胞可以实现预编程的蛋白合成、代谢和通讯，是一种非常灵活的蛋白合成系统。研究显示，人造细胞能够更好的模拟蛋白表达的动态模式，维持蛋白信号的梯度。人们可以利用这一系统来评估蛋白质的活性和相互作用，这种方法将对蛋白质功能研究产生重要的影响。 　　3. 一个时代的终结&mdash &mdash 蛋白质结构计划PSI收官。PSI项目在运行了十五年后，正逐步走向自己的终点。PSI项目已经确定了六千三百多个蛋白结构，为蛋白质分析做出了重要的贡献。那些为PSI而建的高通量蛋白生产中心可能会继续维持下去，给其他结构生物学实验室使用。结构生物学家们也可能启动与数据处理有关的中、大型项目，作为PSI的延续。 　　不管怎样，对于蛋白质领域来说明年都是特别的一年，研究者们需要决定PSI之后的前进方向。我们希望未来能有更多类似人类互作组图谱的大型项目，增进我们对蛋白质结构和功能的理解。

p 　　作为一名生长在齐鲁大地、深受儒家文化熏陶的青年学者，即便在海外求学多年，孙士生始终心系国家、情牵母校。伴随着时代的召唤，入选国家“千人计划”青年项目的孙士生毅然回到母校西北大学，希冀将他在美国掌握与研发的先进技术应用到西北这片广袤的大地上，以期为母校、为西北地区乃至为整个中国的科研水平真正实现与世界一流接轨尽一份力。 br/ /p p 　　“在我看来，在西部地区开展工作有一定的好处及空间，这里受到的外界诱惑和干扰应该会相对少一些，这份安静其实对于基础科学研究颇有助益。”对于未来，“我将继续在自己擅长的方向——糖蛋白质组学和生物标志物发现研究领域开展前沿研究”，为破译人类癌症的密码贡献力量。在接受《中国科学报》记者采访时，孙士生这样表示到。 /p p 　　和糖蛋白的缘分 /p p 　　2005年本科毕业后，孙士生进入西北大学攻读研究生，并在那里获得了硕士和博士学位。 /p p 　　“还在读大学的时候，我就对糖蛋白比较感兴趣。这个领域研究的人还比较少，但其实相当重要。当时教科书上关于糖蛋白的介绍还非常有限，从那时起我就开始注意搜集这方面的资料，没想到有一天还真的从事了这方面的研究。”孙士生回忆说。 /p p 　　糖蛋白是被聚糖共价修饰的一类蛋白质，糖蛋白上的寡糖链与肽链中的特定氨基酸残基侧链以糖苷键共价连接.糖蛋白普遍存在于动物、植物，真核微生物和各种病毒表面，种类繁多，功能广泛。其中N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高尔基体。其整个合成和分解过程受到各种酶类的特异催化和精确调控。其主要生物学功能为细胞或分子的生物识别，如人类ABO血型和精卵结合过程 另外，受体蛋白、肿瘤细胞表面抗原等亦均属糖蛋白。 /p p 　　近年来，科学界逐渐认识到，糖蛋白与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展有关。再者，细胞表面的糖蛋白及糖脂可“脱落”到周围环境或进入血循环，它们可以作为相关组织或细胞异常的标志为临床诊断提供信息 患某些疾病时体液中的糖蛋白亦常有特异性或强或弱的改变,这些糖蛋白的发现和应用将有助于疾病诊断或预后的判断。 /p p 　　读研伊始，孙士生从事的是生物芯片方面的研究，“后来因为参与一个糖芯片检测流感病毒宿主范围的项目，我有幸进入了糖蛋白的研究领域，或许这就是缘分吧”，孙士生说。 /p p 　　2011年，从西北大学毕业后，孙士生选择前往美国约翰· 霍普金斯大学Dr. Hui Zhang实验室做博士后，继续从事糖蛋白质组的方法学和生物标志物发现研究。 /p p 　　Dr. Zhang建立了经典分析糖蛋白方法，这在世界上属于蛋白质组学领域的权威。他所领导的实验室，有着很多国际前沿的技术和研究。有幸在这样的实验室工作，孙士生深觉受益匪浅。 /p p 　　“在国外，感触比较深的一点是，国外做科研，比较强调原创性。在美国，张老师会说，这个领域已经有人在做，而且做得不错，我们应该选择一些新的领域去探索。很多学者认为别人没做过的研究会更困难，其实不然，正是因为没人做过，发挥的空间才会更大”。 /p p 　　糖蛋白组学意义重大 /p p 　　在美多年，孙士生所做的诸多研究也产生了不小的国际影响力。 /p p 　　孙士生介绍说，随着蛋白质组学研究的日益成熟和规模化，蛋白翻译后修饰谱成为了新的研究焦点。