流式细胞式尿分析仪

流式细胞胞仪的分析及分选原理流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和数字信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中，每秒钟能测量数千个至数万个细胞，能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析，带细胞分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。一、工作原理流式细胞仪的工作原理借鉴了荧光显微镜技术，将荧光显微镜的激发光源改为激光，使其具有了更好的单色性与激发[/

本课程小而精，是一块生物分析技术的重要拼图，短短7分钟的时间，一站式解答流式细胞分选技术的各种关键疑问，帮助你建立起对流式细胞分选术的整体认知。本课程主要涉及流式细胞分选技术的目的、注意事项、分选仪的

http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201305/2013052911190843.jpg近日在圣地亚哥召开的CYTO 2013年会上，BD生物科学发布了新一代高端流式分析平台BD LSRFortessa X-20。其30英尺见方的小巧的机身，整合了最新的激光和光学技术，可以同时配置5根激光器，同时检测20个参数，是多激光多色实验最理想的平台，满足高端科研用户的需求，可谓流式细胞仪的巅峰之作。

魏熙胤　牛瑞芳(天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室　天津　300060)摘　要　流式细胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式细胞术,是用流式细胞仪(flow cytome-ter FCM) 测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它是众多不同学术背景、不同科技领域相结合的结晶。它是物理学、生物学、医学等综合运用的产物。本文就流式细胞术的发展历史、流式细胞仪的原理及在各领域的应用进行综述,阐明现代流式细胞术由于结合单克隆抗体技术、定量荧光细胞化学技术,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。关键词　流式细胞术(FCM) 　历史　原理　应用

北京和睦家医院 孙芾　王厚芳 流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术，80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪，到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台。　　 FCM采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着该仪器性能的不断完善，操作简单的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不断发现使试验费用日益降低，FCM也从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。

4.1 流式细胞仪基本原理1. 生物学颗粒分析原理① 流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。② 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。③ 流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 ④ 流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。⑤ 鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。2. 流式细胞仪细胞分选原理在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。4.2 流式细胞仪的分类和基本结构1. 流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型(亦称台式机)和科研型（亦称大型机）。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。http://www.care100.com/yqxjpkc/images/112.gif

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

流式细胞仪（Flowcytometry）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。

[font=宋体]流式细胞分析是一种在生物学和医学领域广泛应用的实验技术，它可以实现对细胞群体的快速、准确分析和分类。本文将详细介绍流式细胞分析的步骤和流式免疫检测的应用，帮助读者全面了解这一技术的原理、方法和应用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]流式细胞分析方案主要分为[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]个步骤： [/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①样品制备：应通过机械分离方法或化学解离技术制备单细胞悬液，如采用酶溶液或钙螯合试剂。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②封闭：通常采用抗[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]抗体稀释液悬浮细胞，防止一抗非特异性结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③抗体孵育：流式细胞分析的孵育步骤涉及多种组分，包括一抗、二抗、链霉亲和素和荧光染料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④流式细胞仪检测：将处理后的细胞通过流式细胞仪进行检测和分析，获取细胞的各项指标数据。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]适当的对照[/b][/font][font=宋体]除了目标细胞之外，每次进行流式细胞实验还应包含以下对照：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]至少一份未染色样品，与试样同时进行每一步的缓冲液孵育，以优化实验的流速和电压。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一份适当的阴性对照样品，与试样基本相同，但用在一抗的宿主种属中生产的同型对照替代试样中的一抗。该对照用于非特异性结合二抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]如有需要也可准备一份已知表达所有目标抗原的细胞组成的阳性对照，并与试样共同孵育，但仅用单色检测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]流式免疫检测方法与应用[/b][/font][font=宋体]同其他免疫检测应用一样，流式细胞分析也可通过多种方法利用抗体探测特定的细胞基元。两大常用方法为：直接检测法和间接检测法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]直接检测法[/font][font=宋体][font=宋体]直接检测法采用一步染色工艺，仅需一抗即能特异性结合目标抗原，无需额外步骤，可直接与支持成像或其他结合状态检测的分子结合。在探测细胞表面抗原时，应避免固定细胞，因为固定可能导致抗体探针无法与目标抗原充分接触。因此，保持细胞活力对于数据采集至关重要。若需查找适用于直接检测法的抗体，推荐使用[/font][font=Calibri]Antibody Explorer[/font][font=宋体]抗体搜索工具，将搜索范围限定为“仅限一抗”，并将应用选择为“流式细胞分析”。这样，您将能够快速找到适合您实验需求的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]间接检测法[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]间接检测法首先使用纯化抗体与目标抗原进行结合，然后使用荧光染料标记的二抗（能够特异性靶向一抗的宿主同型）与一抗进行特异性结合，形成一抗[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]荧光二抗复合物。通过将纯化的一抗与各种波长（或颜色）的荧光染料标记的二抗（特异性针对产生一抗的宿主同型）进行搭配，可以增强抗体库的模块化程度。这种方法能够提高实验的灵敏度和特异性，同时减少背景干扰和误差。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service]流式细胞检测技术服务[/url]，其优势：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]①具有 [/font][font=Calibri]20,000 [/font][font=宋体]次以上流式抗体筛选鉴定经验及多年流式诊断抗体研发经验，在实验方案设计、样品制备、数据分析等方面确保科学性、准确性和可靠性[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=宋体]②拥有 [/font][font=Calibri]1,000 [/font][font=宋体]余株自产精品流式抗体，覆盖细胞膜、胞内、核内及分泌抗原；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③自产 [/font][font=Calibri]Annexin V/7-AAD [/font][font=宋体]凋亡检测试剂盒，并储备多种流式检测常用试剂，大大节约购买试剂的等待时间和实际费用；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④可以提供近 [/font][font=Calibri]200 [/font][font=宋体]种细胞系选择，省去细胞样本寄送过程中的风险，并可以免费提供健康人外周血细胞对照品。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font]

