层析实验冷柜专为生化层析实验而研制的特殊用途冷柜,也可用于其他需要低温环境的实验,或用于物品冷藏。主要特点:进口制冷压缩机,工作可靠,噪音低;风冷散热方式,不需水冷却;可选多功能型配置,三层可调开放式钢架;不作层析实验亦可用于样品冷藏保存,一柜多用; 柜内空间高大,便于层析操作; 全透视双层玻璃门,具防露功能,双门锁扣可独立开启;全不锈钢内壁,清洁卫生,美观耐腐蚀; 2根层析固定立柱,2层(YC-2为3层)开放式载重托板;自带照明灯,消毒灯,上下内电源插座; 内胆全部采用优质不锈钢材料;全新改进型智能温控仪表,温度设定、测量均为数显,且设定值可加密码锁定保护;自带超温、差温报警功能 ;下设脚轮,移动方便;
层析柜原理、应用和主要硬件指标性能一、层析柜层析柜是专为生化层析实验而研制的特殊用途低温柜,也可用于其他需要低温环境的实验,或用于物品冷藏。经过科学设计,冷柜总高度一般不超过2米,便于进出房间和电梯。二、层析柜用途主要用在生命科学研究的高校学科和科研院所,主要用来进行各种酶类,肽类,大分子,核酸等物质的生化层析分析试验。也可用于其他需要低温环境的实验,或用于物品冷藏。专门为对温度要求很高的各种应用设计,可以在箱内操作层析设备和其它简易安装的仪器和设备。三、层析柜硬件构成1、制冷系统标准的制冷系统由压缩机、冷凝器、蒸发器、膨胀阀、电磁阀等组成。用管道依次将这些设备连接,形成一个封闭式系统。系统工作时,压缩机将蒸发器所产生的低温低压制冷剂蒸气吸入汽缸内,经压缩机压缩,压力升高(温度也升高)到稍大于冷凝器内的压力时,将其汽缸内的高压制冷制蒸气排到冷凝器中。(所以压缩机起着压缩与输送制冷剂作用)在冷凝内高温高压的制冷剂蒸气与温度较低的空气(或常温水)进行热交换而冷凝为液态制冷剂,这时液态制冷剂经过膨胀阀降温(降压)后入蒸发器,在蒸发器内吸收被冷却物体的热量后在汽化。这样被冷却物体便得到冷却而制冷剂蒸气又被压缩机吸走,因此在制冷系统中经过压缩、冷凝、膨胀、蒸发四个过程完成一个循环。制冷系统原理如下图所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408140927_510241_1705095_3.jpg2、温控系统温控系统的核心部件是温度传感器,温度传感器对环境温度自动进行采样、即时监控,当环境温度高于控制设定值时控制电路启动,可以设置控制回差。如温度还在升,当升到设定的超限报警温度点时,启动超限报警功能。当被控制的温度不能得到有效的控制时,为了防止设备的毁坏还可以通过跳闸的功能来停止设备继续运行。温控系统在层析柜里面是重要的硬件,主要要看传感器的灵敏度、数量和分布,温控性能也要关注,一般来说,温控范围、温控精度等参数是有温控器来决定的,和层析柜的关系不大,有的温控系统能控制的温度范围很宽,但实际温控需要根据层析柜本身的制冷系统来决定;温控均一性也需要和层析柜结合起来才有好的效果。3、风道设计层析柜内部的风道设计是生产商最容易忽略的部分,而风道设计是否合理直接影响到层析柜的温度稳定性和均一性,直接影响到整体使用效果。层析柜内部的设计应考虑到冷风和热风的比重差别,应用风扇的主动送风,在整个柜体里面形成主动均匀的空气流;这里面还需要考虑是否会形成短程的空气循环、开门时对柜体气流的影响应降到最小、风扇的送风能力的设计等等因素。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408140927_510242_1705095_3.jpg层析柜内部空气流动图4、层析柜配件多功能的层析柜一般能在满足层析实验要求的情况下兼顾到药品保存的需求,以提高层析柜的使用效率,所以首先应配置固定层析柱的立柱和夹子,其次需要配置放置仪器设备的搁板(能有一定的承重能力),另外还需配置内部电源,一般应为防水防漏电的插座;药品保存功能则需配置相应数量的搁物架,而且要求能和层析用的搁板进行更换,层析所使用的立柱和夹子应能拆除或不影响药品保存搁物架的放置。四、层析柜主要性能指标层析柜说到底是一种低温柜,核心的功能是提供低温的环境,所以温度性能方面的指标是最重要的指标,例如:温度均一性、温度稳定性、温控精度;当然,温度性能方面的指标是最终的表现,它的好坏是有硬件性能和设计来保障的,例如:压缩机性能、风机性能、整个制冷系统的设计、柜体的厚度、发泡的质量、柜体内部的设计、风道设计等等。综合来说,压缩机性能、内部风道设计、温度均一性几个性能指标应强烈关注。其中压缩机的品质保障了制冷系统的性能及其稳定性;内部风道设计可保障柜体内部的合理冷气流,使温控系统能达到最好的控制效果;温度均一性则是整个柜体的综合性能的集中表现。
有没有人知道哪有圆柱形的层析缸卖啊?采购的人说厂家都不做了。我做纸层析,展开距离要很长。不知道你们都用什么展开缸的。或者有没有好的方法推荐。拜托各位了。[em06]
据分析 可能是板子质量不好 展开前,已经充分饱和 在操作上 有什么需要注意的么? 或者 有谁能给推荐一个好的品牌的 聚酰胺层析板 自己手工铺板 会不会好? 多谢!第一次发贴,如有违规,请版主提醒~
在分离分析特别是蛋白质分离分析中,层析是相当重要、且相当常见的一种技术,其原理较为复杂,对人员的要求相对较高,这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。
http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/09/201209241756_392717_1927842_3.jpg纸层析实验开始了,今天先演练了一下,失败了几个,如图两个算是做成了的。左图是磷酸氢二钠,有图是三聚磷酸钠(分析纯,含量为55-60%),从层析图上看,磷酸氢二钠有一个规则的斑点,三聚磷酸钠有两个斑点,这算是分开了么?我想想觉得不对啊,怎么正磷酸根比三聚磷酸根跑的还慢?另外整个纸面都有一些小小的蓝色斑点,基线下面也有,啥情况?我的分析方法见另一个帖子http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120908/4231868/
上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代,首先是层析介质有了飞速的发展,各种人工合成的介质出现,如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现,极大地拓展了层析技术的应用领域和范围,基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。如Bio-Rad公司于上世纪50年初推出的分析级离子交换树脂AG系列,广泛用于各种分子物质的分离纯化,包括无机离子、有机酸、核酸以及糖类等。值得一提的是,上世纪4、50年代正是DNA、RNA研究如火如 荼的时期,而Bio-Rad推出的AG系列树脂在核酸纯化方面具有极其出色表现,受到众多研究人员的欢迎与好评。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734846.JPG_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734847.JPG_small.jpg Bio-Rad AG系列树脂 此外,因为马丁(Martin)和辛格(Synge)的钻研与畅想,他们的预言分别在1952年及20世纪60年代被人们所应证。而马丁(Martin)和辛格(Synge)两人也于1952年被授予诺贝尔化学奖。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734849.JPG_small.jpg Bio-Rad专家介绍:其中设想1“流动相可用气体代替液体,因为与液体相比,分离时候,物质间作用力更小,对分离也就更有好处”也就是气相色谱仪(GC),即以气体作为流动相的色谱法,1952年诞生,目前,该法已被广泛应用于分离和分析复杂的多组分混合物。特别是挥发性物质,我们都知道挥发性物质在实验或分离时会受到干扰,而气相色谱仪的产生给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变单。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734850.JPG_small.jpg 设想2“若能够使用非常细的颗粒填料,并在色谱柱两端施加较大的压差,从而增加了理论培板数,这将会大大提高分离效率。”也就是高效液相色谱HPLC,20世纪60年代末诞生,现在高效液相色谱HPLC已成为化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可少的工具。高效液相色谱的优点是:检测的分辨率和灵敏度高,分析速度快,重复性好,定量精度高,应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是:不能很好地兼容生物缓冲系统,因为HPLC系统通常采用不锈钢材质,因此具有良好的有机溶剂耐受性以及高压力承受。但是生物缓冲系统往往涉及到各种不同浓度的盐溶液,比如最常用的磷酸盐缓冲液等,而不锈钢系统不能耐受盐腐蚀,因此为了满足生物研究中样品的快速分析、分离,蛋白质快速层析技术应运而生。蛋白质快速液相层析(Fast Protein Liquid Chromatography),基于HPLC技术,但又有别于HPLC,它的主要液体接触部件均采用生物盐溶液耐受的塑料或者橡胶,这样能够极大地降低缓冲盐对系统的腐蚀,如Bio-Rad最早一代层析系统Biological LP,正是为了满足70-80年代间快速发展的生命科学领域内对未知组分、物质的分离、纯化的需求应运而生。在其诞生之初,风靡北美。下期,伯乐生命bio-rad专家将为大家带来21世纪层析法特点及先进层析系统,敬请关注!如今的色层分析法经常用于分析、分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义,但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734851.JPG_small.jpg 现在我们简称为色谱法、层析法或色谱技术、层析技术。