蛋白糖基化修饰作为最重要、最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，主要参与细胞间识别、调控、信号传导、免疫应答、细胞转化和疾病的发生发展。而系统高通量的糖蛋白质组研究方法是蛋白糖基化分析的基础。在美期间，他在Dr. Zhang建立的经典分析糖蛋白方法基础上，通过改变分析策略，创建了一种全面系统分析N-糖蛋白质组的新方法。该方法可广泛应用于肿瘤标记物筛查，蛋白抗体、病毒以及其他各种生物样品中的蛋白糖基化分析。同时，孙士生还建立了一些其他基于质谱分析的糖蛋白质组学新方法。 /p p 　　在蛋白质组/糖蛋白质组学在疾病生物标记物和致病机理研究中的应用方面，孙士生也取得了一定的进展。他与合作者将蛋白质组/糖蛋白质组相关方法学成功应用于各种临床样本分析中。其应用范围包括：人流感病毒、艾滋病病毒(HIV)及其感染的细胞和宿主，不同年龄和性别的人唾液，肝癌细胞系和HCC病人血清，前列腺癌细胞系、组织和血清，卵巢癌细胞系和组织、肺癌细胞系模型和肾衰竭动物模型。 /p p 　　“其中值得一提的是，我在博士后期间作为样本制备主要负责人之一参与了美国临床蛋白质组肿瘤分析(CPTAC)项目。我所在的实验室是全美参与此项目的五个核心实验室之一。在此项目中,我一直负责实验室内样品分析方法的建立，标准流程的制定，样品制备，质量监控和问题解决。目前已顺利完成本轮所有临床样本的蛋白质组和糖蛋白质组图谱的解析,其中蛋白质组的研究成果已在Cell杂志发表”，孙士生说。 /p p 　　回国的“青年千人” /p p 　　梁园虽好，终非故土。在美国学习和工作多年后，孙士生最终选择回到西北大学，并在2017年顺利获得了中组部 “千人计划”青年项目的资助。 /p p 　　“我选择回西北大学，很大程度上是出于对母校的热爱。这儿有我老师、同学和朋友的帮助和支持。有着悠久历史的西北大学近年来综合实力也在蒸蒸日上”，孙士生指出，西北大学学术氛围相对自由，对青年学者没有设置太多限制，“选择西北大学，也有这方面的考量。” /p p 　　回到母校后，孙士生希望能将本人所学，特别是他在糖蛋白质组学及新的肿瘤标志物发现等领域所积累的研究经验及学术成果服务于祖国，同时将母校建设的更好。 /p p 　　展望未来，孙士生表示，他将继续致力于糖蛋白质组学新技术的开发并将其应用于新的生物标志物发现、致病机制研究和蛋白糖基化调控机制研究中。他已针对这些设想制定了详细的工作计划。 /p p 　　孙士生表示，蛋白质组研究技术在癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面具有诱人的应用前景。糖类作为重要的生物大分子之一，参与各种重要的生物学过程。然而系统糖生物学研究包括系统的糖链解析、高通量的糖蛋白和糖脂分析等才刚刚起步：“在中国从事这方面的研究，必然会大有可为。” /p p br/ /p

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

蛋白质的快速降解使得细胞在受内源或者外源刺激时可以对蛋白质丰度进行快速调节。短半衰期蛋白质在细胞内很多生物学过程起重要作用，比如细胞周期的每一步都受短半衰期蛋白质的严密调控。稳定同位素瞬时标记结合质谱是测量蛋白质半衰期的常用手段。但受技术本身的一些限制（长标记时间，样品复杂度，tRNA重置，以及内源氨基酸重利用等），稳定同位素结合质谱法对短半衰期蛋白质的覆盖度非常低，更适合于中长半衰期蛋白质的研究。短半衰期蛋白质仍然是人类蛋白质组中缺失的一部分。2021年10月8日，哈佛大学医学院Steven P. Gygi研究组（李嘉铭博士为第一作者，Brian L. Harry为共同通讯作者）在Molecular Cell上在线发表文章Proteome-wide mapping of short-lived proteins in human cells，对人类细胞中翻译抑制条件下的短半衰期蛋白质进行了大规模鉴定。作者使用了广谱蛋白质翻译抑制剂Cycloheximide结合16通道串联质谱标签的方法，利用FAIMS结合实时搜库策略在人源HEK293T, U2OS, RPE1以及HCT116细胞系中对蛋白质半衰期进行了测量。串联质谱标签结合FAIMS以及实时搜库策略可以兼具蛋白质覆盖度以及半衰期测量的精确度，最终作者在每个细胞系中定量到约9000个蛋白质，每个细胞系中约400-500个蛋白质被鉴定为短半衰期蛋白质（半衰期小于8小时），其中约100个蛋白质的半衰期小于2小时。