1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪(flow cytonletry，FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland —Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter Parker Horst Kamentsky1 Gohde、Fulwyler Herzen—berg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用⋯。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术和的13臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅 主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊 概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。

第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811302229_121122_1769204_3.gif[/img]

[size=16px][color=#ff0000][b][url=https://www.instrument.com.cn/job/position-79674.html]立即投递该职位[/url][/b][/color][/size][b]职位名称：[/b]流式细胞分析研究员[b]职位描述/要求：[/b]? 与其他人协作进行流式细胞仪及相关产品的研究与开发? 在产品开发过程中设计并开展包括免疫分型等细胞实验和数据分析，协助解决产品开发过程中的问题，验证产品性能满足需求? 根据产品特点和最新的行业动向，独立或与他人协作开发仪器产品的科研或临床应用，撰写应用资料? 实验室管理任职条件? 生命科学、医学或药学相关专业本科及以上学历? 具备完整的细胞生物学知识背景，有一定的细胞生物学工作或研究经验，能独立开展细胞实验和数据分析? 有流式细胞仪使用或开发经验，对流式细胞仪开发有高度的热情者优先考虑? 具备良好的英语读写能力? 思路清晰，工作态度积极，高度的责任心和良好的学习能力、沟通能力和团队协作精神[b]公司介绍：[/b] 美国安捷伦科技公司是一家多元化的高科技跨国公司，它于1999年从惠普公司分离出来，主要致力于通讯和生命科学两个领域内产品的研制开发、生产销售和技术服务等工作。 安捷伦科技公司是分析仪器系统的领导供应商，其产品正在化学、环保、食品、医药和生命科学领域中广泛使用。安捷伦具有世界最先进的化学分析仪器，丰富的法规适应性和专业技术经验，以及优良的支持服务系统，这些都能够帮助您的实验室超前...[url=https://www.instrument.com.cn/job/position-79674.html]查看全部[/url][align=center][img=,178,176]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108160948175602_3528_5026484_3.png!w178x176.jpg[/img][/align][align=center]扫描二维码，关注[b][color=#ff0000]“仪职派”[/color][/b]公众号[/align][align=center][b]即可获取高薪职位[/b][/align]

由于近期苹果联合创始人乔布斯的逝世，创新又再次成为了热点，这位梦想家用他的创造力和想象力重新诠释了创新的涵义，那就是以“用户体验”至上，追求完美。针对更高的需求，才会有更多的创新。创新精神遍及各个行业和各种产品，近年来流式细胞仪研发领域也不乏创新的产品，比如原理创新，操作创新，成像创新等，这些不同的创新，能满足不同的用户需求。流式细胞分析技术在现代细胞分子生物学研究中起着越来越重要的作用，这种分析技术是通过对单个细胞性状的快速测定，并结合先进的计算机分析系统，使得在短时间内可对大量细胞进行定性、定量测定。但以往进行流式细胞仪操作和分析需要技术熟练的研究团队，而且这一设备价值也不菲——起码也要10万美元，有些甚至达到50万美元，这对于许多实验室来说并不容易负担。近年来一些主流生物技术企业相继推出了新型流式细胞仪，不单将原本需要一支工程师队伍进行安装的大型设备压缩成为可以单人运送的紧凑型仪器，并让这一原本需要专人专业培训才能上手的复杂技术变得更加容易操作，而也价格也更加实惠——目前的流式细胞仪分析系统设置大部分都是自动化的，相关试剂盒也经过了多次验证，简化了操作，降低了入门门槛。一些大型的公司，比如Sony和BD加大了研发力度，开发出了10万美元以下的流式细胞仪，在美国其客户群开始由中心实验室转向了个人实验室。虽然简化了操作，但是这些新型的流式细胞仪也不是说就能立即上手的，用户在购买之前要弄清楚这一技术到底能做什么，不能做什么，有时实验室购买了流式细胞仪后觉得又不适用了，这样即浪费资源，也耽误时间，因此了解自己需要什么，了解不同仪器的优缺点十分重要。以下是目前市面上较受关注的几个新型流式细胞仪，通过分析它们的优点和缺点，也许您在选购的时候就更有目的性了。以上为转贴，版主如觉得不妥可删除