从来没做过柱层析的实验,这次有机会自己亲手做一次柱层析,哎呀,这个填装层析柱真是令我感触颇深啊。大家就听我慢慢道来我这填装层析柱的纠结过程吧……http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09503.gif这个装柱啊,那可有了学问了,那不是一般人能装的好的。就为这,我咨询了好几个有过装层析柱经验的同事,然后开始了我那悲催的装柱历程……第一根柱子,先给大家见个图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/07/201307261050_453809_2669029_3.jpg先跟大家说个事儿:我买的这种柱管,是带500ml储液球的,这是国标上要求的。它带着储液球的原因就是为了能够将洗脱液全部放入,不用分次放入,但是……其实根本用不到这样的,35g硅胶装出来的柱床其实很矮,口呢离着柱床很高,放入洗脱液的时候如果不小心,海砂和硅胶就会被冲起来http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09507.gif,这根柱子就算是废掉了,所以大家在选择层析柱管的时候千万根据条件好好挑选,不然的话,后果真的是不堪设想……下面开始装柱啦http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09502.gif:把硅胶称到烧杯里称好了,然后倒入洗脱液,咳咳咳咳……呛死了http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09512.gif,往里面一倒那洗脱液啊,就会有少许硅胶飞出来啊,烧杯里的硅胶冒着泡,用玻璃棒搅拌,并不时的敲敲烧杯,把气泡弄碎,把硅胶搅拌的均匀了,然后倒进柱管里。http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09503.gif哎呀,纠结的我呀!就怕硅胶不均匀,搅了又搅啊,终于是把硅胶倒进去了,沾得壁上哪都是,然后快速的用洗脱液去洗,气泡倒是不怎么有,但是硅胶装的平不平也是影响分离度的关键啊,结果我装的就是不平,人家都说用玻璃棒敲敲就平了,可是我左敲右敲就是没办法弄平,算了,今天只当练习了,就这么滴吧~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09506.gif然后就开始放洗脱液至硅胶面10cm左右,我放着放着突然想起来海砂还没称呐!!http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09507.gif就赶紧去称海砂4g,您别说,这海砂还真沉……等洗脱液放的差不多了,拧上活塞,倒入海砂,结果发现……这也太不平啦啊~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09504.gif都跑偏到哪去了啊……玻璃棒还是左敲右敲,没反应,唉,就这么滴吧~放洗脱液至与海砂面平齐,装的第一根试验柱算是悲悲催催完成……http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09509.gif下面是见图时间:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647361_2669029_3.jpg大家看见了吗?硅胶都歪到姥姥家去了~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09504.gifhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2013072409294410_01_2669029_3.jpg来个近点的~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09510.gifhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2013072409311536_01_2669029_3.jpg大家看见那个坑了吗?没装好造成的~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09508.gif最后给大家来个厉害的,就是我上面提到过的硅胶被洗脱液冲起来的现象。大家往下看http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09501.gif:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/07/201307261046_453806_2669029_3.jpg就是这样哒~悲剧不?所以选好柱管也是柱层析的一个关键啊~http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09509.gif好在我做了个预实验,不过这次很失败,下次继续……http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09504.gif
实验七 葡聚糖凝胶层析脱盐一. 目的学习凝胶层析的工作原理和操作方法掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术二. 原理凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。1. 层析介质的特点(1)遇水为不溶解的固相;(2)是化学惰性物质;(3)离子基团含量少;(4)颗粒大小和网眼均匀;(5)机械强度较强;(6)具有可选择的多种孔径。目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶(商品名称Sephadex)是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷( )交联成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比,可以获得网眼大小不同,型号各异的凝胶。当葡聚糖分子量越小,交联剂用量越大,则交联度越大,凝胶网眼越小,吸水量越小,G值也越小。G值表示每克干胶吸水量(mL)的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格,如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定(参见附录五)。2. 分离原理当混合样液加到凝胶柱上,随着洗脱剂而通过凝胶柱时,分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子,不能进入凝胶的网眼中,在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动,受到的阻滞作用小,移动速度快,先出层析柱(此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限);而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中,它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼,逐层扩散,阻滞作用大,流程长,移动速度慢,因而后出层析柱。在层析柱的出口处,我们用多个试管分步收集洗脱液,就可将混合物中各组分彼此分离。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后,常需要进行蛋白质的脱盐工作,我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25(或G-15、G-50),用适当的洗脱剂进行洗脱,经凝胶层析,就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。三. 实验材料及设备1. 材料含硫酸铵盐的蛋白质溶液(参见附注3)2. 