最终在4个细胞系中一共鉴定到1017个短半衰期蛋白质。系统性分析发现，和其它蛋白质相比，短半衰期蛋白质丰度较低，热不稳定，在进化上更年轻，具有更低的mRNA和蛋白质相关性，存在于较小的蛋白质复合体中。后续差异分析发现103个短半衰期蛋白质在细胞系之间存在显著不同的稳定性。其中，ATRX蛋白质和GMDS蛋白质被证实分别在U2OS细胞和HCT116细胞中以truncation形式存在，并且和全长蛋白质相比，truncation形式的ATRX蛋白质和GMDS蛋白质具有非常低的稳定性。由于广谱蛋白质翻译抑制剂可能引起应激，使得某些测得的半衰期和实际半衰期存在差别，作者将本文的结果和以往稳定同位素结合质谱法的结果进行了比较。首先，和预期相符，稳定同位素法结合质谱法对短半衰期蛋白质的覆盖度非常低；其次，在有限的被两种方法共同定量到的蛋白质中，本文的半衰期结果和稳定同位素法表现出了非常高程度的一致性。这说明本文定量到的短半衰期蛋白质的半衰期非常接近实际条件下的半衰期。每一个短半衰期蛋白质背后都代表着一个蛋白质快速降解的机制，本文提供了一个人类细胞中快速降解蛋白质的详细图谱，后续对降解机制的详细研究会为蛋白质降解作为治疗手段提供思路。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.09.015

因在病原菌和宿主相互作用分子机制研究方面取得一系列原创性成果，北京生命科学研究所高级研究员、中国生物化学与分子生物学会蛋白质专业委员会委员邵峰博士日前获得了蛋白质学会颁发的青年科学家奖。 北京生命科学研究所高级研究员 中国生物化学与分子生物学会蛋白质专业委员会委员邵峰博士 　　邵峰通过研究致病细菌如何通过调节宿主细胞的多层信号通路而逃避其免疫反应的机理，获得了几个关键的科学发现。比如，发现了导致Rho GTP酶从宿主细胞膜上脱离的一个半胱氨酸蛋白水解酶家族，以及几个影响泛素信号转导的细菌因子等。基于这些重要科学发现，蛋白质学会决定将2013年的青年科学家奖授予邵峰。 　　蛋白质学会于1985年成立，致力于推动国际蛋白质科学的研究和发展，是生命科学研究领域的权威国际学术组织之一。国际蛋白质学会在1989年开始设立青年科学家奖(此前名为The Irving Sigal Young Investigator Award)，每年颁奖给一位处于独立科研生涯早期已在蛋白质研究领域作出重要贡献的科学家。邵峰博士是首位获得此项殊荣的中国本土科学家，这反映了中国在蛋白质科学领域日趋上升的国际影响力。

2015年1月23日一期的Science公布了基于人类蛋白质图谱的大分析结果，包括与癌症相关的详细蛋白质图片，血液中蛋白质种类和数量，以及市场上被批准的所有药物所作用的目标蛋白质。 人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas）,是由Knut and Alice Wallenberg基金会于2014年11月支持的一个大型跨国研究项目。近期他们又开放了一个以人器官组织为基础的蛋白质图谱数据库。基于1300万个注释的图像，整个数据库涵盖了人体中的所有主要组织和器官的蛋白质分布，也标注了仅表达在特定组织，如脑，心脏或肝脏的蛋白。作为一个开放的数据资源，这个数据库提高了对人类生物学的基本见解，更有望帮助推动新的诊断和药物的开发。 在Science的这篇文章里，"基于组织的人类蛋白质组图谱" 结合基因组学，转录组学，蛋白质组学，以及基于抗体的分析，详细分析了大约20,000个蛋白质编码基因。分析结果表明，蛋白编码基因几乎一半都是普遍表达在所有分析的组织。而有大概的15％的蛋白质编码基因大量表达在一个或几个特定的组织或器官，包括众所周知的组织特异性蛋白质，如胰岛素和肌钙蛋白。睾丸是含有最丰富种类蛋白质的器官，其后是大脑和肝脏。分析结果还表明，大约3000种蛋白质是从细胞中分泌释放的，另有5500种蛋白位于细胞膜结构。 这一蛋白质图分析结果为制药行业的提供了重要信息。研究小组的Uhlé n表示,他们发现了市场上使用的药品有70%的作用目标是分泌或膜结合蛋白。有趣的是，另外30%被发现是作用其他组织和器官，这可能有助于解释药物的一些副作用，并且对未来药物开发提供一定的参考价值。 该数据库已经免费对外开放，网址是www.proteinatlas.org.

