基于高通量的质谱技术方法,目前,各种疾病相关的差异蛋白质组数据高速增长。但是要从这些数据中发现生物学规律,挖掘得到疾病相关的生物标记物,以及发现潜在的疾病药物靶标,还有很艰难的数据分析任务需要完成。需要借助生物信息学的工具,去综合现有数据库数据及文献数据的知识,对这些蛋白质进行综合分析。发表于蛋白质组学杂志上的一篇综述From proteome lists to biological impact-tools and strategies for the analysis of large MS data sets. (Rainer et.al,. Proteomics 2010,10.1270-1283)很好地概括了面对海量的蛋白质组数据这个艰巨的任务时,生物学家和生物信息学家共同发展的数据分析策略和方法,从而数据中挖掘出隐藏的生物学知识。文章介绍了数据预处理过程(如ID转换)、功能富集分析、网络分析及蛋白质性质分析(如PTM, domain,motif)等工具;另外,还介绍了随着实验数据增长起来的文献数据的文本挖掘方法。
声明:排列次序按跟贴先后排列,并无排名意图。----------------------------------------------------------------:):):):):):):):)-----------------------------------------------------------------国内生物信息学领域权威:----------------------------------------------------------------*.陈润生:是我国最早从事理论生物学和生物信息学研究的科研人员之一。二十多年来在生物信息学领域进行了系统的研究,曾参加我国第一个完整基因组泉生热袍菌 B4基因组序列的组装和基因标识,曾参加人类基因组1%和水稻基因组工作草图的研究。共发表学术论文100余篇,自1996年以来在国际学术会议上共作大会报告及分组会报告十余次。陈教授写过大量的生物信息方面概述性的论文,算是我的启蒙老师吧。http://www.ibp.ac.cn/c/faculty/02/runshengchen.html*.杨焕明:杨焕明教授一直从事基因组科学的研究。他主持完成的 “人类基因组计划—中国卷”使中国成为这一被称为“二十世纪登月计划”的宏伟项目的成员国,得到了各国领导人和国际科学界的高度赞扬。杨焕明教授及其团队“华大基因”)所承担的人类基因组、水稻基因组以及家猪、家鸡、家蚕基因组等重大项目使我国的基因组研究得以跻身于世界前沿。2003年,“华大基因”又在水稻基因组完成图、家蚕基因组“框架图”的绘制以及SARS冠状病毒的基因组研究及建立诊断方法都做出了新的成绩。杨焕明教授还特别关注基因组研究的社会影响和基因知识的普及。http://www.big.ac.cn/big/center/yhm.jsp?id=25*.罗静初:北京大学生物信息中心教授,博士生导师,欧洲分子生物学网络组织中国节点负责人,英国Briefings in Bioinformatics杂志编委。1947年生,1970年毕业于北京大学生物系。1986年起从事DNA和蛋白质序列计算机分析。1987-89赴美国马里兰大学进修访问,从事蛋白质分子模型和计算机在分子生物学中的应用研究。1991-99先后5次赴英国帝国癌症研究所合作研究,从事蛋白质分子模型、蛋白质结构域分析和数据库构建、蛋白质回环数据库构建等研究。1996年起主持和参加863、973、211、985,以及自然科学基金委、教育部、北京市科委等项目。 发表学术论文30多篇,主持翻译《生物信息学概论》、合作编写《生物信息学》、《分子生物学前沿技术》,开设“实用生物信息技术”研究生课程。我入门时看过的很多生物信息学讲义都是罗教授的,个人觉得罗教授的生物信息学讲义是学习生物信息入门的首选。http://www.bio.pku.edu.cn/collegereview/teacherinfo/teacher/luojc.jsp 郝柏林:郝柏林 1934年6月生于北京市。1959年毕业于乌克兰国立哈尔科夫大学物理数学系。后在中国科学院物理研究所工作。1978年晋升为研究员、副所长。1980年11月当选为中国科学院院士。现任物理学系研究员、博士生导师。兼任中国博士后基金会副理事长、陈嘉庚国际学会常务董事。曾任中国科学院理论物理研究所副所长、所长。主要从事理论物理、计算物理、非线性科学和理论生命科学的研究。涉及固体电子能谱和声子谱、金属红外性质、高分子半导体理论、统计物理模型、相变和临界现象、临界动力学、闭路格林函数方法、动力电网计算、天线计算、地震活动性统计分析、群论知识工程系统、计算机程序设计、混沌动力学和符号动力学、DNA序列分析等领域。http://www.fudan.edu.cn/new_teach/hebolin.htm施蕴渝: 1965年7月毕业于中国科学技术大学生物物理系。1965年9月-1970年2月,卫生部中医研究院,实习研究员。1970年2月-中国科学技术大学生物系助教,讲师,副教授,教授。1979年-1981年意大利罗马大学物理化学系访问学者。1984年6月-1985年1月及1990年3月-9月,荷兰格罗宁根大学物理化学系合作研究。1994年1月法国巴黎南大学,C.N.R.S酶学及生化结构实验室合作研究。1995年11月及1996年3月-4月法国NANCY大学CNRS理论化学实验室合作研究。曾任中国科学技术大学生命科学学院首任院长,中国科学技术大学学术委员会副主任,中国科学技术大学学术委员会结构生物学实验室(中国科学院重点实验室)学术委员会主任,教育部高等学校生物科学与工程教学指导委员会主任委员,中国科学院生物学部常委。国家863项目、国家自然科学基金委项目负责人、973项目中的课题负责人以及中国科学院知识创新项目负责人。http://www.zgkjcx.com/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=1702张春霆:著名生物物理学家。1936年9月出生于山东省烟台市。1961年毕业于复旦大学物理系,同年起在复旦大学攻读理论物理专业研究生,1965年毕业。1965—1970年在天津工科师范学院任教,1970—1979年在天津轻工业研究所工作,1979—1982年在法国国立理论物理研究中心作访问学者。从1984年起在天津大学物理系工作至今。1995年当选为中国科学院院士。2001年当选第三世界科学院院士。是意大利国际理论物理研究中心境外研究员,美国科学促进协会会员。主要的学术成就:张教授是我国少数生物信息学家之一。他有较强的数学、物理学和计算机技术基础,以此为背景,从20世纪80年代初开始,他转而研究计算生物学和生物信息学,先后在国外SCI刊物上发表论文70余篇,被引用400余次。他的主要贡献在两个方面:一是提出用双Sine—Gordon偏微分方程组来模拟DNA分子在转录和复制过程中碱基运动的动力学机制,此工作得到近100次的SCI引用。二是提出了DNA序列的Z曲线理论,开拓了一条用几何学方法分析DNA序列的新途径。目前,Z曲线理论在基因组学和生物信息学中已获得了重要的应用,成为生物信息学的一个重要研究方向。在理论分子生物学研究中系统地开创了DNA序列分析中的几何学研究途径,得出了关于天然蛋白质的稳定性与密码子的选用之间存在着强关联等的重要结论。在蛋白质结构类的预测研究中取得了世界领先性的成果,提出了预测HIV蛋白酶对蛋白质的剪切活性部位的有效方法;提出了解释细胞内微管蛋白质装配过程的内部运动机制的精妙理论。张教授的研究成果曾获国家教委科技进步一等奖 (1996),国家自然科学二等奖 (1997) 和何梁何利科技进步奖 (2001)。他还获天津市劳动模范荣誉称号 (2000)。http://www.tju.edu.cn/survey/zhangchunting.htm李衍达: 李衍达院士出生于1936年10月,1959年毕业于清华大学,1979~1981年作为中国第一批赴美访问学者在麻省理工学院访问。现为中国科学院院士、国务院学位委员会委员、中国自动化学会理事长、清华大学校学术委员会主任、教授、博士生导师。李衍达院士长期从事信号处理理论及地震勘探数据处理方法的研究。他研究的仅用相位谱、 幅度谱或附加部分时域采样点恢复有限长离散信号等问题,在信号重构理论及算法的研究上达到了国际先进水平。他将新的信号处理与模式识别方法用于地震勘探数据处理,取得了开拓性成果。李衍达院士发表了《信号重构理论及应用》等多部著作和论文;先后获国家自然科学奖、国家教委科技进步奖、北京市科技进步奖及教学成果国家特等奖。 http://www.pupk.com/discovery/zt1/data/3337.htm[/siz
蛋白质化学与蛋白质组学夏其昌 曾嵘 等编著2004年4月出版ISBN 7-03-012401-4/Q.133116开,平装,580页定价: 75.00元 本书系统论述了蛋白质化学基础理论和实验技巧,也反映了蛋白质组学研究的最新成果。内容包括:蛋白质的表征,蛋白质的组成分析和序列测定,与此相关的实验方法,包括各种色谱、电泳、质谱技术等,以及应用在蛋白质表征研究和基因工程产品的质检方面的实际范例。在蛋白质组学领域介绍了基本概念、样品制备、双向凝胶电泳的图像分析和定量分析、质谱等常规方法,并介绍了国际上最新的多维技术在研究中的应用;同时充分体现了生物信息学在蛋白质组研究中的重要性。 本书可作为生物学、医学、化学专业大学生,研究生和教学人员的参考书,也是从事生物化学、分子生物学、医学等领域中分离分析工作人员的参考书。
原创与否-声明:排列次序按跟贴先后排列,并无排名意图。----------------------------------------------------------------:):):):):):):):)-----------------------------------------------------------------国内生物信息学领域权威:----------------------------------------------------------------*.陈润生:是我国最早从事理论生物学和生物信息学研究的科研人员之一。二十多年来在生物信息学领域进行了系统的研究,曾参加我国第一个完整基因组泉生热袍菌 B4基因组序列的组装和基因标识,曾参加人类基因组1%和水稻基因组工作草图的研究。共发表学术论文100余篇,自1996年以来在国际学术会议上共作大会报告及分组会报告十余次。陈教授写过大量的生物信息方面概述性的论文,算是我的启蒙老师吧。http://www.ibp.ac.cn/c/faculty/02/runshengchen.html*.杨焕明:杨焕明教授一直从事基因组科学的研究。他主持完成的 “人类基因组计划—中国卷”使中国成为这一被称为“二十世纪登月计划”的宏伟项目的成员国,得到了各国领导人和国际科学界的高度赞扬。杨焕明教授及其团队“华大基因”)所承担的人类基因组、水稻基因组以及家猪、家鸡、家蚕基因组等重大项目使我国的基因组研究得以跻身于世界前沿。2003年,“华大基因”又在水稻基因组完成图、家蚕基因组“框架图”的绘制以及SARS冠状病毒的基因组研究及建立诊断方法都做出了新的成绩。杨焕明教授还特别关注基因组研究的社会影响和基因知识的普及。http://www.big.ac.cn/big/center/yhm.jsp?id=25*.罗静初:北京大学生物信息中心教授,博士生导师,欧洲分子生物学网络组织中国节点负责人,英国Briefings in Bioinformatics杂志编委。1947年生,1970年毕业于北京大学生物系。1986年起从事DNA和蛋白质序列计算机分析。1987-89赴美国马里兰大学进修访问,从事蛋白质分子模型和计算机在分子生物学中的应用研究。1991-99先后5次赴英国帝国癌症研究所合作研究,从事蛋白质分子模型、蛋白质结构域分析和数据库构建、蛋白质回环数据库构建等研究。