95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～[

有用过流式细胞仪做过微检的吗？可以介绍一下吗？因需要做定量微生物快速检测，好象目前就只有用流式细胞仪做，其它的都只能定性分析。但流式细胞仪能满足GB规定的不大于50cfu/ml吗？我们准备采购，有谁能介绍一下？报个价？jun665@qq.com ，谢谢啦！

谁知道目前市面上有那几家有便携式流式细胞仪，在户外使用的，急急急呀！！！谢谢了

流式细胞仪在分析数据时出现了异常数据分布，为什么？

想学习流式细胞相关知识，比如BD流式细胞仪，但不知道怎么学，有没有大神指导下该怎么学，先看什么，后看什么，有什么好的建议吗？

流式细胞仪(Flow cytometer, FCM)是70年代发展起来的对单个细胞进行定性定量测定的新型仪器，亦称荧光激活细胞分类仪(FACSC)，是一种将现代免疫荧光技术与流体力学、激光学、应用电子学和计算机等学科的先进技术相融合用于基础与临床细胞生物学研究的一项高科技实验检测仪器。它能在一定功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测到多个参数。与传统的荧光镜检测相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特点，已在医学、生物学的几乎所有领域里得到迅速的推广，并在各学科研究中发挥着重要的作用。我的这片文章9月发表，等正式发表了，我贴出来，需要的话可联系我shuguangfang@tom.com

流式细胞仪，哪位了解？哪里的好？请赐教！xq.shi@126.com

请问流式细胞周期结果分析方法?

2011年8月17日，BD FACSVerseTM 新产品发布会上海站在上海虹口喜来登大酒店举行，120余位来自江浙沪地区的科研院所人员聚集一堂，见证了新产品的发布。据悉，上海站是BD FACSVerse新品发布会中国区的第二站，其余两站分别于8月5日和22日在北京和上海隆重举行，此系列发布活动共有来自全国各地超过350名科研院所人员共同见证。BD FACSVerseTM 流式细胞仪是一款智能、灵活、可靠的新一代流式细胞分析系统，该系统最高可分析多达10个参数并支持广泛的研究应用。BD FACSVerseTM在硬件方面以及新BD FACSuiteTM软件实现了流式细胞技术史上的全新飞跃，BD FACSVerse彻底颠覆了流式细胞分析实验的补偿过程，让流式用不再为补偿而困惑。系统提供全面可靠地实验数据，稳定的仪器性能，简便自检功能，都使得BDFACSVerse获得的研究结果可以在不同实验室间，不同FACSVerse仪器间和用户间得到完美重复和验证。另外，BD FACSVerse还具有无与伦比的智能化特性，内置ID芯片的滤光片分光镜集成，实时确保用户正确无误的光学配置。配合BD FACS Universal Loader万用加样工作站，系统兼容从0.5ml微量离心管12x75ml流式管到50ml 锥形管等多种不同单管上样类型，同时还兼容多管管架，各种96孔板和384孔板实验板等各种高通量上样类型。BD FACSVerse打造了从系统条件设置到数据采集、分析以及关机的无缝化工作流程。与会人员对其操作的智能性、系统的灵活性以及数据结果的可信度等特征表示了浓厚的兴趣。http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201108/20110830142943210.jpgBD FACSVerseTM 流式细胞仪在众人瞩目中闪亮登场http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201108/20110830142943752.jpg会后的演示环节吸引了大家的关注，众人纷纷上前体验BD FACSVerseTM 流式细胞仪最新性能智能科技，自由掌控——BD FACSVerseTM 流式细胞仪的主要特点智能 灵活 掌控BD生物科学亚太区CA业务总监 John S Wotherspoon先生介绍道，BD FACSVerseTM 在研发的过程中融入了全球数以百计的流式细胞技术用户及研发者的反馈信息中一些关键的实际需要，新流式细胞仪简化了流式实验操作流程，简化了补偿操作，且系统可随时灵活升级，拥有智能的系统特性。http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201108/20110830142943442.jpgBD生物科学亚太区CA业务总监 John S Wotherspoon先生介绍BD FACSVerseTM 流式细胞仪——最佳灵敏度和紧凑型设计BD FACSVerseTM 系统的紧凑式光学系统采用了空间立体激发激光器，将光强最大化地集中在流动池上。其设计旨在将光在传输中的损失降到最低并为多色分析实验带来最佳的分辨率和检测灵敏度。BD FACSVerseTM的光学系统还融入有诸多尖端科技——包含或者专利保护的自动激光校准、加载智能芯片的7角型检测器阵列以及由特殊金属材质制成的流动池。这些匠心设计将最大程度的确保检测数据的可靠性。