器材层 析 柱:内径×柱高=1.0cm×25cm滴定台架、螺丝夹:各1刻度试管:10mL×14移 液 管:1mL×1烧 杯:250mL×1 50mL×1滴 管:2洗 耳 球:2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:各1四. 试剂的配制1. 葡聚糖凝胶G-25(或G-15、G-50)溶胀凝胶方法:按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中,加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶,重复3~4次。操作中避免剧烈搅拌,防止破坏其交联结构。2. BaCl2溶液(1%)3. 考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250,先溶于50mL95%乙醇中,再加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。4. 脲(6mol/L)5. 洗脱剂应依据被纯化的蛋白质的不同特性而选用不同的缓冲液。五. 操作步骤1. 层析柱的准备(1) 清洗:每组取一支层析柱,用清水冲洗干净。(若玻璃柱较脏,应卸去塑料装置,先入洗液中浸泡2小时。)(2) 安装与检查:检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱,让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处,放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂,打开出口螺旋夹,检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。(3) 排气泡:保持柱内一定的水位,用手指弹击柱壁,部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内,要想法排尽,否则会影响分离结果,排气完毕,保留柱内1~2cm高水位,关紧螺旋夹。(4) 标记高度:在距顶端8~10cm处做一标记,作为衡量灌装层析介质床体高度(15~17cm)的依据。2. 装柱每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25~30mL,静置片刻,观察凝胶沉淀与水的体积之比,约为1:1即可,否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶,用玻璃棒引流入柱,打开出水口,并不断地向柱内补充凝胶,直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止,凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜,都将影响分离效果。必要时,需倒出凝胶,重新装柱。3. 平衡取15mL洗脱剂,用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下,不可冲动胶平面,打开出水口,经洗脱液的流动,一方面清洗内壁,另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕,胶床上方保留约4cm高水位,关闭出水口。此时,胶床高度≥15cm为宜。4. 准备收集取6只干净的刻度试管(除净试管内残留的水),1~6编号,并在试管2mL处作一标记,插入试管架上,为收集洗脱样品作好准备。5. 上样与收集打开出口排水,当胶床与上方水层的弯月面相切时,关闭出口,用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入,勿冲动胶面。上样完毕,打开出水口,开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床,其弯月面与胶平面相切时,暂停排液,用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位,然后排液,至其弯月面与胶平面相切,再缓缓注入3~5cm高的洗脱剂。6. 洗脱不断向柱内加洗脱剂,保持胶床上水位3~5cm。出口流速控制在每6秒1滴,直至收集到6号管达2mL时,关闭出口。7. 鉴定另取6只干净试管,按收集顺序将洗脱液一分为二,即每管1mL,依次在试管架上排成二排。第一排每管加2滴BaCl2,根据白色沉淀多少,判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂,根据蓝色情况,判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中,仍有样品,表明洗脱和收集不够,需增加7号、8号……试管继续洗脱与收集,同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管 号项 目1234567891011白色沉淀量蓝色深浅8. 再生鉴定完毕,打开出水口,继续用2~3倍床体积洗脱剂洗脱,洗脱后关闭出口,以备下次使用。六. 结果处理1. 根据实验结果,在同一坐标系中,以收集的管号为横坐标,颜色深浅程度为纵坐标,绘制二条(蛋白质及(NH4)2SO4)洗脱曲线。2. 分析混合样品分离效果。七. 思考题1. 利用凝胶层析分离混合物时,怎样才能得到较好的分离效果?2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐?附注1. 凝胶的再生通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后,就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小,流速降低,凝胶污染杂质过多,甚至变色,需经再生后才可使用。再生方法有多种:如(1)用水进行逆向冲洗,再用洗脱剂平衡,便可重新使用。又如(2)把凝胶倒出,用6mol/L脲浸泡凝胶半小时,抽滤,再用水漂洗数次,除净脲,必要时重复上述操作即可重新使用。2. 凝胶的保存(1) 湿法保存,可保存几个月至一年,有多种方法: 加入防腐剂硫柳汞,使其浓度为0.005%,下次使用前,水洗除去硫柳汞。 加入几滴氯仿,摇匀存放。下次使用前用热水浴除去氯仿。(沸点60℃)。 凝胶保存在60~70%乙醇溶液中,即凝胶以部分收缩状态保存。(2) 干法保存此法操作不及湿法简便,但处理得好,凝胶存放时间长。先抽取过量水分,再向凝胶逐步加入百分浓度递增的乙醇溶液,每次停留一段时间,使凝胶逐步脱水,最后加入95%乙醇,凝胶脱手收缩。抽干,铺与搪瓷盆中,60~80℃经常翻动烘烤。若有结块,在下次膨胀时会散开的,不可用力敲碎,否则会破坏颗粒结构。3. 用盐析法分离提取麦清蛋白取10g小麦种子,粉碎。转入250mL具塞磨口锥形瓶中。加100mL蒸馏水,在康氏震荡器上震荡1小时。静置半小时,上清液以3000转/分钟离心15分钟。将上清液在布氏漏斗上(铺3~4层滤纸)抽滤。滤液应透明。用醋酸酸化滤液至pH4.7。加等体积的饱和硫酸铵溶液,边加边搅动,即有白色絮状沉淀生成。置冰箱过夜,使麦清蛋白全部盐析沉淀出来,以3000转/分钟离心20分钟,弃去上清夜,加10mL无离子水使沉淀溶解,即得麦清蛋白和硫酸铵的混合液。
层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography),它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱,并继续以石油醚淋洗,由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。如图3-1 所示: 当时这种方法并没引起人们的足够注意,直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物,人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要,层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论,以理论塔板来表示分离效率,定量的描述、评价层析分离过程。其次,他们根据液-液逆流萃取的原理,发明了液-液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言:一、流动相可用气体代替液体,与液体相比,物质间的作用力减小了,这对分离更有好处;二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差,应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数),这将会大大提高分离效率。前者预见了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]的产生,并在1952年诞生了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url],它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革;后者预见了高效液相色谱(HPLC)的产生,在60年代末也为人们所实现,现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。 