1996年起主持和参加863、973、211、985,以及自然科学基金委、教育部、北京市科委等项目。 发表学术论文30多篇,主持翻译《生物信息学概论》、合作编写《生物信息学》、《分子生物学前沿技术》,开设“实用生物信息技术”研究生课程。我入门时看过的很多生物信息学讲义都是罗教授的,个人觉得罗教授的生物信息学讲义是学习生物信息入门的首选。http://www.bio.pku.edu.cn/collegereview/teacherinfo/teacher/luojc.jsp 郝柏林:郝柏林 1934年6月生于北京市。1959年毕业于乌克兰国立哈尔科夫大学物理数学系。后在中国科学院物理研究所工作。1978年晋升为研究员、副所长。1980年11月当选为中国科学院院士。现任物理学系研究员、博士生导师。兼任中国博士后基金会副理事长、陈嘉庚国际学会常务董事。曾任中国科学院理论物理研究所副所长、所长。主要从事理论物理、计算物理、非线性科学和理论生命科学的研究。涉及固体电子能谱和声子谱、金属红外性质、高分子半导体理论、统计物理模型、相变和临界现象、临界动力学、闭路格林函数方法、动力电网计算、天线计算、地震活动性统计分析、群论知识工程系统、计算机程序设计、混沌动力学和符号动力学、DNA序列分析等领域。http://www.fudan.edu.cn/new_teach/hebolin.htm施蕴渝: 1965年7月毕业于中国科学技术大学生物物理系。1965年9月-1970年2月,卫生部中医研究院,实习研究员。1970年2月-中国科学技术大学生物系助教,讲师,副教授,教授。1979年-1981年意大利罗马大学物理化学系访问学者。1984年6月-1985年1月及1990年3月-9月,荷兰格罗宁根大学物理化学系合作研究。1994年1月法国巴黎南大学,C.N.R.S酶学及生化结构实验室合作研究。1995年11月及1996年3月-4月法国NANCY大学CNRS理论化学实验室合作研究。曾任中国科学技术大学生命科学学院首任院长,中国科学技术大学学术委员会副主任,中国科学技术大学学术委员会结构生物学实验室(中国科学院重点实验室)学术委员会主任,教育部高等学校生物科学与工程教学指导委员会主任委员,中国科学院生物学部常委。国家863项目、国家自然科学基金委项目负责人、973项目中的课题负责人以及中国科学院知识创新项目负责人。http://www.zgkjcx.com/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=1702张春霆:著名生物物理学家。1936年9月出生于山东省烟台市。1961年毕业于复旦大学物理系,同年起在复旦大学攻读理论物理专业研究生,1965年毕业。1965—1970年在天津工科师范学院任教,1970—1979年在天津轻工业研究所工作,1979—1982年在法国国立理论物理研究中心作访问学者。从1984年起在天津大学物理系工作至今。1995年当选为中国科学院院士。2001年当选第三世界科学院院士。是意大利国际理论物理研究中心境外研究员,美国科学促进协会会员。主要的学术成就:张教授是我国少数生物信息学家之一。他有较强的数学、物理学和计算机技术基础,以此为背景,从20世纪80年代初开始,他转而研究计算生物学和生物信息学,先后在国外SCI刊物上发表论文70余篇,被引用400余次。他的主要贡献在两个方面:一是提出用双Sine—Gordon偏微分方程组来模拟DNA分子在转录和复制过程中碱基运动的动力学机制,此工作得到近100次的SCI引用。二是提出了DNA序列的Z曲线理论,开拓了一条用几何学方法分析DNA序列的新途径。目前,Z曲线理论在基因组学和生物信息学中已获得了重要的应用,成为生物信息学的一个重要研究方向。在理论分子生物学研究中系统地开创了DNA序列分析中的几何学研究途径,得出了关于天然蛋白质的稳定性与密码子的选用之间存在着强关联等的重要结论。在蛋白质结构类的预测研究中取得了世界领先性的成果,提出了预测HIV蛋白酶对蛋白质的剪切活性部位的有效方法;提出了解释细胞内微管蛋白质装配过程的内部运动机制的精妙理论。张教授的研究成果曾获国家教委科技进步一等奖 (1996),国家自然科学二等奖 (1997) 和何梁何利科技进步奖 (2001)。他还获天津市劳动模范荣誉称号 (2000)。http://www.tju.edu.cn/survey/zhangchunting.htm李衍达: 李衍达院士出生于1936年10月,1959年毕业于清华大学,1979~1981年作为中国第一批赴美访问学者在麻省理工学院访问。现为中国科学院院士、国务院学位委员会委员、中国自动化学会理事长、清华大学校学术委员会主任、教授、博士生导师。李衍达院士长期从事信号处理理论及地震勘探数据处理方法的研究。他研究的仅用相位谱、 幅度谱或附加部分时域采样点恢复有限长离散信号等问题,在信号重构理论及算法的研究上达到了国际先进水平。他将新的信号处理与模式识别方法用于地震勘探数据处理,取得了开拓性成果。李衍达院士发表了《信号重构理论及应用》等多部著作和论文;先后获国家自然科学奖、国家教委科技进步奖、北京市科技进步奖及教学成果国家特等奖。 http://www.pupk.com/discovery/zt1/data/3337.htm贺福初,中国科学院院士,第三世界科学院院士。1962年出生于湖南安乡,1982年毕业于复旦大学后考入军事医学科学院攻读硕士学位并入伍,相继获生物化学硕士、细胞生物学博士学位。现任复旦大学生物医学研究院院长、教授,军事医学科学院副院长、研究员,博士生导师。主要从事基因组学、蛋白质组学与生物信息学研究。曾发现“细胞活性因子的发育相关进化”、“相互作用分子的协同进化”、“mRNA编码区与非编码区的协调进化”及“物种演化中的分子减速进化”等规律性现象;发现并克隆肝细胞生成素、揭示其基因调控机制、研制其重组品,发现其受体及其两条信号转导通路;建立人胎肝转录组及其蛋白质组,从中发现500余种新基因、新蛋白质;发现中国人群常见恶性肿瘤及慢性肝炎等的易感基因10余种;倡导并领衔了人类第一个组织、器官的“人类肝脏蛋白质组计划”,这也是中国第一次领导大型国际合作计划,Nature、Science、Nature Biotechnology等国际著名杂志给予高度评价。以责任作者在国际核心刊物Nature Genetics、PNAS、Gastroenterology、Hepatology、Genome Res、Mol Cell Proteomics、Cancer Res、JBC、Oncogene等
PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体,用激光脉冲使其离子化,离子被加速后通过飞行管时分离,所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件:样品点样制备工作站(SymBiot 1)、生物质谱工作站(Voyager-DE PRO)和自动化分析软件(AutoMS-Fit)。SymBiot1 是一个自动样品处理系统,支持亚微升级微量点样,具有快速省时、重现性好的特点;Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统,配有AB公司之专利—延迟检测技术,具有高分辨率、质荷比宽等特点;AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库,查询参数可以任意设定,检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分,该组分理化性质不清楚,天然含量十分低,并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析,仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成,分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分(洗脱梯度增加了2.5倍),证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛,基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判,为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定,还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint,PMF),提供相关生物信息学服务,并且还可以利用源后衰变(Post Source Decay,PSD)技术来获得样品的MS/MS数据,以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率,使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值,过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解,产生一系列碎片离子,在反射器的作用下,最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后,即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术,还可以对磷酸化,糖基化等翻译后修饰进行定位分析,同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.(1997)将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一,PS1的精确度可以达到10 ppm,灵敏度为fmol,分子量检测范围可达到500 kDa,每天可自动分析40-100个样品,适用于大规模“蛋白质组学”研究。
[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=141411]蛋白质一级结构测定的新进展.pdf[/url][img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=141412]代谢组学研究进展.pdf[/url][img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=141413]蛋白质组学研究中的质谱鉴定与生物信息学分析.pdf[/url]