流式细胞仪，反(散)射光和荧光形成的原因是什么？具体原理，以及他们的流式参数？

[font=宋体][font=宋体]在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，以期为读者提供全面的技术应用概览。流式细胞仪检测细胞增殖方法：[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]（氚离子）掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：是在细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时，用[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中，增殖的细胞因为掺入[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性[/font][/font][font=宋体][font=宋体]缺点：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别 [/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究 [/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]） 此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成，而不能提供合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的细胞是否进入增殖阶段的信息[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、相对计数法[/font][/font][/b][font=宋体]原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论[/font][font=宋体]注意点：[/font][font=宋体][font=宋体]对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔，这样每个孔可以得到[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个细胞数，将[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔取平均值后就是这个组的结果。如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入[/font][font=Calibri]1*105PE[/font][font=宋体]标记的人工微球作为内参[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]收集各组的细胞于[/font][font=Calibri]EP[/font][font=宋体]管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃静置[/font][font=Calibri]30min[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]洗涤一次，洗去游离的抗体[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、示踪染料标记法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]示踪染料与细胞结合的方式：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。当荧光强度减弱到标记时的[/font][font=Calibri]1/2[/font][font=宋体]以及以下的细胞都是增殖后的细胞，这些细胞所占比例越高则代表细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]标记方法：[/font][font=宋体][font=宋体]①纯化增殖反应的目标细胞，将细胞的浓度调整为[/font][font=Calibri]1*106/ml[/font][font=宋体]，加入[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体]，其标记浓度为[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]微摩尔[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]升。置于[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃水浴中标记[/font][font=Calibri]15min[/font][font=宋体]，在标记过程中每隔一段时间混匀细胞一次[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②加入预冷、含有血清的培养基终止标记，在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃冰箱中静置[/font][font=Calibri]5min[/font][font=宋体]，离心沉淀[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③用培养基再洗涤一次，尽量洗净未结合的游离的[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体]，然后将目标细胞静置在增殖体系中[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]EdU[/font][font=宋体]掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]：[/font][font=Calibri]5-[/font][font=宋体]溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶核苷的类似物，其特点是胸腺嘧啶环上[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]位[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]连接的甲基被溴取代，在细胞增殖[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中，而[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体可以特异性的识别[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]，不与胸腺嘧啶核苷结合，所以可以用于检测细胞增殖[/font][/font][font=宋体][font=宋体]适用范围：适用于体内检测目标细胞的增殖，一般将[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]掺入小鼠的应用水中或经腹腔注射，经过一段时间后，取出目标细胞制成单细胞悬液然后用多聚甲醛固定细胞，后用打孔剂皂苷在细胞膜上打孔，最后标记荧光素偶联抗[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体，目标细胞的[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]阳性细胞就是增殖的细胞，阳性比例越高，增殖越活跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、其他方法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]细胞周期法检测细胞增殖：流式细胞术能够检测细胞内[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的含量，所以可以检测细胞周期。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期的细胞，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的量处于二倍体和四倍体之间[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]处于[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期时，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]量为四倍体。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期和[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期的细胞比例越高说明细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]检测细胞增殖：[/font][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]（增殖细胞核抗原），在细胞核合成且只存在于细胞核内，是[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]聚合酶的辅助蛋白，所以与细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的合成关系密切，是反映细胞增殖状态的良好指标[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Ki-67[/font][font=宋体]检测细胞增殖：是一种与细胞增殖特异相关的核抗原[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CD71[/font][font=宋体]检测细胞增殖：是转铁蛋白受体，表达于细胞的表面，该受体广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面，正常细胞表达较少，与肿瘤细胞的增殖密切相关[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url]，更多关于流式细胞仪检测细胞增殖详情欢迎咨询，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

我司最近想采购一批流式细胞仪，地点重庆，可以上门考察交流。

关于流式细胞仪的介绍[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=36531]流式细胞仪[/url]