层析法的最大特点是分离效率高,它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于大量物质的分离纯化制备。因此,作为一种重要的分析分离手段与方法,它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在,它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。层析的基本理论 层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同,使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如:我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异,使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同,达到彼此分离的目的。 对于一个层析柱来说,可作如下基本假设: 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的,而且层析柱由若干层组成。每层高度为H,称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据,一部分为流动相占据,且各塔板的流动相体积相等,称为板体积,以Vm表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡,且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数,与溶质在塔板的量无关。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程(即不连续过程)。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时,则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n = 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定,将连续的层析过程分解成了间歇的动作,这与多次萃取过程相似,一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。层析的基本概念1. 固定相: 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂,凝胶,离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解,交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2. 流动相: 在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等,都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂,薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3. 分配系数及迁移率(或比移值): 分配系数是指在一定的条件下,某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值,常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度,Cm: 流动相中的浓度。 迁移率(或比移值)是指:在一定条件下,在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。(Rf大于或等于1)可以看出:K增加,Rf减少;反之,会减少,Rf增加。 实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指:在一定条件下,在相同时间内,某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1,也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然,差异越大,分离效果越理想。 分配系数主要与下列因素有关:①被分离物质本身的性质;②固定相和流动相的性质;③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式: lnK = -(DG0/RT) 式中: K为分配系数(或平衡常数) DG0为标准自由能变化 R为气体常数 T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下,层析时组分的DG0为负值,则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20°C, K值下降一半,它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质,可通过改变温度的方法,增大K值之间的差异,达到分离的目的。 4. 分辨率(或分离度) 分辨率一般定义为:相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。图3-2 是计算分辨率的示意图。 分辨率: 由上式可见,Rs值越大,两种组分分离的越好。当Rs = 1时,两组分具有教好的分离,互相沾染约2%,即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时,两组分基本完全分开,每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时,尤其要求较高的分辨率。 为了提高分辨率Rs 的值,可采用以下方法: ⑴ 使理论塔板数N增大,则Rs上升。 ① 增加柱长,N可增大,可提高分离度,但它造成分离的时间加长,洗脱液体积增大,并使洗脱峰加宽,因此不是一种特别好的办法。 ② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸,并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm;而HPLC柱子的固定相颗粒为10mm以下,且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高,也使分离的效率大大提高了。 ③ 采用适当的流速,也可使理论塔板的高度降低,增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱,它有一个最佳的流速。特别是对于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url],流速影响相当大。 ⑵ 改变容量因子D(固定相与流动相中溶质量的分布比)。一般是加大D,但D的数值通常不超过10,再大对提高Rs不明显,反而使洗脱的时间延长,谱带加宽。一般D限制在1 £ D £ 10,最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温(一般降低温度),改变流动相的性质及组成(如改变pH值,离子强度,盐浓度,有机溶剂比例等),或改变固定相体积与流动相体积之比(如用细颗粒固定相,填充的紧密与均匀些),提高D值,使分离度增大。 ⑶ 增大a(分离因子,也称选择性因子,是两组分容量因子D之比),使Rs变大。实际上,使 a 增大,就是使两种组分的分配系数差值增大。同样,我们可以通过改变固定相的性质、组成,改变流动相的性质、组成,或者改变层析的温度,使 a 发生改变。应当指出的是,温度对分辨率的影响,是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高,理论塔板高度有时会降低,有时会升高,这要根据实际情况去选择。通常,a 的变化对Rs影响最明显。 总之,影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑,特别是对于生物大分子,我们还必须考虑它的稳定性,活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响,这是生化分离绝不能忽视的。否则,我们将不能得到预期的效果。5. 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性,因此,在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快,先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性,在这种层析过程中,极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说,分离纯化极性大的分子(带电离子等)采用正相色谱(或正相柱),而分离纯化极性小的有机分子(有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱(或反相柱)。