2013全国生物信息学培训班(第三期)http://train.360bio.com.cn/sites/train.360bio.com.cn/themes/train/images/button_02.jpg 生命科学的迅猛发展以及新一代的测序技术创造了海量的生物数据,但生命的奥妙并未就此解开,众多科研人员泡在数据的海洋里确打捞不到有效的信息;一些宝贵的数据被挖掘后又无法进行科学系统的分析。到底该如何利用生物信息技术挖掘有效数据,如何从大量数据中获得重要的科研成果,请选择生物信息学前沿技术专题培训班! http://train.360bio.com.cn/sites/train.360bio.com.cn/files/images/675-166.jpg现将有关事项通知如下:培训时间2013年12月10日—2013年12月13日主办单位湖南省赢通基因与细胞工程技术研究中心湖南省生物医学信息专业委员会承办单位中南大学湘雅三医院长沙赢润生物技术有限公司湖南能润医学诊断技术股份有限公司协办单位中南大学湘雅医院中南大学湘雅二医院湖南省医院协会支持单位仪器信息网www.instrument.com.cn中国生物器材网生物帮培训地点湖南省赢通基因与细胞工程技术研究中心培训对象从事生命科学、农学、医学等领域科研工作者和高校教师及研究生培训方式理论讲授和实验操作紧密结合。培训特色 1. 小班授课,环境优雅,一人一机,无需自备电脑; 2. 全程在计算机前讲授和操作,每位学员在辅导教师的指导下,独立完成数据的查询、分析、编辑以及绘图等操作; 3. 精心挑选相应的上机软件及配套练习案例,为每位学员提供充足的实际操作机会,让每位学员学到扎实的操作技能; 4. 技术团队可协助解答学员平时在科研上遇到的疑问和技术难题。培训费用3600 元/人, 费用包括:培训资料、教学、培训期间的午餐;可协助安排住宿,住宿费用自理。本次课程限定名额20名,为确保培训资源得到最佳利用,请尽快申请报名参加。课程安排 时间课程时长第一天基因组学、生物信息学前沿技术动态1.5h常用生物数据及数据库介绍(NCBI、UCSC、ENSEMBL、EBI/SWISSPROT Kegg 、Rice/Silkworm等)2h基因组数据挖掘2h新一代测序技术原理与数据处理1.5h第二天Linux操作基础2h新一代生物信息分析工具平台介绍2h基因组de novo 组装方法与软件4h第三天基因组注释和基因注释2h全基因组或目标区域重测序数据分析3h比较基因组和进化分析3h第四天蛋白质结构分析与预测2hRNA分析原理及其应用(转录组、SmallRNA、long no-coding RNA)2h表观基因组介绍及应用(经典案例分析,经典文章解读,主流技术)3.5h往期培训2013全国分子细胞生物学实验技术培训班 http://train.360bio.com.cn/sites/train.360bio.com.cn/files/styles/medium/public/images/course/2011/IMG_5955_0.JPG?itok=fDuoShlI http://train.360bio.com.cn/sites/train.360bio.com.cn/files/styles/medium/public/images/course/2011/IMG_6007_0.JPG?itok=BEetpMGn http://train.360bio.com.cn/sites/train.360bio.com.cn/files/styles/medium/public/images/course/2011/IMG_6030_0.JPG?itok=BxKP6wOz [url=http://train.360bio.com.cn/sites/train.360bio.com.cn/files/images/course
蛋白质数据库 1. PIR和PSDPIR国际蛋白质序列数据库(PSD)是由蛋白质信息资源(PIR)、慕尼黑蛋白质序列信息中心(MIPS)和日本国际蛋白质序列数据库(JIPID)共同维护的国际上最大的公共蛋白质序列数据库。这是一个全面的、经过注释的、非冗余的蛋白质序列数据库,包含超过142,000条蛋白质序列(至99年9月),其中包括来自几十个完整基因组的蛋白质序列。所有序列数据都经过整理,超过99%的序列已按蛋白质家族分类,一半以上还按蛋白质超家族进行了分类。PSD的注释中还包括对许多序列、结构、基因组和文献数据库的交叉索引,以及数据库内部条目之间的索引,这些内部索引帮助用户在包括复合物、酶-底物相互作用、活化和调控级联和具有共同特征的条目之间方便的检索。每季度都发行一次完整的数据库,每周可以得到更新部分。PSD数据库有几个辅助数据库,如基于超家族的非冗余库等。PIR提供三类序列搜索服务:基于文本的交互式检索;标准的序列相似性搜索,包括BLAST、FASTA等;结合序列相似性、注释信息和蛋白质家族信息的高级搜索,包括按注释分类的相似性搜索、结构域搜索GeneFIND等。 PIR和PSD的网址是:http://pir.georgetown.edu/。 数据库下载地址是:ftp://nbrfa.georgetown.edu/pir/。 2. SWISS-PROT SWISS-PROT是经过注释的蛋白质序列数据库,由欧洲生物信息学研究所(EBI)维护。数据库由蛋白质序列条目构成,每个条目包含蛋白质序列、引用文献信息、分类学信息、注释等,注释中包括蛋白质的功能、转录后修饰、特殊位点和区域、二级结构、四级结构、与其它序列的相似性、序列残缺与疾病的关系、序列变异体和冲突等信息。SWISS-PROT中尽可能减少了冗余序列,并与其它30多个数据建立了交叉引用,其中包括核酸序列库、蛋白质序列库和蛋白质结构库等。利用序列提取系统(SRS)可以方便地检索SWISS-PROT和其它EBI的数据库。 SWISS-PROT只接受直接测序获得的蛋白质序列,序列提交可以在其Web页面上完成。 SWISS-PROT的网址是:http://www.ebi.ac.uk/swissprot/。 3. PROSITE PROSITE数据库收集了生物学有显著意义的蛋白质位点和序列模式,并能根据这些位点和模式快速和可靠地鉴别一个未知功能的蛋白质序列应该属于哪一个蛋白质家族。有的情况下,某个蛋白质与已知功能蛋白质的整体序列相似性很低,但由于功能的需要保留了与功能密切相关的序列模式,这样就可能通过PROSITE的搜索找到隐含的功能motif,因此是序列分析的有效工具。PROSITE中涉及的序列模式包括酶的催化位点、配体结合位点、与金属离子结合的残基、二硫键的半胱氨酸、与小分子或其它蛋白质结合的区域等;除了序列模式之外,PROSITE还包括由多序列比对构建的profile,能更敏感地发现序列与profile的相似性。PROSITE的主页上提供各种相关检索服务。PROSITE的网址是:http://www.expasy.ch/prosite/。 4. PDB蛋白质数据仓库(PDB)是国际上唯一的生物大分子结构数据档案库,由美国Brookhaven国家实验室建立。PDB收集的数据来源于X光晶体衍射和核磁共振(NMR)的数据,经过整理和确认后存档而成。目前PDB数据库的维护由结构生物信息学研究合作组织(RCSB)负责。RCSB的主服务器和世界各地的镜像服务器提供数据库的检索和下载服务,以及关于PDB数据文件格式和其它文档的说明,PDB数据还可以从发行的光盘获得。使用Rasmol等软件可以在计算机上按PDB文件显示生物大分子的三维结构。RCSB的PDB数据库网址是:http://www.rcsb.org/pdb/。 5. SCOP 蛋白质结构分类(SCOP)数据库详细描述了已知的蛋白质结构之间的关系。分类基于若干层次:家族,描述相近的进化关系;超家族,描述远源的进化关系;折叠子(fold),描述空间几何结构的关系;折叠类,所有折叠子被归于全α、全β、α/β、α+β和多结构域等几个大类。SCOP还提供一个非冗余的ASTRAIL序列库,这个库通常被用来评估各种序列比对算法。此外,SCOP还提供一个PDB-ISL中介序列库,通过与这个库中序列的两两比对,可以找到与未知结构序列远缘的已知结构序列。SCOP的网址是:http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/。6. COG 蛋白质直系同源簇(COGs)数据库是对细菌、藻类和真核生物的21个完整基因组的编码蛋白,根据系统进化关系分类构建而成。COG库对于预测单个蛋白质的功能和整个新基因组中蛋白质的功能都很有用。利用COGNITOR程序,可以把某个蛋白质与所有COGs中的蛋白质进行比对,并把它归入适当的COG簇。COG库提供了对COG分类数据的检索和查询,基于Web的COGNITOR服务,系统进化模式的查询服务等。COG库的网址是:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG。下载COG库和COGNITOR程序在:ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/COG。
蛋白质数据库1.PIR和PSDPIR国际蛋白质序列数据库(PSD)是由蛋白质信息资源(PIR)、慕尼黑蛋白质序列信息中心(MIPS)和日本国际蛋白质序列数据库(JIPID)共同维护的国际上最大的公共蛋白质序列数据库。这是一个全面的、经过注释的、非冗余的蛋白质序列数据库,包含超过142,000条蛋白质序列(至99年9月),其中包括来自几十个完整基因组的蛋白质序列。所有序列数据都经过整理,超过99%的序列已按蛋白质家族分类,一半以上还按蛋白质超家族进行了分类。PSD的注释中还包括对许多序列、结构、基因组和文献数据库的交叉索引,以及数据库内部条目之间的索引,这些内部索引帮助用户在包括复合物、酶-底物相互作用、活化和调控级联和具有共同特征的条目之间方便的检索。每季度都发行一次完整的数据库,每周可以得到更新部分。PSD数据库有几个辅助数据库,如基于超家族的非冗余库等。PIR提供三类序列搜索服务:基于文本的交互式检索;标准的序列相似性搜索,包括BLAST、FASTA等;结合序列相似性、注释信息和蛋白质家族信息的高级搜索,包括按注释分类的相似性搜索、结构域搜索GeneFIND等。PIR和PSD的网址是:http://pir.georgetown.edu/。数据库下载地址是:ftp://nbrfa.georgetown.edu/pir/。2. SWISS-PROT SWISS-PROT是经过注释的蛋白质序列数据库,由欧洲生物信息学研究所(EBI)维护。数据库由蛋白质序列条目构成,每个条目包含蛋白质序列、引用文献信息、分类学信息、注释等,注释中包括蛋白质的功能、转录后修饰、特殊位点和区域、二级结构、四级结构、与其它序列的相似性、序列残缺与疾病的关系、序列变异体和冲突等信息。SWISS-PROT中尽可能减少了冗余序列,并与其它30多个数据建立了交叉引用,其中包括核酸序列库、蛋白质序列库和蛋白质结构库等。利用序列提取系统(SRS)可以方便地检索SWISS-PROT和其它EBI的数据库。SWISS-PROT只接受直接测序获得的蛋白质序列,序列提交可以在其Web页面上完成。SWISS-PROT的网址是:http://www.ebi.ac.uk/swissprot/。3. PROSITEPROSITE数据库收集了生物学有显著意义的蛋白质位点和序列模式,并能根据这些位点和模式快速和可靠地鉴别一个未知功能的蛋白质序列应该属于哪一个蛋白质家族。有的情况下,某个蛋白质与已知功能蛋白质的整体序列相似性很低,但由于功能的需要保留了与功能密切相关的序列模式,这样就可能通过PROSITE的搜索找到隐含的功能motif,因此是序列分析的有效工具。PROSITE中涉及的序列模式包括酶的催化位点、配体结合位点、与金属离子结合的残基、二硫键的半胱氨酸、与小分子或其它蛋白质结合的区域等;除了序列模式之外,PROSITE还包括由多序列比对构建的profile,能更敏感地发现序列与profile的相似性。PROSITE的主页上提供各种相关检索服务。PROSITE的网址是:http://www.expasy.ch/prosite/。4. PDB蛋白质数据仓库(PDB)是国际上唯一的生物大分子结构数据档案库,由美国Brookhaven国家实验室建立。PDB收集的数据来源于X光晶体衍射和核磁共振(NMR)的数据,经过整理和确认后存档而成。目前PDB数据库的维护由结构生物信息学研究合作组织(RCSB)负责。RCSB的主服务器和世界各地的镜像服务器提供数据库的检索和下载服务,以及关于PDB数据文件格式和其它文档的说明,PDB数据还可以从发行的光盘获得。使用Rasmol等软件可以在计算机上按PDB文件显示生物大分子的三维结构。RCSB的PDB数据库网址是:http://www.rcsb.org/pdb/。5. SCOP蛋白质结构分类(SCOP)数据库详细描述了已知的蛋白质结构之间的关系。分类基于若干层次:家族,描述相近的进化关系;超家族,描述远源的进化关系;折叠子(fold),描述空间几何结构的关系;折叠类,所有折叠子被归于全α、全β、α/β、α+β和多结构域等几个大类。SCOP还提供一个非冗余的ASTRAIL序列库,这个库通常被用来评估各种序列比对算法。此外,SCOP还提供一个PDB-ISL中介序列库,通过与这个库中序列的两两比对,可以找到与未知结构序列远缘的已知结构序列。SCOP的网址是:http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/。6. COG蛋白质直系同源簇(COGs)数据库是对细菌、藻类和真核生物的21个完整基因组的编码蛋白,根据系统进化关系分类构建而成。COG库对于预测单个蛋白质的功能和整个新基因组中蛋白质的功能都很有用。利用COGNITOR程序,可以把某个蛋白质与所有COGs中的蛋白质进行比对,并把它归入适当的COG簇。COG库提供了对COG分类数据的检索和查询,基于Web的COGNITOR服务,系统进化模式的查询服务等。蛋白质直系同源簇(COGs)数据库是对细菌、藻类和真核生物的21个完整基因组的编码蛋白,根据系统进化关系分类构建而成。COG库对于预测单个蛋白质的功能和整个新基因组中蛋白质的功能都很有用。利用COGNITOR程序,可以把某个蛋白质与所有COGs中的蛋白质进行比对,并把它归入适当的COG簇。COG库提供了对COG分类数据的检索和查询,基于Web的COGNITOR服务,系统进化模式的查询服务等。COG库的网址是:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG。下载COG库和COGNITOR程序在:ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/COG