内容简介放射性示踪技术在生命科学的发展中起着重要作用。虽然发展了许多替代技术，但是在许多特定的条件下，放射性示踪仍然是首选的高效、专一、可靠的实验方法。液闪计数分析，作为b射线检测的一种实验技术，在蛋白质的功能研究中起着重要的作用，尤其是上世纪70年代末为医药工业的高通量筛选建立的、近年来在基础研究的多个领域崭露头角的临近闪烁分析方法，对蛋白质功能研究提供了一些新思路，使得蛋白质功能的研究从分子到细胞成为可能。本期Webinar邀请到的主讲人张洪杰博士为中国科学院生物物理研究所科学平台的同位素实验技术主管。其负责的放射性同位素实验室面向所内、所外提供技术支撑服务。目前实验室有3H、14C、32P、33P、35S、51Cr、125I等7种核素，经过近几年的改造、建设，同位素示踪实验平台已经基本形成了放射实验场所（辐射）清洁、放射操作安全防护配套、放射试剂许可剂量充足、放射废弃物处理规范、放射样品的制样设备和检测仪器齐全的开放共享的实验场所。目前该平台已助力两个实验室在Cell，多个实验室在nature子刊等影响因子大于10的学术期刊上发表研究成果。本期讲座主要以在中科院生物物理所同位素实验室完成的实验结果为基础，结合一些其它实验室发表的文献数据，对酶、转运蛋白的活性分析，配体和受体的结合分析以及蛋白质的体内代谢分析，介绍相关测试过程中的样品制备、测试信号选择中的一些注意事项，帮助大家理解液闪分析中的一些关键步骤，提高实验的成功率。 讲座题目：液体闪烁技术在蛋白质功能研究中的应用:从分子到细胞讲座时间：2019年6月27日14：00-15:00主讲人：张洪杰 博士（中科院生物物理研究所）讲座形式：网络讲座，手机或PC即可参与（会议链接和如下报名链接相同） 主讲人简介张洪杰博士，放射性同位素实验技术主管， 高级工程师，复旦大学化学系理学学士，中科院生物物理研究所分子生物学博士，在生物物理学和分子生物学领域从事过多年的研究工作，2012年开始负责放射性同位素的运行管理和实验技术指导，有着较为丰富的经验。近几年已经有20余篇和同位素技术支撑相关的被致谢的文章。 关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

人体细胞表达的蛋白质种类超过几万种，而不同的蛋白质在细胞的定位也不一样。蛋白质亚细胞定位还会涉及到细胞功能异常和疾病。而空间蛋白质组学正是研究蛋白质在亚细胞上的定位、表达及其在亚细胞水平上的动力学，属于蛋白质组学的研究范畴。目前研究空间蛋白质组学分析的方法主要有两种：基于细胞器分离的质谱法和基于成像的蛋白质定位方法。 近期上海同济大学的朱小立研究团队在国际期刊Science Advances 发表题为“Computer-aided design of reversible hybridization chain reaction(CAD-HCR) enables multiplexed single-cell spatial proteomics imaging”的研究文章，该研究报告了一种高灵敏度和多重成像的空间蛋白质组学技术。　　杂交链式反应（HCR）是一种公认的稳健的扩增系统，并已应用于各种生物标志物分子的扩增检测。本研究开发一种可逆HCR，将HCR与DNA交换技术相结合，并利用计算机辅助设计（CAD）技术，通过与免疫识别相结合，可逆的CAD-HCR有望用于空间蛋白质组学分析。 研究人员通过多种实验对CAD-HCR的应用进行验证。使用荧光染料修饰HCR的发夹结构以验证扩增效果，结果显示扩增效果比未扩增的情况下增强约65倍，并且与常规免疫荧光相近，有利于后续成像。目的蛋白表达改变时，可逆HCR的蛋白丰度与荧光强度呈正相关，表明可逆CHR可用于目标蛋白的半定量分析。　　文章还对可逆HCR循环成像能力进行研究。在10个循环内，成像结果几乎相同，说明在不影响细胞形态的情况下实现染色和脱色循环。循环期间信号稳定输出，证明一抗的抗原性和引发剂的杂交能力也未受影响。可逆HCR解决了传统免疫荧光技术无法实现的荧光光谱重叠的问题，提供样品重复使用性，具有重要价值。　　最后研究人员使用可逆HCR对分布在单个细胞内不同亚细胞位置的9种蛋白质进行多重成像分析。结果显示9种蛋白质的分布与其理论亚细胞定位一致，并且能够很好的共定位，说明可逆HCR在亚细胞上的空间定位具有高精度，可用于单细胞蛋白质组学成像。 总之，结合CAD技术，研究团队开发了一种可循环和可逆的HCR技术，这种创新的HCR系统成功地应用于单细胞水平的空间蛋白质组学的敏感成像分析，目标蛋白的半定量和亚细胞定位可通过常规的激光共聚焦显微镜实现，可广泛用于大多数实验室，在临床诊断和生物医学研究中具有更大的应用潜力。

基于单细胞层面的研究为生物系统中细胞间的同质性和异质性提供了更精准的信息，随着蛋白质组学技术的快速发展，检测技术和灵敏度的提升，使实现单个体细胞的蛋白质组学分析成为可能。 为推动单细胞蛋白质组学的发展，拓展单细胞研究的视野，布鲁克和景杰生物将于2021CNHUPO会议期间联合举办“单细胞蛋白质组学专题卫星会”，线上线下同步进行，诚邀您与会。会议时间：2021年10月14日12:30-13:35 现场参会地点：武汉 东湖宾馆 1楼 晴川厅 网络同步直播：请加微信报名 13370119923特 邀 嘉 宾会 议 日 程12:30 - 12:35 欢迎致辞及公司介绍 何磊 布鲁克道尔顿中国区经理12:35 - 12:50 timsTOF SCP 带您突破单细胞蛋白质组学研究极限 刘先明 布鲁克道尔顿中国区蛋白质组学及生物制药应用经理12:50 - 13:20 单细胞高维度蛋白检测技术及临床应用 丁显廷 教授 上海交通大学生物医学工程学院13:20 - 13:35 真于心，单于一，基于质谱的单细胞蛋白质组学 顾宏博 博士 杭州景杰生物科技股份有限公司线下注册参会：请加微信报名 13370119923* 本次卫星会将为现场参会人员提供午餐和礼品！抽奖活动在线上和线下同步进行！ 会议咨询：13370119923 期待您的参与！

