iCIEF-HRMS在线直连技术用于蛋白质药物电荷异质性分析
在整个制药行业中,重组单克隆抗体 (mAb) 为生物治疗产品在销售额和临床份额的快速增长起到了重要作用。最近,因为独特的治疗效果,复杂的蛋白质包括抗体-药物偶联物 (ADC)、双特异性抗体和融合蛋白等重新获得了科学家们的特别关注。在蛋白质药物的关键质量属性(critical quality attribute, CQA)评估过程中,电荷异质性需要对蛋白分子进行深入的结构表征,以确保其安全性、有效性和效力。此外,对电荷变异体的监测也是蛋白质药物质量控制(QC)中必要的步骤。目前,主要有两种检测蛋白质药物电荷变异体的方法:离子交换(IEX) 色谱和成像毛细管等电聚焦(iCIEF) 或 CIEF,两者传统上都使用 紫外(UV) 作为检测器。UV检测虽然具有良好的稳定性和灵敏度,但受限于其定性能力,无法对分离后的电荷变异体进行更深入的鉴定。为了分析电荷异构体的成因,必须进行准确的定性分析。高分辨率质谱(HRMS)是定性蛋白质分析的有力手段之一。然而,由于所用溶液体系的限制,传统上IEX 和 iCIEF 不能直接与质谱连接。鉴于iCIEF在蛋白质电荷变异体分析中具有分辨率高、通量高等优点,已经逐渐成为生物制药行业生产与质量控制阶段的金标准。因此,科学家们也在尝试各种将iCIEF与高分辨质谱直接连接的技术。其中一种方法是基于芯片的直连技术,然而该方法是使用化学试剂形成pH梯度,稳定性有所欠缺,且分辨率会下降;其他的直连方法在通量、稳定性以及与质谱离子源连接的便利性等方面均有不足。本文中所使用的CEInfinite (Advanced Electrophoresis Solution Ltd., AES) iCIEF平台,与该公司的专利卡柱和两性电解质配合使用,对mAb、ADC等分子的电荷变异体均可实现高分辨率分离,且兼具良好的稳定性。更为重要的是,所用溶液体系中无甲基纤维素、尿素等,两性电解质也与质谱兼容,这使得iCIEF与高分辨质谱在线直连测量电荷变异体完整蛋白分子量成为可能。该平台与质谱离子源部分连接简单,无需额外接口(图1),不同工作模式切换简便。