利用人基因组测序产生信息的竞争正在开始。生物信息学是以基因组为基础的药物发现和开发成功的关键。随着基因组学应用的扩大,提供能帮助制药公司科学家分析基因组学产生的大量数据/资料的软件和数据库的公司数目也相应增加。生物信息学是一个新兴行业,只有为数不多的几家大公司和许多小公司在提供资料。现时,至少有20家药物发现公司开发了将基因知识转译为药物开发的工具和方法。在生物信息学领域领先的公司有Celera、Genomics、IncyteGenomi-cs和RosettaInpharmatics(后者将被Merck公司收购)。 生物信息业由从事用于分析、储存和组织生物学信息软件和硬件开发的公司组成。这些工具被用于鉴别药物靶的、发现药物、药物毒理学筛选、药物疗效筛选和药物基因组学。基因组测序技术创造了极其大量的信息,科学家需要处理这些信息的新方法。而生物信息学则是快速处理这些资料和收集有用信息的关键。此外,生物信息学可使科学家能跨越国界分享信息资源。基因组工具和技术通过提高R&D过程各步的效率来降低R&D成本。公司如能采取正确的战略决定并有效地加以实施,则可在它们的药物开发过程中节省3亿美元和2年时间。在总计8.8亿美元的药物开发成本中,75%是过程中失败的代价。减少失败的收益甚至超过提高成功机会所得。通过追寻在生物、化学和代谢信息中富含的疾病靶的和药物候选物,科学家和公司可以更精确地选择最有苗头并可能导致临床开发的先导化合物。据估计,在发现研究中,如能将10个药物靶的减少1个,则新药开发的成本可平均减少2亿美元。
褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片(ProteinChipâ Array)系统成功鉴定出了一些重要疾病(如肿瘤和危害性较大的传染病)新的、特异性的生物标记(biomarkers),后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱(SELDI-TOF-MS)相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1],作为基因功能的直接体现者-蛋白质,及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质,只把基因测出来还是不够的,还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此,有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制,人们设计了许多新的方法技术,如:二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等,这些方法在一些特定的情况下,虽然显示出了他们各自不同的优点,但是同样也存在着较大的局限性,难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析,因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术,在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台,成为本领域中优先关注的问题[16] .近来,美国Ciphergen(赛弗吉)公司研制的ProteinChipâ Array的仪器,并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱(surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra, SELDI-TOF-MS),已取得可喜的进展,筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志,不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择,而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成:蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池,不同的芯片表面上的化学物质不同,芯片表面分为两大类:一类为化学类表面,包括经典的色谱分析表面,如:结合普通蛋白质的正相表面,用于反相捕获的疏水表面,阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面;另一类称为生物类,特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列,可以用来研究传统的抗体一抗原反应,DNA和蛋白质作用,受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同,可以选用不同的芯片,或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后,经过一段时间的结合反应,用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子,再加上能量吸收分子(energy absorbing molelule,EAM)溶液,使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后,一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤,就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下,芯片上、下移动,使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上(focused laser beam,聚焦激光束).这样,每个区都含有丰富的,可寻址(addressable)的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发,就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同,计算检测到的不同时间,就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络(artifical neural network,ANN)的算法处理出现的成千上万的峰,鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子,使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处:SELDI-TOF-MS,他是在MALDI(matrix-assisted laser desorption/inionation)[21,22]基础上,改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质,或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说,可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去,因而出现的质峰非常一致,有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比:二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚,对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出;其次,二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质;而且,二维电泳耗时长,工作量大,对象染色转移等技术要求高,不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱,对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19],处理的信息量远远大于二维电泳;对于低丰度物质,即使浓度仅attomole(10-18)的分子,只要与表面探针结合,就可以检测到,这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说,需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术,再与另外的蛋白质反应,经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势:(1)可直接使用粗样本,如:血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能;(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子,而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱,可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展,验证基因组学方面的变化,基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下,基因启动何以与正常状态下不同,受到那些因素的影响,从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题:对于不同的样本,根据检测的目标采取或者设计几种芯片,理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获,但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS,仅能给出蛋白质的分子量,不能给出C端、N端的序列,也没法知道蛋白质的构型,因此需要将蛋白质充分纯化后,用蛋白酶消化芯片上的蛋白质,分析肽段,再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外,在国内,该芯片费用较高,分析质谱需要大量后续工作支持.