常用的层析分析方法coolautumn 在分离分析特别是蛋白质分离分析中,层析是相当重要、且相当常见的一种技术,其原理较为复杂,对人员的要求相对较高,这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。 二、 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。` 三、 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析,其原因是凝胶具有网状结构,小分子物质能进入其内部,而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 四、 亲和层析 亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中,特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合,产生复合物(E-S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是,前者进行反应时,配体(类似底物)是固相存在;后者进行反应时,底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M-L,或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此,当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰。然后,恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第M个层析峰(见图6-2)。显然,通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用。 上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外,还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比,前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料,以及氨基酸等),它成本低廉、具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 五、 聚焦层析 聚焦层析也是一种柱层析。因此,它和另外的层析一样,照例具有流动相,其流动相为 多缓冲剂,固定相为多缓冲交换剂。 聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 1、PH梯度溶液的形成 在离子交换层析中,PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如,当使用阴离子 剂进行层析时,制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是,在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液,而在另一室装低PH极限溶液,然后打开层析柱的下端出口,让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团,故PH梯度溶液可以自动形成。例如,当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时,先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg,再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体,这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人,住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间,从层析柱顶部到底部就形成了PH6~9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的,但是随着淋洗的进行,PH梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液的PH却由9逐渐降至6,并最后恒定于此值,这时层析柱的PH梯度也就消失了。 2.蛋白质的行为 蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。 不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。
各位大神,蛋白纯化时层析柱尺寸如何影响反相层析的规模和柱效的?请各位大神给详细介绍一下。
◆[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析 属于分配层析或吸附层析,仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物(如磨细的耐火砖)上覆盖一层高沸点液体,如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20%。分析时操作温度范围,一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析分离的区带十分清晰,是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡,所需分析时间大为缩短,一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果,因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析也能用于分离制备样品,但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。
我有一台102G[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url],层析室温度不能恒温,总是慢慢下降.不知何原因?其中电源和柱加热指示灯均亮.请各位师傅帮忙多谢
层析技术层析技术的应用与发展,对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素,分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究,发现除丹参酮Ⅰ为纯品外,Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法,迄今已发现15种单体(其中有4种为我国首次发现)。目前新的层析技术不断发展,随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用,层析技术已日趋完善。 一.层析法的基本原理:层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差(分配层析),组分对吸附剂吸附能力不同(吸附层析),和寓子交换,分子的大小(排阻层析)而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析,流动相为液体的称为液相层析。 一、 吸附层析法(AdsorptionChromatography) (一)吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系:液一固吸附层析是运用较多的一种方法,特别适用于很多中等分子量的样品(分子量小于1,000的低挥发性样品)的分离,尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 1. 吸附剂:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 (1) 硅胶:层析用硅胶为一多孔性物质,分子中具有硅氧烷的交链结构,同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分,因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17%,吸附力极弱不能用作为吸附剂,但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化,当硅胶加热至100~110℃时,硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时,硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键,从而丧失了因氢键吸附水分的活往,就不再有吸附剂的性质,虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行(一般在170cC以上即有少量结合水失去)。 