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 近期，来自法兰克福大学医学病毒学研究所和歌德大学医学院团队利用一种新颖的蛋白质组学方法对新冠病毒进行研究，加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标，提出新冠治疗新疗法。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 治疗选择· 细胞层面理解 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 从2019年底由SARS-CoV-2（2型严重急性呼吸综合征冠状病毒）引起的新型冠状病毒疾病（COVID-19）具有高传染性，该病已发展至全球大流行。全球迫切需要开发抑制病毒感染或复制的疗法。SARS-CoV-2与其他冠状病毒有相似之处，所以目前主要通过对已用于其他适应症的药物库进行高通量筛选，鉴定出许多临床上认可的药物，但却缺乏对SARS-CoV-2感染的治疗选择和细胞层面理解。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 法兰克福大学医学病毒学研究所的Jindrich Cinatl教授和歌德大学医学院的Christian Mü nch教授团队发表最新研究中，建立感染SARS-CoV-2的Caco-212细胞模型，运用一种新颖的多重增强蛋白质动力学(multiplexed enhanced protein dynamicsme, mePROD)方法进行蛋白质组学分析，能够在高时间分辨率下确定转录组和蛋白质组的变化，加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 一、构建细胞感染模型 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 想要开展该研究的重点取决于两点： span style=" text-indent: 2em " 1.是否有合适的允许病毒感染的细胞培养模型； /span span style=" text-indent: 2em " 2.对蛋白质进行时间感染特征分析的敏感蛋白质组学方法。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该研究建立针对SARS-CoV-2高度兼容的细胞模型，在病毒感染24小时后就能迅速见到细胞致病作用 (图1A)。在病毒感染细胞后的2h、6h、10h和24h，分别用定量PCR技术测量上清液中的病毒RNA拷贝数，发现感染后SARS-CoV-2 RNA数量不断增加（图1B）。这表明模型可以用于研究细胞中SARS-CoV-2。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/00b7210b-e85a-4327-aa02-dc0af774d72a.jpg" title=" theromo.jpg" alt=" theromo.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图1. & nbsp SARS-CoV-2 在细胞内快速复制模型。A, 病毒感染24小时后的细胞形态变化 & nbsp B, 细胞上清液中病毒RNA拷贝数的增加 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 二、翻译抑制剂防止SARS-CoV-2病毒复制 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 建立好模型，研究人员需要利用一种高效的方法确定SARS-CoV-2感染的时间分布，这时候mePROD蛋白质组学方法应运而生，即基于Orbitrap高分辨质谱仪联用新蛋白代谢标记（SILAC）和串联质量标签（TMT）两种标记方法，进行蛋白差异分析。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/1f28c8de-733d-43ac-8f8a-d1f2138c637a.jpg" title=" e.jpg" alt=" e.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图2. mePROD蛋白质组学实验流程 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 抑制宿主翻译先前已被用作治疗MERS-CoV等多种冠状病毒感染性疾病。与其他病毒抑制宿主蛋白的合成从而增加病毒蛋白的合成不同，该方法挖掘数据表明SARS-CoV–2仅引起宿主翻译能力的微小变化，作者推测SARS-CoV-2复制可能对翻译抑制更为敏感。通过测试了两种翻译抑制剂，即环己酰亚胺（cycloheximide, 翻译延伸抑制剂）和曲美汀（emetine, 抑制40S核糖体蛋白S14）。