现在,在实验研究基础上,借助多方面的生物信息学方法,可以快速高通量的预测和进行蛋白质鉴定蛋白翻译后修饰。分泌蛋白和膜相关蛋白附着于细胞膜上的或将被排泄出去的蛋白质是由细胞内质网膜上附着的核糖体合成。附着有核糖体的内质网被称为糙面型内质网。这类蛋白质都含有一个N-末端(或氨基端),我们称之为信号序列或信号肽。这个信号肽通常情况下含有13-36个主要疏水性残基,同时它含有多蛋白复合物,我们称之为信号识别粒子(SRP)。这种信号肽在通过内质网膜之后会被去除。信号肽的去除过程是在信号肽酶催化作用下完成的。含有一个信号肽的蛋白质被称为前蛋白,有别于原蛋白。然而,某些用于分泌的蛋白在分泌之后会进一步被蛋白水解,因此包含有原蛋白的序列。这类蛋白质被称为前原蛋白。蛋白水解性裂解许多蛋白质在翻译之后会经历水解性裂解过程。其中最为简单的形式是去除起始蛋氨酸。许多蛋白质合成了不活跃的前体细胞,这些细胞只能在合适的生理条件下通过限制性蛋白水解过程产生活性。在凝血过程中使用到的胰腺酶和酶类就是后者的例证。多肽去除时产生活性的不活跃的前体蛋白,我们称之为原蛋白。前原蛋白的翻译后加工过程的一个复杂的例子就是脑垂体分泌合成的前阿黑皮素原的裂解过程(有关前阿黑皮素原的讨论,见肽类激素页)。这类前原蛋白经过复杂的裂解,根据合成的前阿黑皮素原的细胞定位而不同,其路径也有所不同。另一个前原蛋白的例子就是胰岛素。由于胰岛素是由胰腺分泌的,因此它有一个前肽。随着含24个氨基酸的信号肽的裂解,这类蛋白也折叠成了胰岛素原。胰岛素原进一步分裂,产生活跃的胰岛素,它包含两个肽链,由二硫键进行连接。但仍有其他的蛋白(酶类)被合成为非活跃的前体细胞,被称为酶原。酶原在蛋白水解性裂解时会产生活性,在凝血串联蛋白质链的若干蛋白质中都会发生这种现象。甲基化作用蛋白翻译后的甲基化过程主要发生在氮原子和氧原子上。活性甲基供体是活性腺苷甲硫胺酸(SAM)。最常见的甲基化作用发生在赖氨酸残基的ε-amine上。脱氧核糖核酸组蛋白中赖氨酸残基的甲基化作用可调节核染色质结构,因此可调节其转录活性。赖氨酸原本被认为是一种常设共价标记,可提供长期信号,甚至包括转录记忆时的组蛋白依赖机制。然而,最近的临床研究表明赖氨酸甲基化作用与其他共价修饰体相似,作用时间短,并能通过反脱甲基化活动进行动态调节。最近的组学研究发现表明,赖氨酸残基的甲基化作用不仅发生在核染色质层面,而且还通过修订转录因子影响基因表达。组氨酸的咪唑环,精氨酸的胍基部分以及谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组酰胺(R-group amides )上,都发现了额外的氮甲基化作用。谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组羧化物也会发生氧甲基化作用并形成甲基酯。蛋白可能在半胱氨酸的R[
蛋白质是生物体中含量最高,功能最重要的生物大分子,存在于所有生物细胞,约占细胞干质量的50%以上, 作为生命的物质基础之一,蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用,因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究,一直是化学家及生物学家极为关注的问题,其研究的内容主要包括分子量测定,氨基酸鉴定,蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展,仪器分析手段的更新,尤其是质谱分析技术的不断成熟,使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来,随着生命科学及生物技术的迅速发展,生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一,在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1.质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点:很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息,能最有效地与色谱联用,适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2.质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种:1)电喷雾电离质谱;2)基质辅助激光解吸电离质谱;3)快原子轰击质谱;4)离子喷雾电离质谱;5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中,以前面三种近年来研究得最多,应用得也最广泛[3]。 3.蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子,复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级,三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 3.1蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析,由于新的离子化技术的出现,如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化,各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是:通过电离源将蛋白质分子转化为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知蛋白质。 3.2蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能,建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等,这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法,又称PTH法),测序速度较慢(50个氨基酸残基/天);样品用量较大(nmol级或几十pmol级);对样品纯度要求很高;对于修饰氨基酸残基往往会错误识别,而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针,其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下,质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中,灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低,所以肽的序列分析比蛋白容易许多,许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation,ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization,MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善,极性肽分子的分析成为可能,检测限下降到fmol级别,可测定分子量范围则高达100000Da,目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具,也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库,能为解析FAST谱图提供极大的帮助,并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。
一个同学学生物信息学专业,毕业好长时间还没找到工作……他说除了学生物学的知识外,他们还学了好多计算机的知识,全国好像有这个专业的学校没有几个啊,为什么找工作这么难啊?各位大侠讨论一下生物信息学这个专业怎么样啊
为探究生物进程的分子机制,需要确定介导这个过程的蛋白质-蛋白质间的相互作用。研究蛋白质间相互作用的主要技术总结如下:一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中,人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能,丰富了酵母双杂交系统的功能。此外,酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列,当噬菌体生长时,表面就表达出相应的单抗,再将噬菌体过柱,柱上若含目的蛋白,就会与相应抗体特异性结合,这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用,不仅有高通量及简便的特点,还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前,用优化的噬菌体展示技术,已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库,并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。三、等离子共振技术表面等离子共振技术(SurfacePlasmonResonance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后,薄膜的共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料,反应过程可实时监控。测定快速且安全,还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移(FRET)广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白(GFP)的发展,FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法,仅需使用一组滤光片和测量一个比值,利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速,可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离,尤其适用于基于GFP的供体受体对。五、抗体与蛋白质阵列技术蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变,微型化,集成化,高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具,他也是芯片中发展最快的芯片,而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展,比如肿瘤标志物抗体芯片等,还有很多已经应用再眼就的各个领域里。六、免疫共沉淀技术免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术,其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA),若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”,因为SPA\|Pansobin比较大,这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物四组分又被分开。然后经Westernblotting法,用抗体检测目的蛋白是什么,是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的,符合体内实际情况,得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。七、pull-down技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见,最好通过免疫共沉淀(Co-IP)、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