硅胶是一种酸性吸附剂,适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,当遇到较强的碱注化台物,则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 (2)氧化铝:氧化铝可能带有碱性(因其中可混有碳酸钠等成分),对于分离一些碱性中草药成分,如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性,称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴,本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝,不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质,并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子,从而具有离于交换剂的性质,适合于酸性成分的层析,这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝,用于拄层析的,其粒度要求在100~160目之间。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶浓流速大慢,易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比,一般在1:20~50之间层析柱的内径与柱长比例在1:10-20之向。 在用溶剂冲洗柱时,流速不宜过快,洗脱液的流速一般以每半~1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量(克)相等为合适。 (3)活性炭:是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤,其次用乙醇洗,再以水洗净,于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭,最好选用颗粒活注炭,若为活性炭细粉,则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分,如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用,在水溶液中最强,在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱,而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时,则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别,可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开,单糖与多糖分开,氨基酸与多肽分开。 2.溶剂:层析过程中溶剂的选择,对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂(单一剂或混合溶剂)习惯上称洗脱剂,用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择,须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时,当被分离物质为弱极性物质,一般选用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离物质为强极性成分,则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂(如以硅藻土或滑石粉代替硅胶),则洗脱剂的极性亦须相应降低。 在柱层操作时,被分离样品在加样时可采用于法,亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的,以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程,称为“梯度洗脱”,使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀(梯度太大),就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力,有时可以用溶剂的介电常数(ε)来表示。介电常数高,洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂,如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂,如活性炭,则正好与上述顺序相反,在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用,较在脂溶性溶剂中为强。 3.被分离物质的性质:被分离的物质与吸附剂,洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素,彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下,各个成分的分离情况,直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言,成分的极性大,吸附住强。 当然,中草药成分的整体分子观是重要的,例如极性基团的数目愈多,被吸附的住能就会更大些,在同系物中碳原子数目少些,被吸附也会强些。总之,只要两个成分在结构上存在差别,就有可能分离,关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质,吸附剂的吸附强度,与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯,或虽含氧但非极性基团,则需选用吸附性较强的吸附剂,并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大,则需要选择吸附性能较弱的吸附剂(一般Ⅲ~Ⅳ级)。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增,或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外,能否获得满意的分离,还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物,象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时,使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱,油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 又如对于C-27甾体皂甙元类成分,能因其分字中羟基数目的多少而获得分离:将混合皂甙元溶于含有5%氯仿的苯中,加于氧化铝的吸附柱上,采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝,由于硅酸镁的吸附性较弱,洗脱剂的极牲需相应降低,亦即采用苯或含5%氯仿的苯,即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明,同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时,需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果,从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。
大家好,我想把0.1g的渣油(溶于四氢呋喃)准确加到层析柱上,因为样品比较粘,还容易拉丝。我用l四氢呋喃把渣油充分溶解后,再加入硅胶1)硅胶:渣油=2:1,搅拌混合后,冷风吹干,吸附样品的硅胶呈现黑褐色,但仍有一些大的硅胶颗粒(多个硅胶颗粒聚在一起,渣油本身粘附力较强可能是出现此现象的主要原因);2)硅胶:渣油=1.5:1,搅拌混合后,冷风吹干,吸附样品的硅胶呈现黑褐色,但样品中大的硅胶颗粒(多个硅胶颗粒聚在一起)数量多于硅胶:渣油=2:1时得到的样品。请问大家,硅胶:渣油=2:1时得到的样品(吸附了沥青后的硅胶)加入层析柱后,空隙较小,样品面相对平整,但样品层较厚,而硅胶:渣油=1.5:1时得到的样品加入层析柱后,空隙较大,样品面不平整,但样品层的高度相对较低! 不知道该选哪一种比例(硅胶:渣油)?请问各位有什么好的建议(除了湿法上样)?补充:今天下午试了试(硅胶:渣油=1.5:1),向柱子中加入了吸附有渣油的硅胶后,从外观上看,还算平整。但是加入淋洗液后,样品层收缩,样品层左右侧出现了空隙,导致出现沟流,色谱带重叠现象严重,分离效果极差。请问诸位该怎么解决呀?分析可能是加入的硅胶量太少,硅胶吸附样品的效果不是很好,但现在(硅胶:渣油=1.5:1)样品层已经比较厚了,请教各位该怎么办?