在无毒浓度下，两个化合物均对SARS-CoV-2复制产生了显着抑制作用从而发现翻译抑制剂是细胞中SARS-CoV-2复制的有效抑制剂。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/f6db163f-b3fd-4747-bd76-a206ba4a658d.jpg" title=" 他.jpg" alt=" 他.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图3. 环己酰亚胺和曲美汀对病毒复制的抑制作用 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 三、发现潜在的抗病毒靶标 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 重点来了，通过前期蛋白质组学大数据挖掘，目前一张蓝图已展现在眼前，下一步的重中之重就是探究与病毒蛋白共同增加的宿主蛋白，从而寻求潜在的SARS-CoV-2复制抑制剂。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 作者分析了与病毒蛋白变化趋势相似的蛋白，在数据中富集的代谢途径主要由不同的核酸代谢子途径组成。基于此，研究者测试核苷酸合成抑制剂对细胞中SARS-CoV-2复制的影响，高达10 µ M的布雷奎纳（brequinar，抑制双氢乳清酸脱氢酶并不具有抗病毒的作用。相比之下，低浓度下的利巴韦林（ribavirine，抑制肌苷一磷酸脱氢酶）即可抑制SARS-CoV-2复制（图4C），这表明利巴韦林是可以进行进一步检测的候选药物。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 此外，与蛋白质折叠相关的蛋白变化与病毒蛋白质较为一致，p97是AAA家族的六聚体ATPase酶，也是真核生物最丰富的蛋白之一，通过调节蛋白的稳定性来执行一系列生物学功能，参与膜融合、蛋白降解等过程。测试p97的小分子抑制剂NMS–873对SARS-CoV-2复制的影响。研究表明，NMS–873在低纳摩尔浓度下即可完全抑制SARS-CoV–2（图4D）。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/7559257b-c48c-4e0d-97e1-dbe56f69f256.jpg" title=" t4.jpg" alt=" t4.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图4. 核酸代谢相关的蛋白水平与病毒基因表达相关。A, 病毒蛋白随感染时间的变化；B, 宿主蛋白与病毒蛋白关联的GO分析；C, D, Ribavirin和NMS–873的抗病毒实验 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 结论 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 全球对于病毒高效治疗方案的需求非常紧迫，深入了解病毒机理及致病性相关的生物途径变得非常关键。 span style=" text-indent: 2em " 定量蛋白质组学是病毒机理研究的主要手段之一，能够提供超高分辨率和灵敏度，可为病毒蛋白质组学研究者所面临的挑战“样本基质复杂、蛋白质鉴定数量不足、假阴性/假阳性结果”提供强大的技术保障。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 参考文献： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " SARS-CoV-2 infected host cell proteomics reveal potential therapy targets, DOI:10.21203/rs.3.rs-17218/v1 /p p br/ /p

原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国关注我们，更多干货和惊喜好礼齐英姿Literature sharing本次我们分享两篇文章，分别于2022年09月和2022年10月发表于bioRxiv [1-2]，文章内容为在单细胞蛋白质组学领域，使用基于PD3.0_CHIMERYS检索及质谱宽隔离窗口采集的方法，搭配全新的μPAC 色谱柱的赛默飞综合解决方案，提升单细胞蛋白质鉴定的性能。接下来我们分别进行具体的介绍。基于DDA采集模式与单细胞组学的低离子数目的特点，采用更大的隔离窗口，增加共隔离的离子数目，这是一种被认为是类似于结合了传统的DDA与DIA的采集方法，文献中将这个方法称之为宽隔离窗口采集（wide window acquisition ,WWA)策略(如图1所示)。图1：wide window acquisition (WWA)宽隔离窗口采集策略（点击查看大图）PD软件3.0版本自2022年年中发布以来，其对DDA蛋白质组学数据的性能提升有目共睹；如需CHIMERYS的介绍，可具体参考以下链接《好风凭借力：CHIMERYS实现蛋白质组学数据的性能飞跃》——赛默飞orbitrap组学俱乐部公众号点击图片可查看基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，可在一张二级谱图中解析出多个PSMs，擅长于解析WWA采集得到的更加复杂的二级谱图。