质谱与蛋白质组学蛋白质组学对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析,而质谱是它的关键性分析工具。在过去的两年中,标准蛋白质组技术中的进展增进了更高水平自动化和敏感性的蛋白质识别技术。另外,新的技术促成了鉴定蛋白质功能相关特性的里程碑性的进展,包括它们的定量和在蛋白质复合物中复杂情况。缩写2DE two-dimensional gel electrophoresis双向凝胶电泳CID collision-induced dissociation碰撞诱导的解离ESI electrospray ionization电喷雾离子化FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里叶-变换离子回旋加速器共振ICAT isotope-coded affinity tagsIEF isoelectric focusing等电聚焦MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基质辅助的激光解析离子化Q-TOF quadrupole-TOFRP reversed phase反向TOF time-of-flight飞行时间简介蛋白质组学的核心组成是系统识别一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质,以及确定每个蛋白质的突出特征(比如,丰度、修饰状态以及在多蛋白质复合体中的复杂状态)。这些分析的技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的生物信息学。它的初步工具包括使用IEF(等电点聚焦)/SDS-PAGE凝胶的高分辨率的双向凝胶电泳(2DE),结合质谱和数据库搜索来分离、识别和定量在一个复合样本中存在的个体蛋白质,最终识别被分离的蛋白质。一个常用的方法用在Fig1中用图解说明。此技术以及由此而来的变化(综述见[1])已经被用来识别和分类在复杂样本中存在的大量蛋白质,并在蛋白质组数据库中呈现它们,该过程我们这里称之为"描述蛋白质组学"比如,Shevchenko等[2]从2D凝胶上系统地鉴定了150个蛋白质。数目庞大的这样的数据库现在可以找到。同样的技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应而在蛋白质组中的改变。因为检测动态改变需要精确定量每个被检测成分,我们使用"定量蛋白质组学"来定义。在此报告中,我们总结了自1999年1月至2000年4月来报道的与蛋白质组学和质谱相关的最重要的进展。在核心质谱技术中的进展已经导致2DE为基础的蛋白质组学技术的进一步改进。它们同时又促进了传统凝胶为基础的方法的替代方法,诸如引入以同位素稀释理论为基础的精确蛋白质定量技术和蛋白质复合物的系统分析。蛋白质组分析的MS技术进展在此部分,我们总结了在MS设备、它们的控制和操作中的进展,以及比较质谱数据和序列数据库识别蛋白质所用的搜索工具的进展。随着新型质谱仪的引入,蛋白质组学研究现存类型的质谱仪性能已经显著改进了。在此综述期间最普遍使用的仪器是可以分为两类:单一阶段的质谱仪和串联质谱为基础的系统。单一阶段的质谱仪,最显著的是基质辅助的激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)仪器,被用于无数通过肽质谱图谱技术大规模蛋白质识别的项目中。此方法在鉴别表达自小一些的和完全测序的基因组的蛋白质特别成功[3,4]。串联质谱仪器诸如triple quadrpole、离子捕获(ion-trap)和近来引进的混合quadrupole飞行时间(Q-TOF)被常规应用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS或用电喷雾电离(ESI)来生成肽片段离子谱,以便通过搜寻序列数据库进行蛋白质鉴定。使用仪器控制程序来自动选择肽离子进行碰撞诱导的解离(CID)(数据依赖CID)的不断增多是这些MS/MS仪器的一个明显的趋势。一些新的构造的具有高潜能的质谱仪被引入到蛋白质组学研究中产生深刻影响。两个研究组近来一个MALDI离子源和一个混合Q-TOF耦联了起来[5,6]。Q-TOF提供的质量准确性和敏感性提升了数据库搜寻结果并同时使它成为MS/MS从头测序的当然仪器选择。MALDI Q-TOF构造提供了激动人心的机会进行自动化和高通量应用以及在一个样品盘上存档样品进行日后研究的可能。Medzihradszky等[7]描述了一个不同的混合仪器称之为MALDI TOF TOF。此设备享有许多MALDI Q-TOF的优点,另外能够进行高能量CID和非常快速的扫描速率。傅里叶-变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱对于蛋白质组学来说相对陌生。这些设备具有非常高的敏感性和分辨率,质量精确性可以达到1ppm。这些特征被用来在一次分析中测量和定量几百种蛋白质的完整的分子质量[8]。Goodlett等[9]表明FT-MS测量的一个肽的准确质量以及可以容易获得的限制因素能够通过序列数据库搜索被用来识别蛋白质。蛋白质组学如果没有软件工具来进行质谱数据和序列数据库的关联将变得几无可能。现存的数据库搜索程序已经变得越来越成熟和可以(从网络)可获得。另外,引入了新的算法。主要相关程序是Sequest[10],MASCOT[11],PeptedeSearch[12],PROWL[13]和Protein Prospector[14]。在它们中间,Sequest使用CID谱设置了蛋白质识别的实验室标准(benchmark),因为它与边界MS/MS数据工作得最好,并高度可信,可以从整个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS实验中自动分析数据,并不需要任何使用者的破译工作。在所提的程序中,然而,只有Sequest不能在网络上搜索。MASCOT是一个新的、快速、网络可进入和多功能的程序,具有进行肽指纹分析、用部分破译或未破译的CID谱进行数据库搜索的功能。
一、 前言基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道,也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等,因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合,将会在后基因组研究中发挥重要作用。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点,第一向在pH梯度胶内等电聚焦,然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展,生物质谱当上了主角,蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF,其分析容量大,单电荷为主的测定分子量高达30万,干扰因素少,适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术,并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。二、 生物质谱技术1.电喷雾质谱技术(ESI)电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。2.基质辅助激光解吸附质谱技术(MOLDI)基质辅助激光解析电离(MOLDI)是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上,经加热或风吹烘干形成共结晶,放入离子源内。当激光照射到靶点上时,基体吸收了激光的能力跃迁到激发态,导致蛋白质电离和汽化,电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内,再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配,因为二者都是脉冲工作方式,在质量分析过程中离子损失很少,可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单,容易换算,蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比,因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的m/z值。与传统质量分析器相比,更易得到高分辨率和高测量精度;速度快,离子飞行时间仅为几个μs和约100μs之间;质量范围宽,可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景的质量分析器。3.傅立叶变换-离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(FT-ICR MS)是离子回旋共振波谱法与现代计算机技术相结合的产物。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法是基于离子在均匀磁场中的回旋运动, 离子的回旋频率、半径、速度和能量是离子质量和离子电荷及磁场强度的函数, 当对离子施加与其回旋频率相同的射频场作用时, 离子将同相位加速到一较大的半径回旋, 从而产生可被接受的类似电流的信号。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法所采用的射频范围覆盖了欲测定的质量范围,所有离子同时被激发, 所检测的信号经过傅立叶变换, 转换为质谱图。其主要优点有:容易获得高分辨;便于实现串极质谱分析;便于使用外电离源并与色谱仪器联用。此外,他还有灵敏度高,质量范围宽,速度快,性能可靠等优点。4.快原子轰击质谱技术(FABMS)快原子轰击质谱技术( Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry , FABMS) 是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS -MS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。三、蛋白质的分析鉴定随着质谱技术的发展,分子量的测定已从传统的有机小分子扩展到了生物大分子。MALDI-MS技术以其极高的灵敏度、精确度在蛋白质分析中得到了广泛的应用。该技术不仅可测定各种疏水性、亲水性和糖蛋白的分子量,还可直接测定蛋白质混合物的分子量。这可认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一,除了用于多肽,蛋白质的分子量测定外,还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较,判断出所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列,不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。对肽序列的测定往往要应用串连质谱技术,采用不同的技术选择特定质核比的离子,并对其进行碰撞诱导解离,通过分析肽段的断裂情况推导出肽序列。四、后转录修饰的蛋白质的检测和识别在蛋白质组的研究中,蛋白质和多肽的序列分析已不局限于阐明蛋白质的一级结构,对翻译后的修饰的进一步分析也是蛋白质化学的一项重要任务。这种修饰对于蛋白质的功能非常重要,如:细胞识别中的蛋白质相互作用,信号传导和蛋白质定位。1. 蛋白质的糖基化糖蛋白在细胞内部,细胞膜和细胞外均有发现,实际上大部分蛋白质是糖蛋白。对糖蛋白的检测和分析发现,糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的,而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期,细胞分化和发展的状态有关。在蛋白组时代中,蛋白质的修饰会引起其理化性质的改变,因此是不容忽视的。从1D或2D凝胶得到的糖基化蛋白的识别,一般是进行MALDI-MS指纹分析, 或是对MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片谱进行分析。对完整的糖蛋白的研究是非常困难的,所有已知的离子化技术都有其局限性。目前,人们主要研究糖肽,其好处之一就是质量减小了,这就会得到更好的分辨率,而且糖肽仍保留了糖基化位点。将分离的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可进行糖肽的研究。一旦糖肽被识别出,就可以用串连质谱(ESI-MS/MS)来阐明肽序列。当蛋白的序列已知时,计算质量差就可推出其上附着的寡糖的质量。要将糖部分从糖蛋白中释放出来,可用化学切割或酶切割(流程图见图1)。目前,连有结构专一性糖苷酶的质谱在提供序列,分支和链接数据方面是最有力的技术。对于N糖基化常用的糖苷内切酶有PNGase-F, PNGase-A, EndoF和EndoH。化学切割也可以用来释放O-连接和N-连接的多糖,但经常出现的缺点是他会完全破坏所有的肽键,因而丢失了关于糖附着位点的信息。而且这些切割不能从糖肽中连续释放单糖。用肼的化学切割可以除去两种类型的糖基化。在60℃可专一性的释放O-连接的糖,而在95℃能释放N-连接的糖。释放O-原子更常用的方法是用碱进行β消除。通常,糖基中加入金属离子在MALDI和ESI中离子化。用MALDI-MS分析糖类的一个好的选择是将之与其他一些化合物混合,这样可以进一步提高灵敏度和分辨率。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离 (CID)谱,这可以给出有关糖的序列,分支及糖间的连接等信息。2. 蛋白质的磷酸化蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起重要的作用。磷酸化经常作为分子开关控制不同过程蛋白质的活性,如新陈代谢,信号传导,细胞分裂等过程。因此,蛋白质中磷酰氨基酸的识别在蛋白质分析中是一项重要的工作。已知的磷酰氨基酸的类型有四种:1.O-磷酸盐,通过羟氨酸的磷酸化形成的,如丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸。2.N-磷酸盐,通过精氨酸,赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。3.乙酰磷酸盐,通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。4.S-磷酸酯,通过半胱氨酸的磷酸化形成的。