流式细胞仪的前向角FSC和侧向角SSC原理是什么？

[align=center][size=24px]流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合[/size][/align][align=center]肖书棋 18122884967[/align][align=center][/align]本次说明是基于核酸适配体能与靶标进行特异性结合的原理，利用流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合状况，还能比较不同适配体与靶细胞之间的结合强度的比较；本次所使用的流式分析仪是BD FACSAria III。[font='times new roman'][size=16px]1.原理介绍：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.1核酸适配体：[/size][/font]核酸适配体(Aptamer，Apt）：是一段寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），是利用指数富集的系统进化技术（the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）在多样寡核苷酸序列的文库中，进行体外筛选得到。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026239049_1528_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][size=13px]Aptamer结合靶标原理[/size][size=13px]图[/size][/align]如图所示，在合适的缓冲液环境下，单链寡核苷酸序列具有弯曲以及折叠成特定的三级空间结构的能力，该结构可以与靶分子特异性结合，SELEX技术就是应用该原理来进行选择的。将信息量巨大且随机的的寡核苷酸文库与靶标孵育，经过多轮的优胜劣汰和PCR扩增，最后得到能与靶标高亲和力性结合的寡核苷酸序列，即核酸适配体(Aptamer)。由于核酸适配体具有靶向特异性的特点，因此应用广泛；那么如何监测适配体靶向细胞亲和力的方法，就需要用到流式细胞术进行表征。[font='times new roman'][size=16px]1.2流式细胞仪原理：[/size][/font]流式细胞术能够快速检测细胞或者生物颗粒的特征，其检测灵敏，能够定性或者定量分析颗粒的参数，还具有细胞分选的功能，功能强大，分析参数多，实用性较强。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）的设计应用了光学、细胞化学、电子学等技术，拥有较强大的细胞及微粒分析功能，在临床医学、免疫学、微生物学等等研究领域发挥着巨大的作用。流式分析可以检测细胞表面颗粒复杂程度、核酸以及蛋白质的含量、细胞表面积或者细胞表面的抗体、细胞受体等等，在多种研究领域起到重要作用。在本研究中应用流式分析细胞荧光强度的基本步骤原理是：（1）制备成单细胞悬液：将待测细胞预处理进行荧光标记后制成单细胞悬液，通过气压将流式管中的细胞悬液通过管道压进流动室，同时喷出的鞘液将细胞包裹，形成圆形的鞘流，细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过流动室检测区域。（2）形成光散射：激发光源侧向垂直射向单个细胞，含有荧光的细胞形成两种光：①前向散射光（forward scatter， FSC）：激光束照射细胞时，光束偏移量较小（10°以内），散射至前方，可用于检测细胞等粒子的表面信息，颗粒体积越大，信号越强。②侧向散射光（side scatter，SSC）激光束照射颗粒，产生偏移角度为直角的散射光，可反应细胞内含物的信息。（3）光信号转化成电信号：光信号导入到计算机中，依次形成电信号，再转化为数字信息。应用FlowJo软件处理数据，可以获得相应的散点图、直方图等形式，便于直观分析。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026241158_6946_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][font='times new roman'][size=13px]流式分析基本原理图[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]2.分析步骤：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2.1细胞预处理：[/size][/font]通过流式分析预处理，可以使细胞在特定的环境，与带有FAM荧光的适配体进行特异性结合，通过平行实验使细胞与不同的适配体文库进行标记，最终表征其荧光强度，进行亲和力的分析与比较。如表所示，流式分析条件为：[align=center][size=13px]流式细胞分析条件探寻[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时条件[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]孵育时体积[/color][/size][/td][td=2,1][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时浓度[/color][/size][/align][align=center][size=13px][color=#000000]细胞浓[/color][/size][size=13px][color=#000000]度 [/color][/size][size=13px][color=#000000]单链DNA浓度[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]第二次洗涤用液[/color][/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]4 ℃，30 min,BB,摇晃[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]500 μL[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]2.5×10^6个/mL[/color][/size][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]125 nM[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]PBS x 2[/color][/size][/align][/td][/tr][/table]流式分析的大致步骤为：消化细胞、细胞与文库孵育、润洗重悬、上样分析。最终确定，初始的细胞悬液浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font] 个/mL，初始文库的浓度为250 nM；孵育时体系的总体积为250 L，细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL，适配体浓度为125 nM，环境为4 ℃、30 min，震荡。