作为 LC-MS/MS的重要组成部分的低流速液相色谱，对减少样品的复杂度、增加蛋白质组学的鉴定方面的贡献尤为重要，通常我们可以通过拉长色谱梯度等方法来实现更好的分离，而这也会引入包括峰展宽在内的灵敏度的降低及检测通量的降低等问题。而新发布的微柱蚀刻技术的μPAC系列色谱柱，具有高度有序的排列，有助于更加优异的峰宽表现且减小柱残留，低背压的设计也使其可以使用更大的流速，可以更快的上样、清洗及平衡色谱柱，从而增加检测通量(赛默飞提供的综合解决方案如图2所示)。图2：结合了低流速液相色谱、质谱及分析软件的完整综合解决方案（点击查看大图）► ► ► 不同的色谱柱性能比较在色谱柱的比较中，与传统的填充柱相比，作者对比了110cm的第二代μPAC色谱柱与其他两款填充型色谱柱(50cm及25cm)，如图3所示，上样量为12.5ng Hela肽段，30min有效梯度，采用1Th的采集窗口，第二代μPAC色谱柱可以得到蛋白水平66%和肽段水平140%的提升。而比较不同的μPAC色谱柱（5.5cm原型柱、50cm Neo柱和110cm二代柱），使用复杂样品(HeLa, yeast, 和 E. coli按照8:1:1混样)，10ng-400ng的上样区间，蛋白鉴定结果如图3所示。50cm的Neo色谱柱，在30min及60min梯度上具有优异的表现，特别是在低上样量的条件下。我们需要的样品的通量(梯度时间)及样品的复杂度则决定了WWA方法对单细胞样品的适用性，样品通量是单细胞蛋白组学领域的重要关注点，使用5.5cm色谱柱搭配高流速，可实现到~100spd的水平。图3：不同的色谱柱性能比较（点击查看大图）► ► ► 隔离窗口的优化在WWA方法中，若使用了＞4m/z的较宽的母离子隔离窗口，使得临近的母离子被共同碎裂，这时二级谱图会形成类似于DIA采集方法的混合谱，这种方法不仅能增加鉴定数，还能提高鉴定时对低丰度肽段的灵敏度；对不同大小的隔离窗口进行优化，在250pg到400ng的上样区间中，可以看到，更宽的隔离窗口更适合较小上样量的结果，如250pg和1ng的上样量下，隔离窗口12m/z和8m/z为最适效果。搭配于CHIMERYS的检索方法，更大的隔离窗口所提供的谱图复杂度，使得对低丰度肽段有更好的挖掘，拓宽了鉴定的丰度的动态范围。图4：不同上样量条件下隔离窗口的优化（点击查看大图）在质谱方法中，单细胞的样品由于离子数更少，往往需要更高的最大离子注入时间，比如几百个毫秒，这会导致二级谱图数的降低，从而显著的影响鉴定量。此时我们也可以配合使用更高的分辨率，可以识别更加复杂的离子，也就是说，我们可以使用更大的隔离窗口来提供更多的离子进行累积，并且通过高分辨率来识别这些离子，而后我们可以通过PD3.0 CHIMERYS引擎来对这些复杂的混合谱图进行检索。使用经典的窄隔离窗口采集方法，与传统的MS Amanda 2.0 引擎相比，CHIMERYS引擎可提升鉴定量2.6倍；而再加成上宽隔离窗口的WWA采集方法后，则可达到4.6倍的提升水平。图5：CHIMERYS搜索引擎提升蛋白质组学鉴定深度（点击查看大图）另一篇文献中，作者使用0.2ng Hela肽段，对不同的隔离窗口、最大离子注入时间、分辨率等参数进行优化，发现在MS2分辨率为45k和60k时，我们能够得到最多的PSMs鉴定数。在隔离窗口为8或者12Th时，会得到最好的结果。0.2ng Hela的上样量，WWA模式可达到2,396个蛋白鉴定，比普通DDA模式鉴定量增加39%。图5：采用0.2ngHela肽段及40min对WWA模式质谱采集参数进行优化（点击查看大图）在短梯度模式下，峰容量降低，使其谱图的复杂度更高。基于CHIMERYS的破解高度复杂的混合谱的能力，使得更快的色谱分析成为可能。在使用12Th的隔离窗口与60k MS2分辨率的组合条件下，可得到最好的鉴定能力。使用此参数组合，更快的20min的鉴定量仅比40min少了10%（3160 vs 3524）。这说明，在并未显著影响蛋白质组学鉴定量的条件下，WWA的采集方法适用于更快速的梯度分离。由于WWA采集方法被认为是类似于结合了传统的DDA与DIA的方式，故文章对不同的采集模式进行了比较；在单细胞水平的比较中（10个Hela细胞及7-10个K562细胞），使用相同的118ms和60K分辨率的二级参数，定性深度的比较中，WWA采集方法可得到最多的鉴定。图6：不同的采集模式（DIA, DDA 及 WWA）比较（点击查看大图）► ► ► 结语WWA采集方案的提出，为我们进行快速的、更高深度的单细胞蛋白质组学提供了新的思路：基于赛默飞综合解决方案，我们从全新的Vanquish neo低流速液相色谱、μPAC色谱柱、宽隔离窗口的质谱采集策略以及全新的基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，全方面提升单细胞蛋白质组学鉴定深度。如需合作转载本文，请文末留言。