新技术可揭示蛋白间相互作用 为膜蛋白研究提供了有力工具 科技日报多伦多3月28日电 (记者冯卫东)据最新一期《自然·方法学》杂志网络版报道,加拿大多伦多大学研究人员开发出一种研究人体蛋白质的新技术。该技术可追踪膜蛋白与其他蛋白之间的相互作用。 膜蛋白占人体所有蛋白的约三分之一,有500多种疾病与其失能相关。膜蛋白的研究难点在于,要了解其作用,必须基于对其与其他蛋白相互作用的观察。 多伦多大学细胞与生物分子研究中心教授伊戈尔·斯坦戈利亚称,新技术为检视人体细胞自然环境中的膜蛋白提供了新工具。其灵敏度足以检测到引入药物的微量变化,因此对癌症及神经疾病治疗方法的研发具有重要意义。 研究人员采用了一种被称为MaMTH(哺乳动物膜双杂交法)的新技术,来确定CRKII蛋白在最常见肺癌——非小细胞肺癌中的作用。CRKII蛋白可与表皮生长因子受体蛋白相互作用,而表皮生长因子受体的基因突变可导致癌细胞的增殖。 研究报告的主要作者、多伦多大学博士后研究员茱莉亚·佩斯奇尼格称,CRKII最有可能调控突变表皮生长因子受体的稳定性,并通过促进癌细胞间的信令传递或通信来推动肿瘤生长。研究发现,可抑制这些突变受体和CRKII的一种组合化疗法或对肺癌治疗大有助益。 此项研究汇聚了多伦多和波士顿地区的5个实验室的研究人员及癌症临床医师、生物信息学家。佩斯奇尼格及其实验室历时4年对适用于酵母的蛋白—蛋白相互作用的类似技术进行了改进,从而开发出新的MaMTH技术。研究人员下一步将对其他人体疾病中的突变蛋白进行研究。来源:中国科技网-科技日报 2014年03月31日
蛋白质组学研究--生物质谱技术 对分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质组研究的重要内容,蛋白质微量测序、氨基酸组成分析等传统的蛋白质鉴定技术不能满足高通量和高效率的要求,生物质谱技术是蛋白质组学的另一支撑技术。 生物质谱技术在离子化方法上主要有两种软电离技术,即基质辅助激光解吸电离(matrix—assisted laser desorption/ionization,MALDl)和电喷雾电离(electrospray ionization,ESl)。MALDI是在激光脉冲的激发下,使样品从基质晶体中挥发并离子化。ESI使分析物从溶液相中电离,适合与液相分离手段(如液相色谱和毛细管电泳)联用。MALDI适于分析简单的肽混合物,而液相色谱与ESI—MS的联用(LC—MS)适合复杂样品的分析。 软电离技术的出现拓展了质谱的应用空间,而质量分析器的改善也推动了质谱仪技术的发展。生物质谱的质量分析器主要有4种:离子阱(iontrap,IT)、飞行时间(TOF)、四极杆(quadrupole)和傅立叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR)。它们的结构和性能各不相同,每一种都有自己的长处与不足。它们可以单独使用,也可以互相组合形成功能更强大的仪器。 离子阱质谱灵敏度较高,性能稳定,具备多级质谱能力,因此被广泛应用于蛋白质组学研究,不足之处是质量精度较低。与离子阱相似,傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱也是一种可以“捕获”离子的仪器,但是其腔体内部为高真空和高磁场环境,具有高灵敏度、宽动态范围、高分辨率和质量精度(质量准确度可很容易地小于1mg/L),这使得它可以在一次分析中对数百个完整蛋白质分子进行质量测定和定量。FTICR—MS的一个重要功能是多元串级质谱,与通常的只能选一个母离子的串级质谱方式不同,FTICR—MS可以同时选择几个母离子进行解离,这无疑可以大大增加蛋白质鉴定工作的通量。但是它的缺点也很明显,操作复杂、肽段断裂效率低、价格昂贵等,这些缺点限制了它在蛋白质组学中的广泛应用。MALDI通常与TOF质量分析器联用分析肽段的精确质量,而ESI常与离子阱或三级四极杆质谱联用,通过碰撞诱导解离(collision—induceddissociation,CID)获取肽段的碎片信息。 1. MALDI—TOF—MS (1)MALDI—TOF—MS的技术特点:①具有分离、鉴定双重功能,可用于混合物的分析;②测量范围宽,相对分子质量可达300 000;③精度高,蛋白质相对分子质量测定精度可达0.01%;④灵敏度高,所需样品量少,可达fmol级;⑤分析时间短,5~10rain可完成一次分析;⑥样品制备简便,操作易自动化;⑦对样品要求低,能忍耐较高浓度的盐、缓冲剂和非挥发性杂质,所以特别适合于鉴定二维凝胶电泳分离的蛋白质。 (2)MALDI—TOF—MS的技术改进:近年来MALDI—TOF—MS又有许多新的技术改进,以提高其检测灵敏性和准确度,增强其蛋白质鉴定的功能。如将MALDI离子源与四极杆—飞行时间—串联质谱对接,实现了同一样品在同一质谱仪上的肽指纹图谱与肽序列标签分析同时进行,提高于蛋白质鉴定的速度和准确性。还有MALDI—TOF—TOF—MS等。但这些技术共同的缺点是仪器非常昂贵。 (3)MALDI—TOF—MS的发展方向:①寻求新的基质(如混合基质、室温离子化液体等)和新的制样方法(如超微量进样,n1级);②将新技术应用在分析中(如酶切技术、毫微升溶剂提取技术等);③对质谱仪进行改进或与其他分析仪器联用,如MALDI与傅立叶转换离子回旋共振质谱(MALDI—FTMS)联用能得到更多的蛋白结构信息;④小型化、智能化、简易化及自动化已成为趋势。 2.ESI (1)ESI的优势:①检测范围宽,生物大分子经电喷雾后质荷比大大下降,因而可测相对分子质量高达十几万甚至更高的生物样品;②分辨率和灵敏度高,可达10-15—10-12mol;③不需要特定基质,避免子基质峰的干扰;④适用于结构分析,可分析生物大分子的构象及非共价相互作用,与串联质谱结合可分析蛋白质、多肽的一级结构和共价修饰位点等;⑤自动化程度高,可与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段在线联用;⑥MALDI是脉冲式离子化技术,而ESI是连续离子化技术,检测所需时间更短;⑦ESI常和四极杆质谱联用,仪器价格相对便宜。 (2)ESI的局限性:①对样品中的盐类耐受性差;②对混合物图谱的解析较复杂;③受溶剂的影响和限制很大。目前ESI主要用于亲水生物大分子的分析,较少用于疏水生物样品的分析。总体来说,MALDI和ESI各有长处,有各自的适用范围,是两种互补的技术。 (3)ESI的技术发展:近年来,ESI也有许多新的技术发展。液相色谱与电喷雾质谱连用(LC—ESI—
向大家请教几个问题1. 在使用MALDI-TOF的时候,为什么大分子量的蛋白质可以被有效分析,而大于80bp的DNA分析的效果不好?2. Electrospray-TOF和MALDI-TOF在分析蛋白质的时候有那些区别?3. 质谱用于蛋白质测序中的几种方法及原理?先道谢!本人对蛋白质分析实在是不熟悉。请解答的详细一些!再次致谢!
2003年人类基因组精细图绘制完成,是人类科学史上一个里程碑式的事件。后基因组时代的研究重点自然落在了蛋白质头上。为啥?因为中心法则告诉我们,基因的产物——蛋白质,是生命活动的最终执行者。与基因组类比,研究生物体内全套蛋白质的科学,就是蛋白质组学。基因组计划完成的同年,人类蛋白质组计划启动,令人激动的是,2014年人类蛋白质组的草图也完成了。而蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。质谱的应用范围非常广泛,但这里只讨论蛋白质组学中的质谱。简单地说,质谱法(mass spectrometry)就是对肽段离子的重量(质荷比,m/z)进行测量的分析方法。样品经质谱仪(mass spectrometer)检测得到质谱图(mass spectrum),通过对质谱图的分析就可以对样品中的蛋白进行鉴定、定量。亲,图1的这种典型的蛋白质组学流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特异性的酶(通常为Trypsin)切割为肽段,再进行后续分析,这在蛋白质组学中被称为“自下而上”的研究策略(Bottom-up proteomics)。我们平时见到的质谱分析基本都是这种类型。提到蛋白质组,即会联想到一系列高大上的名词,iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆,下面我们就来理理清楚。图1. 典型的蛋白质组学流程大体上,质谱研究蛋白主要是鉴定和定量。通过二级质谱图(MS2或者MS/MS)进行数据库搜索匹配鉴定蛋白。通过各种标记或非标记的手段对不同样品中的蛋白进行比较就是定量。蛋白定量比较是质谱最重要的用途,图2是对定量方法的一个简单总结。非标定量(Label-free)不需要标记,不同样品分别处理、分别进质谱检测;优点是处理简单、无需标记、价格便宜、可以比较很多组样品,缺点是对操作步骤、LC、质谱稳定性要求严格。SILAC是在细胞培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸,在代谢水平标记蛋白,一级质谱图进行定量,可以做到三组样品混合后进行比较,定量准确,但是不能标记组织样本,养细胞成本也较贵。双甲基化标记是通过化学反应的办法在肽段水平进行标记,一级质谱定量,也可以三组对比,标记试剂都比较便宜,而且可以标记任何来源的样品。iTRAQ和TMT是商品化的试剂盒,肽段水平标记,二级质谱定量;分别可以做到最多8组和10组样品间蛋白质组的比较。图2. 质谱定量方法以上这几个是一家的,还有几个名词是属于另外一家,比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。质谱进行数据采集的方式大致分为三种:鸟枪法(Shotgun)、选择反应监控(SRM)和全景式的SWATH/DIA。下面对照图3再来简单介绍一下。图3. 质谱扫描方式DDA、IDA、Shotgun和鸟枪法说的是相同的东西,意思是质谱在每个循环的中从一级里挑选丰度高的TopN个肽段去打碎做二级扫描,得到的结果通过与已知数据库中的理论蛋白进行匹配。DDA简单有效,分析流程比较成熟,也是目前质谱分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷,即具有一定的随机性,偏向于检测丰度较高的肽段,而抑制了低丰度肽段的检测。靶向策略被称为质谱领域的Western blot。质谱只去采集目标肽段大小的离子信息,因而提高了灵敏度和特异性。这种方法用来研究感兴趣的特定蛋白,定量准确,但是通量很有限。SWATH/DIA这种全景式的数据采集方式在最近几年突然火了起来,被认为在不远的未来可能会取代DDA的主流位置。该方法采取的策略是将扫描范围内的所有肽段按照质荷比分为若干个窗口,再对每个窗口里所有的肽段一起打碎,采二级,数据分析时通过抽提蛋白的子离子信息进行定量。SWATH/DIA解决了DDA中随机性选择肽段的缺陷,所以重复性更好,定量的准确性基本达到了SRM的水平,而且可以实现大规模定量。借用听来的一个比喻来说明:DDA就像机关枪扫射,数量多、体积大的目标命中的概率要大一些。靶向扫描(SRM或PRM)就像精准狙击,排除干扰,目标明确,每一枪直指目标,但是难以大规模消灭敌人。SWATH/DIA就是地毯式轰炸,只要暴露在我方攻击范围内的敌人,不管三七二十一,全部炸完。图4. 定量方法与采集方式结合如果将上述的定量方法(图2)和质谱数据采集方式(图3)结合起来,就得到了现在基于质谱的蛋白质组学研究的各种策略(图4)。再打个比方,保证吃货们一听就懂:鸡、鱼、肉、蛋、蔬菜要通过炒锅、烤箱、高压锅、微波炉等烹调之后才能变为美食,填饱肚子。同样的,各种定量方法(非标的和标记的)处理的样品,要通过质谱各种采集方式变为电脑中的数据,才能分析并从中得到蛋白的信息。本次的介绍就先到这里了,如果其中有什么问题,欢迎您批评和建议,我们会努力变得更好;如果需要跟我们进行技术交流和讨论,欢迎大家联系武汉金开瑞。后续我们还会继续推出对质谱技术各方面进行解析的文章,敬请期待。ReferencesA draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)
一、 前言基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道,也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等,因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合,将会在后基因组研究中发挥重要作用。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点,第一向在pH梯度胶内等电聚焦,然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展,生物质谱当上了主角,蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF,其分析容量大,单电荷为主的测定分子量高达30万,干扰因素少,适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术,并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。此贴与http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20081130/1613156/重复,请版友在发帖前先搜索一下,以免重复发帖,谢谢!