色谱层析和活性碳层析柱的区别
在一定的温度下,同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时.该物质在这两种介质中的浓度比是一常数.称分配系数。不同化学物质的分配系数不同。层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。其两种介质,一为固定不动,称固定相,另一为可相对流动,称流动相。 层析法已广泛应用在生物化学领域中,无论是少量分析还是大量制备,都能体现出它的高效性,简便性等特点。在实脸室中的常用层析法有:凝胶过滤,纸层析.薄层层析,离子交换层析,亲和层析,高效液相层析等。 以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤 凝胶过滤的别名很多,如凝皎扩散层析,分子筛层析,排阻层析等。这种技术具有操作简便,回收率高(近100%),条件缓和等特点,但它的分离操作速度较慢。该法常用于蛋白质,多糖,核酸的分离纯化。 凝胶过滤的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA,它包括填料的骨架体积VGM。,填料的孔体积Vi(内水体积)及填料颗粒间的体积VO(外水体积)。分布在填料的孔中的溶剂是固定相,分布的填料颗粒间的溶剂是流动相。填料颗粒含有许多不同大小的孔.如果待分离的物质分子大小合适,则可以不同程度地向孔中扩散,大分子物质只能占有较少的大孔,小分子则能占有大孔及另外一些小孔。所以当不同分子量物质的混合物流经凝胶柱时,较小的分子在柱中停留的时间比大分于停留的时间长,于是混合物中各组分即按分于大小分开,最先流出的是最大的分子。示意图如下所示,http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171831_251966_1638724_3.jpg用于生物材料分离的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex),聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio—Gel),琼脂糖凝胶(商品名Sepharose)等。如常用的交联葡聚糖是将葡聚糖(Dextran)悬浮于有机溶剂,加入交联剂表氯醇交联聚合而成多糖链的三维结构,这种聚合物为白色珠状微粒,是多孔性网状结构,凝胶的孔径大小与交联剂的量有关,交联剂多则交联度大,网状结构紧密,孔径小,反之交联剂少则孔径大。 将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。首先将样品小心自柱顶端加入,洗脱,以分步收集器收集洗脱液,测定每管物质浓度,然后以洗脱体积为横坐标,各物质浓度为纵坐标即得如下的洗脱曲线:由图可见最先流出的物质是,A,它的分子量最大,大于该种凝胶的排阻限(A物质分子的直径大于凝胶的孔径),完全不能进入颗粒内部,只能从颗粒间隙流过,称“全排阻”。其流经体积最小,与外水体积VO相等。最后流出的物质是C,它的分子量最小,小于该种凝胶的渗入限,其分子可以自由进出凝胶颗粒,这叫“全渗入”。流经体积是外水体积VO与内水体积Vi的和。而物质B的分子量介于排阻限与渗入限之间,其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中,不能全部地不受限制的通过,这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。它的流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分,即 Ve=VO+KdVi式中Kd称作“排阻系数”或“分配系数”。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。Kd=(Ve-VO)/Vi当Kd=1时,Ve=VO+Vi为全渗入。当Kd=0时,Ve=VO为全排阻。当0t,则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。这三种物质的分离过程可见示意图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171832_251967_1638724_3.jpgVi也可通过计算求出:Vi=aWra=凝胶千重Wi=每克干凝胶吸水毫升数Vt=Vo+Vi+VgVg=凝胶骨架体积Vt=可通过测定层析柱内径及高度计算得出:Vt=1/4D2h下表为交联葡聚糖凝胶的种类和规格:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171832_251968_1638724_3.jpg
薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板,也可用涤纶布等)上形成薄层,然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同,分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面,吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上,都可能发生吸附现象。 物质分子之所以能在固体表面停留,这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部,分子之间相互作用的力是对称的,其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的,向内的一面受到固体内部分子的作用力大,而表面层所受的作用力小,因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响,就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的,被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡,称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂,其主要原理是吸附力与分配系数的不同,使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时,带着样品中的各组分一起移动,同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同,以及吸附剂对它们的吸附能力的差异,最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开,则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定,同时也可以进一步采用某些方法加以定量。
今天收到层析纸了,第一次用这高级货,我看包装挺简陋的,就是一层油纸包着,有的地方已经破了,层析纸露在外面。我该怎么保存呢?怕吸潮之类的吗?好大的一捆不好找地方放啊1