近期，浙江大学化学系方群教授团队在国际权威期刊《Nature Communications》上发表了题为“Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell”的研究成果，创新性地提出了PiSPA（Pick-up Single-cell Proteomic Analysis）技术用于单细胞蛋白组分析。该工作流程利用纳升级微流控液滴操控机器人，可以实现单细胞精准捕获、样本前处理以及自动进样，利用布鲁克tims TOF Pro质谱仪在单个哺乳动物细胞内实现了超过3000种蛋白的定量深度。作者通过此项技术对三种不同的哺乳动物细胞（HeLa、A549和U2OS细胞）进行单细胞蛋白质组学研究，以及研究了HeLa细胞在迁移过程中的细胞异质性，均展现了超高的定量分析深度。PiSPA平台的单细胞捕获过程是基于SODA（Sequential Operation Droplet Array）技术开发的微流控液体处理系统，可在“点取式”操作模式下实现自动化纳升级单细胞分选，并且能够基于细胞的明场形态特征或是标记的荧光信号灵活地选择单细胞，具有很高的捕获成功率和指向性。此外，研究人员将商品化的锥形底部内插管改造成阵列化的纳升级微反应器，兼容后续的液相色谱自动进样，可大大提高整个工作流程的可操作性、可靠性和成功率。PiSPA平台可自动完成单细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测等一系列操作，最大程度降低样品的损失。研究人员利用PiSPA工作流程，对多种哺乳动物单细胞实现了深度覆盖的定量分析。采用优化的胰蛋白酶/蛋白比例和色谱梯度，分别通过DDA和DIA扫描模式对A549、HeLa和U2OS三种细胞进行单细胞蛋白组分析，所有质谱数据均使用布鲁克4D蛋白质组学平台——timsTOF Pro进行采集。布鲁克独特的捕集离子淌度技术（TIMS）带了额外一维离子淌度信息，可大大降低样品分析复杂度，极大提高峰容量和分析物鉴定可靠性，最新一代平行累积连续碎裂技术（PASEF® ）可以实现极高的二级扫描速度和灵敏度，只需要很少量样本就可以达到组学鉴定新深度。在本研究中，timsTOF Pro更是展示了探索单细胞蛋白质组学的能力，在DIA扫描模式下，利用DIA-NN（MBR算法）进行library-free数据检索，可在A549、HeLa和U2OS三种细胞的单细胞样本中，分别平均定量到3008、2926和2259种蛋白质，展现了PiSPA平台在单细胞蛋白组定量分析中的覆盖深度；此外，有2869、2772和1889种蛋白质在至少80%的A549、HeLa和U2OS单细胞样本中被重复定量到，说明了PiSPA平台有很高的重复性和可靠性。为了证明PiSPA平台的实际应用价值，研究人员分析了迁移过程中HeLa单细胞的蛋白质组表达情况。通过细胞划痕实验，选取有明显迁移（n=46）和未发生迁移（n=43）的HeLa单细胞进行定量分析。采用DIA扫描模式，分别平均鉴定到了2544和2893种蛋白质，后续生物信息学分析发现Cdc42、Rac1和RhoA等蛋白在发生迁移的HeLa细胞中发生显著上调，揭示了迁移过程中的焦点粘附和肌动蛋白骨架调节通路发生激活，说明了PiSPA可以作为细胞迁移研究和抗癌药物靶点研究的有效工具。PiSPA工作流程包含了高精度的液体操控、单细胞的精确前处理，结合布鲁克先进的液相色谱-捕集离子淌度谱-四极杆飞行时间质谱仪（LC-TIMS-QTOF MS）进行蛋白质组分析，突破了传统质谱分析在单细胞蛋白组研究领域的技术瓶颈，实现在单个哺乳动物细胞中定量超过3000种蛋白，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。这项成果也再次向我们证明了单细胞蛋白质组学在疾病诊断和预防、药物开发、癌症基因组学等精准医学研究中的应用潜力。参考文献：1. Wang Y, Guan ZY, Shi SW, et al. Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammaliancell. Nat Commun. 2024 15(1):1279.2. Meier F, Brunner AD, Koch S, et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics. 2018 17(12):2534-2545.3. Meier F, Brunner AD, Frank M, et al. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 17(12):1229-1236.

近日，中科院大连化学物理研究所王方军博士、邹汉法研究员等人在高通量多重蛋白质组定量分析方法研究方面取得新进展，发展了一级质谱(MS1)谱图中六种不同蛋白质样品同时规模化定量分析的同位素标记方法，并将该方法应用于细胞蛋白质合成-降解周转更新分析，分析通量是常规同位素标记方法的三倍，研究成果发表在自然出版社新创立的综合性刊物《科学报告》(Scientific Reports, 2013, 3, 1827. doi: 10.1038/srep01827)上。 　　基于一级质谱(MS1)的蛋白质组学定量分析由于定量精度高，是现今蛋白质组学定量分析中应用最为广泛的分析技术。由于同位素标记的限制，现有的方法最多可以在一次液相色谱-质谱联用分析中定量三种不同的蛋白质样品，极大限制了蛋白质组学定量分析的通量。王方军博士、邹汉法研究员等人将体内氨基酸同位素标记方法与体外二甲基化同位素标记方法进行有机组合，实现了六种不同蛋白质样品的差异标记并在单次实验中实现了相对定量分析。该六重同位素标记策略还可以应用于细胞中蛋白质的合成及降解速率的高通量分析，成功测定了HeLa细胞中1365个蛋白质的合成-降解周转更新时间。此外，该工作中使用的基于MS1六重蛋白质组学定量及蛋白质周转分析软件系统也由我所自主开发，是国际上首个可以同时定量六个不同蛋白质样品的软件系统。 Quant-ArMone 六重蛋白质组学定量及蛋白质周转分析软件示意图 HeLa细胞内蛋白质降解动态拟合曲线示例