最后上样的细胞悬液体积为500 L，细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.1材料准备：[/size][/font][/align][align=center][size=13px] 流式分析主要仪器与试剂[/size][/align][table][tr][td][align=center]名称[/align][/td][td][align=center]规格/型号[/align][/td][td][align=center]作用[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]流式细胞仪[/align][/td][td][align=center]FACSAria III[/align][/td][td][align=center]对细胞进行流式分析[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]可调式混匀仪[/align][/td][td][align=center]MX-S[/align][/td][td][align=center]混悬适配体悬液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]震荡仪[/align][/td][td][align=center]MX-M[/align][/td][td][align=center]震荡孵育体系，防止细胞贴壁[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]制冷恒温金属浴[/align][/td][td][align=center]HX-20L[/align][/td][td][align=center]热击适配体，使核酸变性恢复到自由的无规则卷曲状态[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]显微镜[/align][/td][td][align=center]DMI1[/align][/td][td][align=center]观察细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]水浴氮吹仪[/align][/td][td][align=center]FY-DCY12S[/align][/td][td][align=center]加热试剂[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]电子天平[/align][/td][td][align=center]JA2003[/align][/td][td][align=center]称量药品[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]离心管[/align][/td][td][align=center]15 mL×10、50mL×10[/align][/td][td][align=center]分装试剂，装载需离心的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]低吸附离心管[/align][/td][td][align=center]2 mL×20[/align][/td][td][align=center]装适配体悬液，减少适配体与细胞在管壁上的吸附[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]一次性使用吸管[/align][/td][td][align=center]3 mL×20[/align][/td][td][align=center]方便地吸取PBS[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞刮刀[/align][/td][td][align=center]3010×1[/align][/td][td][align=center]刮下贴壁生长的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]PBS[/align][/td][td][align=center]50 mL×2[/align][/td][td][align=center]ScienCell[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞，重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞，重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]无酶无菌水[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]溶解适配体文库[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]DMEM高糖培养基[/align][/td][td][align=center]50 mL[/align][/td][td][align=center]停止消化[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞[/align][/td][td][align=center]＞5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个[/align][/td][td][align=center]作为目的细胞进行流式表征[/align][/td][/tr][/table]①配置Binding buffer（结合缓冲液BB）：配置10 g/L BSA：称量0.1g BSA，溶于10 mL Washing Buffer，过膜；取上述溶液5 mL，加入到445 mL Washing Buffer中；再加入500 L鲑精DNA，混匀。②将U盘格式化，提前打开制冰机和金属浴（95℃）；③37℃水浴：将无酶消化液、ECM、PBS（1）放入37℃水浴。④4℃冰敷：向泡沫盒中加碎冰，离心管架、温度计，准备4℃孵育环境，放入PBS和BB预冷。⑤打开显微镜（酒精擦拭载物台）。⑥打开离心机：120 g，1 min，25℃。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数和文库预处理[/size][/font][/align]（1）细胞计数（20倍或者40倍显微镜）：①采用直接计数法，在显微镜中随机选择五个点进行计数取平均值，根据视野的面积以及T75培养瓶面积计算细胞总数，推出公式：Y为总细胞数；X为视野中细胞平均数；Y=27886.12X（20倍镜下）/Y=111111.11X（40倍镜下)。为了保证流式有足够的细胞，需要保证细胞总数＞5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。②计算BB体积：V=Y/（2×10[font='times new roman'][size=16px]7[/size][/font]）mL，用V体积的BB重悬细胞沉淀，可获得细胞浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的初始细胞悬液。（2）文库预处理：①将粉末状适配体文库进行离心：4000 r，5 min，4℃；使适配体粉末聚集在离心管底部，防止打开离心管时干粉状适配体飞出。②按照说明用一定体积的无酶无菌水溶解适配体，使适配体母液浓度在5 M。③取100 L母液，并加入900 LBB，使适配体浓度在500 nM。④再去上述液体500 L，并用BB稀释至浓度为250 nM，最终得到250 nM的适配体文库悬液。⑤95℃热击3 min，热击后放在泡沫盒中冰敷。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞处理[/size][/font][/align]（1）消化：①PBS（37℃）润洗3次。②无酶消化液3 mL，消化9 min（等待期间准备好孵育用离心管；确认离心机参数为：120 rcf，1 min，25 ℃），吹打细胞使其从培养瓶表面脱落。直接转移至15mL离心管中，吹打混匀约20次（吹散细胞团，分离成单个细胞）。③显微镜观察确认细胞均从培养瓶上脱落，加入2-3 mL ECM至培养瓶中润洗，然后转移至上述离心管中，吹打终止消化。④离心：120 rcf，1 min，25℃。（等待期间各加入250 L待测文库至低吸附离心管中,注意要快速，吸取之前需要先混悬文库）。⑤离心之后小心倒出，用枪吸出剩下的ECM，加入2V L BB，重悬吸打混匀，获得5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞与文库结合[/size][/font][/align]①孵育：分别加入250 μL上述细胞悬液至250 μL ssDNA文库中，进行孵育：4℃，30 min，打开摇床第二格。②等待期间离心机调至4℃；用密封袋装好洁净的1000 L枪头准备流式上样用；2.2.2.5 润洗重悬细胞①取出孵育好的体系，进行离心：4℃，120 g，1 min（等待期间准备好4℃ PBS)。②倒掉上清液，用枪头小心吸出管口残留的上清液，每管加500 L PBS（4℃）用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]吸打重悬约20次。③再次离心4℃，120 g，1 min。④第二次重悬：重复①-③步骤。⑤每管加入500 L PBS重悬，忽略实验损失，最后得到理论细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[font='times new roman'][size=16px]2.