如题:如何根据薄层层析结果来选择柱层析的流动相?主要是硅胶吸附柱层析或C18反相柱层析流动相的选择问题
本厂生产下列科研用硅胶系列产品,如有需求,敬请联系。(1)柱层层析硅胶【40~400目,粒度均匀、下料匀速通畅、阻力小、分离效果好、规格等级齐全,厂家直销,价格优惠】(2)薄层层析硅胶和高效薄层层析硅胶【H、G、GF254、HF254】(3)活化硅胶【30~60目,气体鉴定剂的载体,或用于分离提纯有机混合物中活性有效成分。是一种高纯、高活性硅胶】(4)啤酒硅胶【具有适宜的孔容、孔径和比表面积,易于吸附除去啤酒中的混浊的蛋白质和混浊的多酚聚合体,起到除杂质去异味的作用,提高啤酒的品质,延长啤酒的保质期和贮存期,有效地提高和保证成品啤酒的质量】(5)耐水硅胶【具有良好的耐水性、再生破碎率低和使用寿命长等优点】热诚欢迎广大用户咨询、订购,同时诚招各地代理商。
大家好,因为做有机实验需要用到层析柱,填充层析柱的药品分别为玻璃棉、硅胶和无水硫酸钠。国标上说装好的层析柱需要先后用二氯甲烷和正己烷进行冲洗和洗脱,现在不明白用二氯甲烷和正己烷冲洗和洗脱那些有机成分和杂质???望各位贤人异士能多多指教啊。。。。。
[font=宋体]蛋白纯化介质在研究目的蛋白的结构、功能以及相互作用过程中起着至关重要的作用。亲和层析法因其出色的选择性、结合力和分辨率,成为一种常用的蛋白和抗体纯化方法。义翘神州提供的多种亲和纯化介质,不仅简单易用,而且适用于批量操作或重力驱动的纯化过程。这些介质能够高效、便捷、可靠地分离蛋白和抗体,为下游应用提供了强有力的支持,确保实验结果的可靠性和重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法是利用生物大分子与特定分子间特异性、可逆结合的特性,实现生物大分子的分离。作为蛋白质分离的有效手段,通常仅需一步操作,即可获得高纯度的蛋白质。在亲和层析中,蛋白质的分离基于其与特定配体的特异性相互作用,而非共价结合的能力。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析,又称分子筛层析法,是一种独特的蛋白质分离和纯化技术。当样本流经葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶等介质时,这些介质根据蛋白质的大小和形状进行筛选。经过这一过程,目的蛋白得以纯化,为后续的下游应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析操作步骤:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在进行亲和层析时,需将蛋白在适宜的条件下加载至柱子上,确保蛋白(或标签)与其配体之间能够发生特异性结合。随后,通过洗涤步骤,清除与固定相发生非特异性结合的污染蛋白,同时保持蛋白与配体之间的特异性相互作用不受干扰。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来,采用含有竞争性分子的缓冲液进行洗脱,竞争性分子能够与配体结合,从而将目标蛋白从柱子上取代下来。这一步中,竞争分子通常会在后续的色谱流程或透析处理中予以去除。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过以上步骤,亲和层析成功实现了目标蛋白的纯化和分离,为后续的实验和应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情请关注:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font][font=Calibri] [/font]
请教:疏水层析和反相层析相比对蛋白质吸附能力较弱??原文大意如下——疏水等系和反相层析的原理都是利用疏水作用分离蛋白质、多肽的但是二者使用的介质和流动相有一定的差别其中疏水层析介质的极性反相层析介质的极性所以疏水层析的介质对于蛋白质的吸附能力较弱 可以使用温和的盐水就可以洗脱但是反相层级的介质极性较弱 需要更强的有机溶剂洗脱之【问题是——蛋白质应该是水溶性的啊? 应该是和极性更强的疏水层析介质接近 继而疏水层析介质对蛋白质的吸附能力更强?????????????????????】 [em0808]
想采购一些层析纸,我申请的是Whatman牌的,但是采购部说采购周期要6-8周,我等不了那么久啊。请问有哪些国产的牌子可以用的吗?我是想分离正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐这几种组分,要求不太高,能分开就行!请大家帮忙啊!
我现在想用簿层层析来提纯我的宝贵的产物,我曾经试过过柱子,可惜没达到我的目的,现在走途无路了,想用簿层层析来提纯。另外我的产物比较怕水,遇水很容易水解,我用的溶剂事先都除水了。 在这方面的高手,请帮我指教指教,要注意些什么问题,我先谢谢了!
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薄层层析是将吸附剂或者支持剂(有时加入固化剂)均匀地铺在一块玻璃上,形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上,然后用适宜的溶剂展开,使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定,也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 根据分离的原理不同,薄层层析可以分为两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析;用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层,属于分配薄层层析。 薄层层析中以吸附薄层为多用,吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。 吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。(较多用)TLC→{ 分配TLC→固定相为液态(水)→固定相吸苷在支持剂上。 (一)吸附薄层的基本原理: 吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同,及展开剂对它们的解吸附能力的不同,使各成分达到分离。 吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力,还受被吸附成分的性质影响,更与展开剂的性质有关。
诸位:本人现在分离南极某一细菌所产色素,用的培养基是陈海水,问题随之而来,经过提取浓缩后,蒸馏瓶中,含有色素和海水中盐类共存物。我层析用的是 正相硅胶 反相C18层析请问 诸位有没有遇到类似现像, 抑或是 来点建议的在提取时 或 层析时 怎样 才能 除掉 这些盐??谢谢