[font=Arial, 'Microsoft Yahei'][size=16px] 蛋白质组学是近年医药和生命科学领域研究的热点之一。蛋白质组学的含义是一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白。蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析,通过对某种物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质(包括表达水平、结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用等)的研究,对蛋白质所执行的生理性、病理性生命活动做出最精细、最准确、最本质的阐述。 中药治疗的蛋白质组学研究的基本研究思路是,首先造模,确定造模成功后提取总蛋白质,2-DE 电泳技术分离总蛋白建立蛋白质组图谱,用图像分析软件寻找模型组、对照组及中药治疗组各组间差异蛋白点,MALDI-TOF/MS 分析差异蛋白点,并结合蛋白质生物信息库,初步鉴定差异蛋白质。在此方面国内学者进行了一些探索,有学者研究了单体人参皂苷对人肺巨细胞癌高转移细胞株蛋白质组的表达的影响,还有报道研究松果菊苷对小鼠帕金森病模型黑质纹状体组织蛋白表达的影响,再如研究中药复方强骨宝1号对去卵巢骨质疏松大鼠皮质骨蛋白质组表达的影响等。以上研究结果找到一些差异蛋白,为中药作用机制的研究提供了依据。[/size] [/font]
最近做蛋白质分析,用的是AB的Qtrap 5500.方法设置如下:EMSIDAEPI得到的谱图有多个峰,我想如何得到我蛋白质的二级谱图。
基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然,不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理,不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者,因此对蛋白质结构,定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。生命科学是实验科学,因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异,而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。在蛋白质组研究中,二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同,对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。蛋白质组学的研究内容包括:1.蛋白质鉴定:可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术,利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。2.翻译后修饰:很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化,糖基化,酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式,因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。3.蛋白质功能确定:如分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。4.对人类而言,蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康,主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质,而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。在基础医学和疾病机理研究中,了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子,进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的,因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的,但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型,因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备,结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线,可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线,其研究结论值得怀疑,因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起,最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞,但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境,因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离,分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究,包括mRNA和蛋白质的表达。LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白,或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同,可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品,然后在同样条件下进行二维电泳,染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记,然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离,最后通过荧光扫描技术分析结果。胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像,然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析,并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统,可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化,酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面(MALDI-TOF)。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析,从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆,尿液,脑脊液,乳腺,心脏,膀胱癌和磷状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来,研究者可以登录www.expasy.ch/www/tools.html等网站进行查询,并和自己的同类研究进行对比分析。Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具,包括二维电泳系统,成像系统及分析软件,胶切割系统,蛋白质消化浓缩工作站,点样工作站等;同时还可以提供相关试剂和消耗品。LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线,除此以外,LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型,制备细胞蛋白质样品,蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交,从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片,可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂,包括蛋白质制备试剂,蛋白质的荧光染料标记试剂,标记体系的纯化试剂,杂交试剂等。对于蛋白质相互作用的研究,酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。关于蛋白质组的研究,也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片,这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究,蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。Science,Vol.293,Issue 5537,2101-2105,September 14,2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为:将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片,然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。最后有必要指出的是,传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质,而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求,蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统,通量高而速度快,配合相应分析软件和数据库,研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。
一、 前言[1,2]基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道,也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等,因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合,将会在后基因组研究中发挥重要作用。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点,第一向在pH梯度胶内等电聚焦,然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展,生物质谱当上了主角,蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF,其分析容量大,单电荷为主的测定分子量高达30万,干扰因素少,适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术,并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。
http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378379551.jpg 氨基酸是蛋白质的基础组成单位,通过研究蛋白质中氨基酸的性质和组成来预测蛋白质的结构和功能,蛋白质氨基酸残基组成分析主要是通过氨基酸分析仪来完成的,本文推荐了2个基于氨基酸组成进行蛋白质预测软件。基于氨基酸组成的蛋白质预测软件根据组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质可以辨析电泳等实验中的未知蛋白质,也可以分析已知蛋白质的物化性质。ExPASy工具包包涵的程序:AACompIdent:与把氨基酸序列在SWISS-PROT库中搜索不同,AACompIdent工具利用未知蛋白的氨基酸组成去确认具有相同组成的已知蛋白。该程序分析时需提交的相关信息包括:蛋白质的氨基酸组成、等电点pI和分子量(如果知道)、正确的物种分类及特别的关键词。此外,用户还需在六种氨基酸“组合”中作出选择,这影响到分析如何进行。例如,某种“组合”会把残基Asp/Asn(D/N)和Gln/Glu(Q/E)组合成 Asx(B)和Glx(Z);或者某种残基会在分析中被完全除去。对数据库中的每一个蛋白序列,算法会对其氨基酸组成与所查询的氨基酸组成的差异打分。由电子邮件返回的结果被组织成三级列表:第一张列表中的蛋白都基于特定的物种分类而不考虑pI和分子量;第二张列表包含了不考虑物种分类、pI和分子量的全体蛋白;第三张列表中的蛋白不但基于特定物种分类,并且将 pI和分子量也考虑在内。虽然计算所得结果各不相同,但零分表明了该序列与提出的组成完全相符。AACompSim:AACompIdent的一个变种,AACompSim提供类似的分析,但与前者以实验所得的氨基酸组成为依据进行搜索不同,后者使用SWISS-PROT中的序列为依据。有报道称,氨基酸组成在物种之间是十分保守的(Cordwell等,1995),并且通过分析氨基酸的组成,研究者能从低于25%序列相似性的蛋白之间发现弱相似性(Hobohm和Sander,1995)。因此,在“传统的”数据库搜索基础上辅以组成分析,能为蛋白质之间关系提供更多见解。PROSEARCH:PROPSEARCH也提供基于氨基酸组成的蛋白质辨识功能。用144种不同的物化性质来分析蛋白质,包括分子量、巨大残基的含量、平均疏水性、平均电荷等,把查询序列的这些属性构成的“查询向量”与SWISS-PROT和PIR中预先计算好的各个已知蛋白质的属性向量进行比较。这个工具能有效的发现同一蛋白质家族的成员。可以通过Web使用这个工具,用户只需输入查询序列本身。分子量搜索(MOWSE)分子量搜索(MolecularWeightSearch,MOWSE)算法利用了通过质谱(MS)技术获得的信息。利用完整蛋白质的分子量及其被特定蛋白酶消化后产物的分子量,一种未知蛋白质能被准确无误地确认,给出由若干实验才能决定的结果。由于未知蛋白无需再全部或部分测序,这一方法显著地减少了实验时间。MOWSE的输入是一个纯文本文件,包含一张实验测定的肽段列表,分子量范围在0.7到4.0Kda之间。计算过程基于在OWL非冗余蛋白质序列库中包含的信息。打分基于在一定分子量范围内蛋白中一个片段分子量出现的次数。输出的结果是得分最佳的30个蛋白的列表,包括它们在OWL中的条目名称、相符肽段序列、和其它统计信息。模拟研究得出在使用5个或更少输入肽段分子量时,准确率为99%。该搜索服务可通过向mowse@daresburg.ac.uk发送电子邮件实现。为获得更多关于查询格式的细节信息,可以相该地址发送电子邮件,并在消息正文中写上“help”这个词。蛋白质氨基酸组成分析用盐酸在110 ℃将蛋白或多肽水解成游离的氨基酸,用氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量。采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法,对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通HPLC相似,但针对氨基酸分析进行了细节优化(例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等)通常细分为两种系统:蛋白水解分析系统(钠盐系统)和游离氨基酸分析系统(锂盐系统),利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸,速度较快,基线平直度好;锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸,速度较慢,基线一般不如钠盐系统好。分析效果:从目前已知的氨基酸分析方法比较来看,除灵敏度(即最低检测限)比HPLC柱前衍生方法稍低以外(HPLC:0.5 pmol;氨基酸分析仪:10 pmol),其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面,都优于其他分析方法。蛋白质氨基酸残基组成分析的主要步骤包括:首先是蛋白被水解为氨基酸,其次是采用离子色谱等方法进行游离的氨基酸含量和组成的分析。总之利用蛋白可以分析氨基酸,利用氨基酸也可以研究蛋白质。
一、 前言 基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道,也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等,因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合,将会在后基因组研究中发挥重要作用。 目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点,第一向在pH梯度胶内等电聚焦,然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展,生物质谱当上了主角,蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF,其分析容量大,单电荷为主的测定分子量高达30万,干扰因素少,适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的 LC-MS联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术,并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。 二、 生物质谱技术 1.电喷雾质谱技术(ESI) 电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。本帖与http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20081130/1613156/重复,故锁帖!请版友在发帖前先搜索一下,以免出现重复贴。谢谢!斑竹您给的重复贴链接有误,并且我写贴前已经搜索了标题。SORRY,请LZ检索一下这个网址,开始那个是弄错了。
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自80年代以来一系列新的软电离技术如快原子轰击电离 、基质辅助激光解吸电离 、电喷雾电离等发现后,生物质谱技术迅速发展,已成为现代科学研究前沿的热点之一。而其中又以基质辅助激光解吸质谱(MALD I2MS)和电喷雾电离质谱(ESI2MS)应用最为广泛。基质辅助激光解吸质谱灵敏度高、可操作性强且对生物样品中的无机盐和缓冲溶液具有较好包容性;电喷雾电离质谱选择性好、分析质量范围宽、样品消耗量小、易于与各种色谱联用。在生物样品的处理中常常需要用到非挥发性的盐,用于为细胞营造无毒的环境,稳定溶剂化的样品及维持酶的活性等。此外,许多用于分离生物分子的分离方法也需要高浓度的盐和缓冲溶液 。但是,样品处理及分离过程中所用的NaCl、十二烷基磺酸钠、盐酸胍、尿素、甘油、二甲基亚砜等都会影响后续质谱高灵敏的分析 。因为这些不挥发的低分子量污染物会导致复杂加合物的形成,增加噪音及造成明显的信号抑制 。此外,在复杂的组织或细胞蛋白质组中,与疾病和信号传导相关的蛋白质往往是属于低丰度的蛋白质,这些重要的蛋白质由于本身存在的量极少而很难得以有效鉴定 。因此,对蛋白质/多肽样品的预富集处理将是MALD I2MS或ESI2MS得到高质量质谱图的前提,也是成功鉴定蛋白质的关键。该文献主要侧重于相关工作的概述。