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]送样分析[/size][/font]FAM荧光染色较弱，在预处理之后应尽快进行流式分析，流式分析上样程序复杂，需要正确进行开机，测样，关机的步骤，才能够得到准确的数据。[align=left]（1）准备工作：[/align][align=left]准备1000 mL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]，1000 mL 洁净枪头，流式管，质控微球。[/align][align=left]①开启液流系统：由上至下打开流式细胞仪开关；再开启计算机，打开FACSDiva软件，在“Cytometer仪器框”中确认流式细胞仪已与电脑连接，启动液流之前，确认液流系统水平，进行补充鞘液、去离子水、乙醇以及漂水，并清空废液。[/align][align=left]在“Cytometer”菜单中，点击“Fluidics Startup（启动液流系统）”，按照提示进行操作：确定气路和液路是从乙醇桶连接到了鞘液桶上：将蓝色液路管接到过滤器下方，透明气路管接到鞘液桶上；确定闭合的喷嘴是在流动检测池上。[/align][align=left]②将70 m的喷嘴放入装有超纯水的烧杯中，超声30 s，用无尘纸蘸干；抽出闭合的喷嘴；插入70 m的喷嘴（红圈朝上）。[/align][align=left]③点击“×steam”，开启液流，出现水滴状，调整使上端横线位于第二个或者第三个水滴的尾部，下端横线位于第三个或者第四个液滴的中部，调整好后关闭液流。[/align][align=left]（2）做质控：[/align][align=left]①用CS&T微球，用之前一定将微球甩匀（保证取出的微球呈均匀体系）用涡旋震荡；取一支洁净的流式管加入333 L的鞘液，再加一滴微球（用之前用混悬仪混匀，正常的微球为浑浊状）。[/align][align=left]②打开液流系统，在“Cytometer”菜单下点击“CST”；展开Setup Control窗口：在Characterize菜单中中选择“Check Performence”；在Configuration流式设置中：喷嘴的大小：选择70m，点击左下角“set configuration”，再点击“OK”。[/align][align=left]③选择微球的Lot ID：与微球瓶身上编号对应：10549。[/align][align=left]④敲弹准备好的微球悬液使其混匀，进行上样，打开液流；确认激发光源没问题即可关掉页面并关掉液流。[/align][align=left]（3）上样：[/align][align=left]①新建样品，并勾选FITC、SSC、FSC的H、A、W、log数据项。[/align][align=left]②作图：建立散点图，横坐标为FSC-H，纵坐标为SSC-H；再建立一个图：横坐标：FITC-H，纵坐标为：Count。[/align][align=left]③打开液流至3，选择对应样品；吹打混匀并放置样品，点击“LOAD”上样。调整FSC和SSC的电压，使散点图的中的点都集中在所圈的门中。（若散点偏右，则FSC电压过大，调整FSC电压使其变小，若散点偏上，则调整SSC使其变小。）当调整合适时点击“RECORD”记录数据。[/align][align=left]④计数完毕，调低流速，点击“unload”，选择第二个样品并重复第③步。[/align][align=left]⑤上样完毕之后，保存数据。[/align][align=left]（4）关机步骤：[/align][align=left]①上一管clean液，高速冲2 min；再上一管去离子水，高速冲5 min；关闭液流，检查液路系统。[/align][align=left]②在“Cytometer”菜单中，选择“shutdown”，根据指示操作：取下70 m的喷嘴，超声清洗，安装闭合喷嘴（红色点朝上）。[/align][align=left]③把液路和气路连接到乙醇桶上，用乙醇冲洗（先拔气路再拔液路）。[/align][align=left]④装一管clean液，清洗上样针和流动池。[/align][align=left]完成上述步骤之后即可关闭界面。[/align][align=left][/align][font='times new roman'][size=16px]2.3数据处理：[/size][/font]将原始数据用Flowjo软件进行处理，得到散点图以及荧光强度直方图，接下来通过举例来说明数据如何分析：（1） 散点图分析：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026242555_5228_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析散点图[/size][/align]该图为散点图，可以看出大体分为两个集团，散点图有两个集团说明体系中有两种细胞粒子，并且在该图片的左下角粒子较少，说明细胞碎片较少，在预处理时较好地保护了细胞的完整性。散点图中可以区分出整个上样的体系中主要含有两种大小的细胞颗粒，在预处理的过程中，无酶消化液的消化能力较弱，并且细胞团密度较大，细胞间黏连较多，在最后孵育结束用PBS进行重悬的时候仍然能够肉眼可见有白色细微絮状物。FSC值越大，代表颗粒的体积越大；SSC值越大，代表颗粒内部的复杂程度越高。故可初步判断，G1门中的颗粒为未消化完全的细胞团，而G2门中的颗粒为分散的单个细胞。（2） 直方图分析：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026243736_5071_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析直方图[/size][/align]图中为G2门选中的样品的荧光强度，该图中有两个峰，横坐标10[font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font]附近所产生的荧光峰可以判定是残留的细胞碎片，可视为背景值，横坐标10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]~10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]附近的峰代表四个适配体分别与细胞结合所产生的荧光强度，SYL3C-Aptamer结合偏移量最大，荧光较强，且高荧光事件次数较多，说明SYL3C-Aptamer与单个细胞的结合能力最强，并且G2门中的颗粒大多数为消化完全的单个细胞，呈现出较好的特异性。总之，该组结果对比体现出，单个细胞靶点较多，适配体与单个细胞结合能力较高，通过荧光强度波峰的偏移所反映的适配体与细胞特异性结合能力的大小依次为SYL3C-Aptamer＞EP166-Aptamer＞CA2-Aptamer＞ARC1172-Aptamer。同时，由图中可以看出：10th-ssDNA pool与SYL3C-Aptamer在10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]～10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]荧光强度波峰较高，说明二者与单个细胞的结合能力较好，结合位点较多，呈现良好的特异性和亲和性。SYL3-Aptamer荧光波峰明显右移，与单个细胞的结合位点较多。[font='times new roman'][size=16px]三、总结[/size][/font]本次说明旨在利用带荧光的适配体靶向特异性结合目的细胞的原理，利用流式细胞仪监测适配体结合靶细胞能力的强弱，同时还可以应用于不同适配体靶向同一种细胞的结合能力强弱的比较。进一步利用流式细胞仪，还可以测定适配体的Kd值；还可以根据预处理的条件不同，与对照组比较，来测定适配体靶向细胞的受体是位于细胞膜表面还是细胞内，从而进一步测定适配体的生物学稳定性。同时，流式细胞仪还有很多方面的应用，例如鉴定细菌、检测细胞凋亡等，一些抗体-细胞复合物的结合情况也能够由流式细胞仪来进行监测。 在进行流式上样的过程中，预处理、上样以及数据处理阶段都有需要注意的细节，例如：本次所使用的细胞为贴壁生长的内皮细胞，故在细胞预处理时需要先消化细胞；在进行上样前，需要将样品进行吸打混匀，以免细胞沉积在流式管底部，导致未吸取到样品；在应用流式细胞仪的过程中，使用前的维护、质控流程十分重要，该流程会直接影响所得数据的稳定性；不同的流式细胞仪的维护程序稍有不同，本次说明中的使用方法只适用于BD FACSAria III，流式细胞仪具有强大的分析功能，其在细胞研究中具有重要的作用。[align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align]

多维流式细胞仪可同时进行多参数测量，在特定空间内对细胞群进行分析。若要实现该多维空间的合理使用，每个特定参数需提供额外信息来识别细胞群，并确保其动态范围能够最大限度地加以利用。本研究就白细胞的光信号散射情况进行了详细说明，从而促进了多维流式细胞分析的开展。细胞制备技术的提升对获得高分辨率光散射信号至关重要，可以实现粒细胞、单核细胞、颗粒状和非颗粒状淋巴球的完全分离。对搜集前向散射光的角度进行了改进，以提升白细胞的区分度。尽管正交光散射信号能够区分颗粒状和非颗粒状淋巴细胞，但仍无法利用线性或对数函数的形式将分辨率和动态范围显示出来。而在正交光散射信号中应用多项式函数，则可将白细胞全部以高分辨率显示出来。关联前向和正交光散射信号可实现高分辨率光散射与非线性显示的结合，使细胞群呈现等距分布状态。使用这种方式，可将外周血中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱粒细胞、单核细胞、颗粒状和非颗粒状淋巴细胞等都显示出来，占据与正交和前向光散射相关的不同位置。出人意料的是，嗜碱粒细胞是处在了颗粒状淋巴和单核细胞附近而非中性和嗜酸性粒细胞。流式细胞术中的人体白细胞光散射特性主要应用于区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。前向光散射信号与细胞的大小和折光率有关，而正交光散射信号则与细胞的粒度有关。一项对正交光散射信号更进一步的分析显示出了淋巴细胞成分的差异，即非颗粒状淋巴细胞的信号比颗粒状的要低。此外，该方法还显示了白血球的正交光散射信号在不同疾病状态下的变化情况。高分辨率光散射要在最佳角度收集散射参数，并对散射光的收集光路进行优化。改进细胞制备方法对最大限度地实现对细胞群的分离至关重要。改变制备流程可能导致细胞群分辨率的提高或降低。通过光散射，可从测量中排除受损细胞和无核细胞的干扰，从而提高细胞群的分辨率。正交光散射信号的动态范围不允许在相同线性尺度上同时观察淋巴细胞群和中性粒细胞。本研究提供了一种新方法，通过对正交光散射信号进行数字信号处理转换，实现了白细胞群在光散射显示中更加均衡的分布。这种转换提升了淋巴细胞分辨率，实现了细胞的可视化，而动态范围的确定对中性粒细胞的观察也十分重要。因此，重新对细胞群在多维空间进行定位可使细胞群在制备过程中实现完美分离。